本發(fā)明涉及一種血漿蛋白，特別是adamts-13蛋白的液體制劑。

背景技術(shù)：

1、在蛋白質(zhì)藥物的開發(fā)過程中，如何開發(fā)一種高效的凍干制劑以確保低穩(wěn)定性蛋白質(zhì)具有足夠的儲存穩(wěn)定性是一個重要問題。在冷凍干燥過程開始之前，有必要將制劑以液態(tài)儲存一段時間。為了防止在這段時間內(nèi)質(zhì)量下降，即使在液體制劑中也必須在一定程度上確保穩(wěn)定性。

2、凍干制劑中使用的輔料根據(jù)材料的特性分為結(jié)晶和無定形兩類。結(jié)晶輔料在凍干制劑中充當膨松劑，為凍干粉餅提供機械強度，使粉餅更加堅固。典型的結(jié)晶輔料包括甘露醇和甘氨酸等。另一方面，無定形輔料可作為凍干制劑中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，與蛋白質(zhì)相鄰存在，起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用，使其免受冷凍干燥過程中產(chǎn)生的壓力影響。

3、同時，氯化鈉主要用于蛋白質(zhì)藥物制劑，根據(jù)添加濃度的不同，氯化鈉可能以無定形和結(jié)晶兩種形態(tài)存在。一般來說，據(jù)報道，當氯化鈉的添加濃度為150mm或以下時，它主要處于無定形狀態(tài)，而當它的添加濃度為200mm或以上時，它主要處于結(jié)晶狀態(tài)。

4、凍干制劑中的穩(wěn)定劑可以保護和穩(wěn)定蛋白質(zhì)，使其免受冷凍干燥過程中產(chǎn)生的壓力影響，還有助于蛋白質(zhì)在干燥完成后的儲存和重組過程中保持穩(wěn)定。因此，特別是在預(yù)期通過冷凍干燥法長期儲存的蛋白質(zhì)制劑中，從蛋白質(zhì)作為治療資源的價值和效用的角度來看，尋找最佳的穩(wěn)定劑成分和它們之間的最佳比例與發(fā)現(xiàn)新的藥理成分同樣重要。

5、本說明書通篇提到并引用了一些出版物和專利文件。為了更清楚地描述相關(guān)技術(shù)的現(xiàn)狀和本發(fā)明的內(nèi)容，所引用的出版物和專利文件的公開內(nèi)容通過引用的方式全部并入本文。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、技術(shù)問題

2、本發(fā)明人進行了深入的研究，開發(fā)了一種改良血漿蛋白穩(wěn)定性的液體制劑，所述血漿蛋白從血液中分離和純化后立即被污染和變性的風(fēng)險高，并且所述藥物制劑能夠長期保持血漿蛋白的物理性質(zhì)、生物活性和藥理作用，特別是在冷凍干燥過程中。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當制劑中含有0.2mg/ml至1.2mg/ml的血漿蛋白作為治療活性成分，并加入40mm至200mm的氨基酸穩(wěn)定劑，特別是精氨酸時，所述制劑在膠體穩(wěn)定性、冷藏穩(wěn)定性、抑制蛋白解聚、阻止蛋白聚集以及冷凍干燥后的粉餅外觀等各項指標上都表現(xiàn)出了非常突出的穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。

3、因此，本發(fā)明的目的是提供一種血漿蛋白的藥物制劑。

4、本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于預(yù)防或治療血栓性疾病的組合物。

5、本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點將從以下對本發(fā)明的具體實施方式、所附權(quán)利要求書和附圖中變得顯而易見。

6、技術(shù)方案

7、本發(fā)明的第一方面，提供了一種藥物制劑，包括0.2mg/ml至1.2mg/ml的血漿蛋白和40mm至200mm的氨基酸穩(wěn)定劑。

8、本發(fā)明人進行了深入的研究，開發(fā)了一種改良血漿蛋白穩(wěn)定性的液體藥物制劑，所述血漿蛋白從血液中分離和純化后立即被污染和變性的風(fēng)險高，并且所述藥物制劑能夠長期保持血漿蛋白的物理性質(zhì)、生物活性和藥理作用，特別是在冷凍干燥過程中。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當制劑中含有0.2mg/ml至1.2mg/ml的血漿蛋白作為治療活性成分，并加入40mm至20mm的氨基酸穩(wěn)定劑，特別是精氨酸時，所述制劑在膠體穩(wěn)定性、冷藏穩(wěn)定性、抑制蛋白解聚、阻止蛋白聚集以及冷凍干燥后的粉餅外觀等各項指標上都表現(xiàn)出了非常突出的穩(wěn)定性。

