發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及比蘇卡林(bisucaberins)、去鐵胺及其類(lèi)似物的單體的生物技術(shù)生產(chǎn)。具體地，本發(fā)明涉及能夠生物技術(shù)生產(chǎn)n5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸、n-羥基-n-琥珀酰腐胺以及由此的化合物的重組細(xì)胞。

背景技術(shù)：

0、發(fā)明背景

1、去鐵胺、比蘇卡林和其它基于n-羥基-n-琥珀酰戊二胺的大環(huán)鐵載體因其在各種疾病例如癌癥、繼發(fā)性鐵過(guò)載等等的治療中的用途而在幾個(gè)行業(yè)中眾所周知。這些基于n-羥基-n-琥珀酰二胺的大環(huán)鐵載體通過(guò)專(zhuān)門(mén)的生物合成途徑由單體例如n-羥基-n-琥珀酰尸胺和n-羥基-n-琥珀酰腐胺生產(chǎn)，所述途徑需要四種酶促活性并從l-賴(lài)氨酸開(kāi)始。

2、基于n-羥基-n-琥珀酰二胺的大環(huán)鐵載體，例如去鐵胺b、h、e、x1、x2、比蘇卡林(bisucaberin)、比蘇卡林b(bisucaberin?b)等等，目前通過(guò)細(xì)菌毛鏈霉菌(streptomycespilosus)(毛鏈霉菌(s.pilosus))和其它放線(xiàn)菌屬(actinomycetes)從賴(lài)氨酸開(kāi)始生產(chǎn)。特別地，這些基于n-羥基-n-琥珀酰二胺的大環(huán)鐵載體以及單體n-羥基-n-琥珀酰尸胺和n-羥基-n-琥珀酰腐胺(這些基于n-羥基-n-琥珀酰二胺的大環(huán)鐵載體由其寡聚化并然后大環(huán)化)通過(guò)專(zhuān)門(mén)的生物合成途徑產(chǎn)生，所述途徑需要四種酶促活性并從l-賴(lài)氨酸開(kāi)始。

3、占優(yōu)勢(shì)地用于這些制藥應(yīng)用中的基于n-羥基-n-琥珀酰二胺的大環(huán)鐵載體以及單體n-羥基-n-琥珀酰尸胺和n-羥基-n-琥珀酰腐胺，當(dāng)今唯一地通過(guò)使用野生型鏈霉菌屬(streptomyces)菌株(例如毛鏈霉菌和微小鏈霉菌(s.parvulus))的發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)。除其它問(wèn)題之外，這種方法還具有許多缺點(diǎn)。

4、即，目前的生產(chǎn)方法具有較低的生產(chǎn)性能特性，例如生物質(zhì)比生產(chǎn)率qp、體積生產(chǎn)率qp、底物上的產(chǎn)物產(chǎn)率yx/s和產(chǎn)物濃度。這導(dǎo)致高制造成本。進(jìn)一步地，因?yàn)榛趎-羥基-n-琥珀酰二胺的大環(huán)鐵載體以及單體n-羥基-n-琥珀酰尸胺和n-羥基-n-琥珀酰腐胺使用野生型鏈霉菌屬菌株的簡(jiǎn)單發(fā)酵過(guò)程形成，所以在產(chǎn)生的發(fā)酵液中存在很多副產(chǎn)物。鏈霉菌屬物種是許多次級(jí)代謝產(chǎn)物包括抗生素的有力生產(chǎn)者，所述次級(jí)代謝產(chǎn)物需要通過(guò)費(fèi)力且昂貴的精制步驟與所需的靶化合物分開(kāi)。另外，由于鏈霉菌屬物種的復(fù)雜生長(zhǎng)要求，野生型鏈霉菌屬菌株通常需要復(fù)雜且昂貴的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，導(dǎo)致由于復(fù)雜培養(yǎng)基組分的分批間變動(dòng)的弱重現(xiàn)性。

5、進(jìn)一步地，使用賴(lài)氨酸作為生產(chǎn)的主要碳底物也使得形成基于n-羥基-n-琥珀酰二胺的大環(huán)鐵載體以及單體n-羥基-n-琥珀酰尸胺和n-羥基-n-琥珀酰腐胺的過(guò)程不靈活且昂貴。

6、雖然對(duì)于制藥應(yīng)用，高制造成本可能是可接受的，但這些成本對(duì)于其它應(yīng)用例如化妝品和技術(shù)(例如除銹)領(lǐng)域是不期望的。因此，將基于n-羥基-n-琥珀酰二胺的大環(huán)鐵載體以及單體n-羥基-n-琥珀酰尸胺和n-羥基-n-琥珀酰腐胺的生物合成轉(zhuǎn)移到充分表征的微生物生產(chǎn)菌株是高度期望的。相應(yīng)地，本領(lǐng)域需要更有效且實(shí)惠的生物合成基于n-羥基-n-琥珀酰二胺的大環(huán)鐵載體以及單體n-羥基-n-琥珀酰尸胺和n-羥基-n-琥珀酰腐胺的手段。