9、如本文所用，術(shù)語“血漿蛋白”是指存在于人類或動物血漿中的水溶性蛋白質(zhì)，包括血液中除白細胞和紅細胞所含蛋白質(zhì)以外的所有蛋白質(zhì)成分。血漿蛋白約占血漿總量的8％，負責(zé)止血(凝血酶原和纖維蛋白原)、激素運輸(血清白蛋白、脂蛋白等)和免疫作用(免疫球蛋白和補體蛋白)。血漿蛋白可通過本領(lǐng)域已知的各種分餾和純化方法獲得，但必須克服因長期儲存和環(huán)境變化而導(dǎo)致的化學(xué)和物理不穩(wěn)定性問題。物理不穩(wěn)定性涉及到不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)共價變化的修飾，即吸附、聚集和沉淀；化學(xué)不穩(wěn)定性涉及到脫氨基、消旋化、水解、氧化、β-消除和二硫化物交換等修飾。這些不穩(wěn)定性會導(dǎo)致內(nèi)在生物活性的改變和藥理作用的降低。

10、如本文所用，術(shù)語“穩(wěn)定劑”是指添加到藥物制劑中的任何添加劑，其作用是增加活性成分的穩(wěn)定性，防止活性成分任意變性、氧化、聚集、結(jié)晶或變性為相關(guān)物質(zhì)，從而防止活性成分的藥理活性喪失或降低。穩(wěn)定劑不受任何特別限制，只要是藥學(xué)上可接受的穩(wěn)定劑即可。術(shù)語“氨基酸穩(wěn)定劑”是指通過在藥物制劑中添加氨基酸作為主要成分或輔助成分，從而產(chǎn)生上述穩(wěn)定效果的穩(wěn)定劑。

11、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，氨基酸選自下組的至少一種：精氨酸(arg)、脯氨酸(pro)、和其藥學(xué)上可接受的鹽。

12、如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”包括從藥學(xué)上可接受的無機酸、有機酸或堿中提取的鹽。合適的酸的例子包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、馬來酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、甲苯對磺酸、酒石酸、乙酸、三氟乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。由合適的堿衍生出的鹽的例子包括堿金屬如鈉、堿土金屬如鎂、銨等的鹽。

13、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，本發(fā)明的制劑含有0.25mg/ml至1.0mg/ml血漿蛋白，較佳地為0.3mg/ml至0.7mg/ml血漿蛋白，更佳地為0.3mg/ml至0.4mg/ml血漿蛋白，最佳地約0.36mg/ml血漿蛋白。

14、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，本發(fā)明的制劑含有60mm至180mm氨基酸穩(wěn)定劑，較佳地為60mm至160mm氨基酸穩(wěn)定劑，更佳地為60mm至140mm氨基酸穩(wěn)定劑，更佳地為80mm至135mm氨基酸穩(wěn)定劑，更佳地為100mm至130mm氨基酸穩(wěn)定劑，最佳地約120mm氨基酸穩(wěn)定劑。

15、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，所述制劑進一步包含糖穩(wěn)定劑，其用量為所述制劑總體積的0-1.5w/v％。

16、較佳地，所述制劑進一步包含的糖穩(wěn)定劑的含量為0.2-1.5w/v％，更佳地為0.3-1.5w/v％，更佳地為0.5-1.5w/v％，更佳地為0.7-1.3w/v％，更佳地為0.9-1.1w/v％，最佳地約1w/v％。

17、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，所述糖選自下組：蔗糖、海藻糖、或其藥學(xué)上可接受的鹽，或其組合。

18、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，所述制劑進一步包含100mm至400mm的無機鹽。