7、發(fā)明描述

8、本發(fā)明嘗試通過(guò)提供使用已建立的微生物平臺(tái)來(lái)生產(chǎn)基于n-羥基-n-琥珀酰二胺的大環(huán)鐵載體以及其單體n-羥基-n-琥珀酰尸胺和n-羥基-n-琥珀酰腐胺的生物技術(shù)手段來(lái)解決上述問(wèn)題。使用已建立的微生物平臺(tái)來(lái)生產(chǎn)至少一種基于n-羥基-n-琥珀酰二胺的大環(huán)鐵載體以及單體n-羥基-n-琥珀酰尸胺和n-羥基-n-琥珀酰腐胺不僅增加了從原材料生產(chǎn)的靶產(chǎn)物的量，而且降低了所形成的副產(chǎn)物的量。另外，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的遺傳修飾的細(xì)胞具有非致病性和易于培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)。這使得細(xì)胞對(duì)于生產(chǎn)是更安全的，并且還保持成本更低，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)室中的生產(chǎn)過(guò)程中以及基于n-羥基-n-琥珀酰二胺的大環(huán)鐵載體以及其單體n-羥基-n-琥珀酰尸胺和n-羥基-n-琥珀酰腐胺的使用方面不需要專(zhuān)門(mén)的安全性要求。使用根據(jù)本發(fā)明的任何方面的重組細(xì)胞，還增加了基于n-羥基-n-琥珀酰二胺的大環(huán)鐵載體以及單體n-羥基-n-琥珀酰尸胺和n-羥基-n-琥珀酰腐胺的生產(chǎn)效率。另外，能夠整合將碳源轉(zhuǎn)換為至少一種基于n-羥基-n-琥珀酰二胺的大環(huán)鐵載體以及其單體n-羥基-n-琥珀酰尸胺和n-羥基-n-琥珀酰腐胺的整體手段的微生物平臺(tái)的使用，使得轉(zhuǎn)換過(guò)程更簡(jiǎn)單，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)換中僅涉及少數(shù)工藝步驟。還去除了鏈霉菌屬菌株用于生產(chǎn)基于n-羥基-n-琥珀酰二胺的大環(huán)鐵載體以及單體n-羥基-n-琥珀酰尸胺和n-羥基-n-琥珀酰腐胺的依賴(lài)。根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞具有能夠使用各種碳底物來(lái)生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的任何方面的基于n-羥基-n-琥珀酰二胺的大環(huán)鐵載體以及單體n-羥基-n-琥珀酰尸胺和n-羥基-n-琥珀酰腐胺的進(jìn)一步優(yōu)點(diǎn)。例如，簡(jiǎn)單的碳例如葡萄糖可以用作碳底物。

9、根據(jù)本發(fā)明的任何方面使用的細(xì)胞產(chǎn)生包括以下的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

10、-更高的生產(chǎn)性能特性，例如生物質(zhì)比生產(chǎn)率qp、體積生產(chǎn)率qp、底物上的產(chǎn)物產(chǎn)率yx/s和產(chǎn)物濃度，導(dǎo)致更低的制造成本；

11、-發(fā)酵液中的副產(chǎn)物的更低多樣性和/或濃度或不存在簡(jiǎn)化了精制策略，導(dǎo)致更低的制造成本；和

12、-成分確定的最小發(fā)酵培養(yǎng)基的適用性，導(dǎo)致更低的制造成本和更佳的重現(xiàn)性。

13、根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于從至少一種簡(jiǎn)單碳源產(chǎn)生至少一種式i的化合物的重組微生物細(xì)胞：

14、

15、其中n是1或2

16、其中所述簡(jiǎn)單碳源選自葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘油及其組合，并且其中所述細(xì)胞包含進(jìn)一步的遺傳修飾，以增加從至少一種簡(jiǎn)單碳源的l-賴(lài)氨酸產(chǎn)生。

17、在一個(gè)實(shí)例中，n是2并且所產(chǎn)生的化合物是n-羥基-n-琥珀酰尸胺，也稱(chēng)為n5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸。在另一個(gè)實(shí)例中，n是2并且所產(chǎn)生的化合物是n-羥基-n-琥珀酰腐胺。在另一個(gè)實(shí)例中，通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞在混合物中產(chǎn)生化合物n5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸和n-羥基-n-琥珀酰腐胺兩者。