19、如本文所用，術(shù)語“無機鹽”是指從不含c-h鍵的無機物中提取的鹽，它是由水溶液中陽離子和陰離子的離子組合構(gòu)成的鹽。可用于本發(fā)明的無機鹽的例子包括但不限于nacl、cacl2、kcl、mgcl2、及其組合。較佳地，本發(fā)明所述無機鹽是nacl和cacl2的混合物。

20、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，無機鹽中的nacl濃度為140mm至370mm，較佳地為180mm至340mm，更佳地為220mm至310mm，更佳地為260mm至300mm，最佳地約280mm。

21、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，無機鹽中cacl2的濃度為2mm至6mm，較佳地為3mm至5mm，最佳地約4mm。

22、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，本發(fā)明所述制劑含有10mm至30mm組氨酸，較佳地為15mm至25mm組氨酸，最佳地約20mm組氨酸。

23、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，所述制劑進一步包含非離子表面活性劑，其用量為所述制劑總體積的0.01-0.1v/v％。

24、如本文所用，術(shù)語“表面活性劑”是指一種可溶性化合物，用于增加疏水性材料的水溶性或增加具有不同疏水性的多種材料的相容性。術(shù)語“非離子表面活性劑”是指即使在水溶液中也不會解離的表面活性劑，因為其整個分子結(jié)構(gòu)不包含電離官能團或原子團。

25、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，本發(fā)明所述非離子表面活性劑選自下組：聚山梨酸酯80、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯40，或其組合；較佳地是聚山梨醇酯80。

26、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，本發(fā)明所述制劑包含0.03-0.08v/v％的非離子表面活性劑，較佳地約0.05v/v％的非離子表面活性劑。

27、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，本發(fā)明所述制劑所適用的血漿蛋白選自下組：adamts13(具有血栓蛋白1型基序的崩解素和金屬蛋白酶，成員13)蛋白、其變體、或其功能片段。

28、如本文所用，術(shù)語“功能片段”是指從全長蛋白質(zhì)中缺失一個或多個氨基酸殘基后產(chǎn)生的片段，其為保持全長蛋白質(zhì)的生物活性及功能的全長蛋白質(zhì)類似物。

29、在本發(fā)明中，seq?id?no:1是由1,427個氨基酸組成的adamts13蛋白的氨基酸序列。因此，本發(fā)明所述的adamts13變異蛋白或其功能片段是在全長(1,427氨基酸)adamts13蛋白中引入氨基酸突變的adamts13變異蛋白或其包括75-685氨基酸區(qū)的片段。例如，包含75-685a.a.區(qū)域的片段可以是1-685a.a.(685a.a)或75-685a.a.(611a.a)區(qū)域。

30、seq?id?no:1是adamts13蛋白的氨基酸序列，基本上包括adamts13蛋白的功能片段，它還包括與上述序列顯示基本同一性的氨基酸序列。如本文所用，術(shù)語“基本同一性”指的是當將氨基酸序列與任何其他序列對齊以便盡可能對應(yīng)，并使用本領(lǐng)域常用的算法分析對齊序列時，顯示至少70％的同源性，較佳地至少80％的同源性，更佳地至少90％的同源性，最佳地至少95％的同源性。

31、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，adamts13蛋白的變體包括至少一個氨基酸殘基的取代，所述氨基酸殘基選自以下位置的殘基：seq?id?no:1的85、93、126、135、278、282、308、314、317、334、364、376、413、427、452、465、567、578、585、589、607、608、609、612、618、624、630、635、643、650、651、654、655、656、658、664、672。

32、本發(fā)明人已經(jīng)確定了抗adamts13自身抗體所識別的核心區(qū)域，并發(fā)現(xiàn)當對這些區(qū)域中的某些氨基酸進行置換時，可以阻斷這些區(qū)域與自身抗體的結(jié)合，并保持其vwf降解活性和血栓形成抑制活性。因此，在上述位置發(fā)生突變的adamts13蛋白可作為一種有效的治療成分，用于治療由血栓形成過多引起的各種疾病，包括血栓性血小板減少性紫癜(ttp)。

33、如本文所用，術(shù)語“自身抗體”是指由個體自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體，其識別并靶向個體自身蛋白質(zhì)。自身抗體是一種免疫球蛋白，它包含至少一個與抗體表位結(jié)合并特異性識別抗原的可變結(jié)構(gòu)域。自身抗體的存在會導(dǎo)致被自身抗體特異性識別的蛋白質(zhì)的內(nèi)在功能或生物活性降解或喪失，從而引發(fā)各種疾病。

34、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，所述adamts13蛋白的變體選自下組的蛋白質(zhì)變體，所述變體蛋白在以下位置包含氨基酸殘基的取代：

35、位置85和317、位置612、位置282、465和672中的兩個或多個、位置635、位置452和612、位置278、334和427中的兩個或多個、位置618、位置135、位置126、567和651中的兩個或多個、位置413、位置334、位置314、位置93、364和376中的兩個或多個、位置308、位置656、位置607、位置612和624、位置589、位置650和656、位置643、位置585和658、位置630、654和664中的兩個或多個、位置589、608、609、624和655中的四個或多個、位置578、位置585、位置314和635、位置314和612。

36、具體地，所述氨基酸殘基的取代為選自下組的至少一個：位置85被phe取代、位置93被val取代、位置126被met取代、位置135被ile取代、位置278被ile取代、位置282被ala取代、位置308被lys取代、位置314被thr取代、位置317被his取代、位置334被thr或val取代、位置364被arg取代、位置376被asp取代、位置413被asp取代、位置427被asn取代、位置452被ile取代、位置465被asp取代、位置567被ser取代、位置578被leu取代、位置585被asn或met取代、位置589被gln取代、位置607被arg取代、位置608被met取代、位置609被leu取代、位置612被phe或tyr取代、位置618被ser取代、位置624被asp或cys取代、位置630被leu取代、位置635被val取代、位置643被phe取代、位置650被his取代、位置651被asp取代、位置654被gly取代、位置655被val取代、位置656被arg或his取代、位置658被his取代、位置664被asn取代、位置672被val取代。

37、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，本發(fā)明所述血漿蛋白與源自igg4免疫球蛋白的fc區(qū)域結(jié)合。

38、本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當將源自igg4免疫球蛋白的fc區(qū)域與本發(fā)明的adamts13變體蛋白結(jié)合時，在保持其固有的vwf裂解活性和中和抗體逃逸活性的同時，變體蛋白的體內(nèi)穩(wěn)定性大大提高，特別是在去除adamts13部分c端的開放式片段中呈現(xiàn)的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性顯著降低。

39、根據(jù)本發(fā)明的一個具體的實施例，所述fc區(qū)域包括至少一個氨基酸殘基的取代，所述氨基酸殘基選自以下位置的殘基：seq?id?no:2的22、24、26位殘基。具體地，所述氨基酸殘基的取代是選自下組的至少一個：位置22被tyr取代、位置24被thr取代、位置26被glu取代。

40、根據(jù)本發(fā)明，seq?id?no:2是源自igg4免疫球蛋白的fc區(qū)域(217a.a.)的氨基酸序列。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當將22、24和26位殘基分別被tyr、thr和glu取代的源自igg4免疫球蛋白的fc區(qū)[igg4(yte)]與上述adamts13變體蛋白、或其功能片段融合時，可最大限度地延長該蛋白的血液半衰期，并可在給藥后長時間維持其生理活性。

41、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，所述血漿蛋白與源自igg4免疫球蛋白的fc區(qū)域之間進一步包含源自igg1免疫球蛋白的一鉸鏈區(qū)。

42、根據(jù)本發(fā)明，源自igg1免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)可由seq?id?no:3(15a.a.)表示。

43、在本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于預(yù)防或治療血栓性疾病的組合物，所述組合物包括本發(fā)明上述作為活性成分的藥物制劑，所述藥物制劑含有作為血漿蛋白的adamts13蛋白、其變體或其功能片段。

44、如本文所用，術(shù)語“血栓性疾病”是指由于血小板在血管微循環(huán)系統(tǒng)中聚集產(chǎn)生血栓而導(dǎo)致血流減少或阻塞，從而引起腎臟、心臟和大腦等器官缺血性損傷的一種全身性疾病。

45、如果adamts13酶的活性受到中和抗體的抑制，不能正常降解willebrand因子(vwf)，就會出現(xiàn)血小板過度聚集和血栓過度形成。因此，本發(fā)明的adamts13變體蛋白可以高效地逃避中和抗體，同時保持或提高其降解vwf的活性，可作為各種血栓性疾病的有效預(yù)防或治療成分。

46、如本文所用，術(shù)語“預(yù)防”是指抑制尚未被診斷出患有某種紊亂或疾病但有可能患上該紊亂或疾病的受試者發(fā)生該紊亂或疾病。

47、如本文所用，術(shù)語“治療”是指：(a)抑制紊亂、疾病或病癥的發(fā)展；(b)減輕紊亂、疾病或病癥；或(c)消除紊亂、疾病或病癥。當本發(fā)明的組合物給受試者施用時，無論是否存在中和抗體，它都能特異性地識別和降解vwf，從而阻斷血凝塊的形成，從而抑制血栓性疾病的發(fā)展，或消除或減輕血栓性疾病。因此，本發(fā)明的組合物本身可以是治療這些疾病的組合物，也可以作為治療輔助劑與其他藥理成分聯(lián)合用于治療上述疾病。因此，如本文所用，術(shù)語“治療”或“治療劑”包括“治療輔助劑”或“治療佐劑”的含義。

48、如本文所用，術(shù)語“給藥”或“施用”是指將治療有效量的本發(fā)明組合物直接給藥給受試者，從而在受試者體內(nèi)形成相同量的本發(fā)明組合物。

49、如本文所用，術(shù)語“治療有效量”是指藥物組合物的含量足以使組合物中所含藥理成分對要施用組合物的受試者產(chǎn)生治療或預(yù)防作用，因此也包括“預(yù)防有效量”。

50、如本文所用，術(shù)語“受試者”包括但不限于人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、貓、馬、牛、豬、猴、黑猩猩、狒狒或恒河猴。較佳地，本發(fā)明的受試者是人。

51、根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例，血栓性疾病是血栓性微血管病(tma)。具體地，血栓性微血管病選自下組：血小板減少性紫癜(ttp)、溶血性尿毒綜合征(hus)、hellp(溶血、肝酶升高、血小板計數(shù)偏低)、子癇前期和鐮狀細胞病組成的組。較佳地，血栓性微血管病為血小板減少性紫癜或鐮狀細胞病。最佳地，血栓性微血管病為血小板減少性紫癜。

52、在本發(fā)明的另一方面，提供了一種預(yù)防或治療血栓性疾病的方法，所述方法包括向受試者施用本發(fā)明的上述藥物制劑，所述藥物制劑包括作為血漿蛋白的adamts13蛋白、其變體或其功能片段。

53、由于本發(fā)明中使用的血漿蛋白、用于配制血漿蛋白的成分以及可預(yù)防或治療的血栓性疾病如上所述，為避免過多重疊，在此從略。

54、優(yōu)勢效果

55、本發(fā)明的特點和優(yōu)點概述如下：

56、(a)本發(fā)明提供了一種血漿蛋白，特別是adamts-13蛋白的藥物制劑，以及由其組成的用于預(yù)防或治療血栓性疾病的組合物。

57、(b)本發(fā)明的藥物制劑顯著提高了血漿蛋白的穩(wěn)定性，血漿蛋白在從血液中分離純化后立即被污染和變性的風(fēng)險很高，因此在長期儲存過程中其藥理活性和質(zhì)量會下降，特別是能夠?qū)⒀獫{蛋白的膠體穩(wěn)定性、冷藏穩(wěn)定性、純度和抑制聚集性保持在較高水平，并使冷凍干燥后的粉餅外觀能夠長時間保持良好。因此，本發(fā)明的藥物制劑可以很好地用于長期保存和儲存adamts-13蛋白，而不會損失該蛋白的治療有效量，adamts-13蛋白是用于各種血栓性疾病的重要治療資源。