18、特別地，n是2并且所產(chǎn)生的化合物是n-羥基-n-琥珀酰尸胺，也稱(chēng)為n5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸。

19、如本文使用的，術(shù)語(yǔ)‘重組體’指這樣的分子或者由此類(lèi)分子編碼，特別是多肽或核酸，其像這樣并非天然存在的，而是遺傳改造的結(jié)果，或者指包含重組分子的細(xì)胞。例如，如果核酸分子包含與編碼催化活性多肽的序列在功能上連接的啟動(dòng)子，并且啟動(dòng)子已這樣進(jìn)行改造，使得催化活性多肽相對(duì)于包含原始未改變的核酸分子的相應(yīng)野生型細(xì)胞中的多肽水平是過(guò)表達(dá)的，則所述核酸分子是重組體。此外，術(shù)語(yǔ)“重組dna”指這樣的核酸序列，其并非天然存在的，或者已通過(guò)兩個(gè)否則分開(kāi)的核酸序列區(qū)段的人工組合，即通過(guò)將通常并非連續(xù)的dna小片連接在一起進(jìn)行制備?！爸亟M產(chǎn)生的”意指經(jīng)常通過(guò)化學(xué)合成手段或通過(guò)分離的核酸區(qū)段的人工操作來(lái)實(shí)現(xiàn)的人工組合，例如通過(guò)使用限制性酶、連接酶和類(lèi)似重組技術(shù)的遺傳改造技術(shù)，如例如通過(guò)sambrook等人，molecular?cloning，第二版，coldspring?harbor?laboratory，plainview，n.y.；(1989)，或者ausubel等人，currentprotocols?in?molecular?biology，current?protocols(1989)以及dna?cloning:apractical?approach，第i和ii卷(編輯d.n.glover)irel?press，oxford,(1985)描述的。在另一個(gè)實(shí)例中，如果細(xì)胞已進(jìn)行修飾，特別是已經(jīng)歷遺傳改造并且是非天然存在的細(xì)胞，則細(xì)胞是重組體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“重組細(xì)胞”指已進(jìn)行遺傳修飾，以包含編碼至少一種異源蛋白質(zhì)例如酶的至少一種異源基因的細(xì)胞。重組細(xì)胞可以表達(dá)異源蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可以參與代謝途徑用于產(chǎn)生期望的代謝產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)例中，‘重組細(xì)胞’指已經(jīng)表達(dá)特異性酶的細(xì)胞，并且酶的表達(dá)使用遺傳改造進(jìn)行修飾。在這個(gè)實(shí)例中，使用本領(lǐng)域已知的方法對(duì)內(nèi)源表達(dá)的基因進(jìn)行遺傳修飾，以增加或減少基因的表達(dá)。示例性細(xì)胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。示例性原核細(xì)胞包括細(xì)菌，例如谷氨酸棒狀桿菌(c.glutamicum)，例如遺傳修飾的谷氨酸棒狀桿菌。

20、根據(jù)本發(fā)明的任何方面使用的重組微生物細(xì)胞可以是原核生物或真核生物。這些細(xì)胞是分離的細(xì)胞。這些可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如來(lái)自人類(lèi)的細(xì)胞)、植物細(xì)胞或者微生物例如酵母、真菌或細(xì)菌，其中微生物特別是細(xì)菌和酵母是優(yōu)選的。

21、合適的細(xì)菌、酵母或真菌特別是作為細(xì)菌、酵母或真菌菌株保藏于deutschesammlung?von?mikroorganismen?und?zellkulturen(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(german?collection?of?microorganisms?and?cell?cultures))gmbh(dsmz)，brunswick，德國(guó)的那些細(xì)菌、酵母或真菌。根據(jù)本發(fā)明適合的細(xì)菌屬于以下列出的屬：

22、-http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm，

23、根據(jù)本發(fā)明適合的酵母屬于以下列出的那些屬：

24、-http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm

25、并且根據(jù)本發(fā)明適合的真菌是以下列出的那些屬：

26、-http://www.dsmz.de/species/fungi.htm。

27、特別地，細(xì)胞可以選自曲霉屬(aspergillus)、棒狀桿菌屬(corynebacterium)、短桿菌屬(brevibacterium)、芽孢桿菌屬(bacillus)、不動(dòng)桿菌屬(acinetobacter)、產(chǎn)堿桿菌屬(alcaligenes)、乳桿菌屬(lactobacillus)、副球菌屬(paracoccus)、乳球菌屬(lactococcus)、假絲酵母屬(candida)、畢赤酵母屬(pichia)、漢遜酵母屬(hansenula)、克魯維酵母屬(kluyveromyces)、酵母菌屬(saccharomyces)、埃希氏菌屬(escherichia)、發(fā)酵單胞菌屬(zymomonas)、耶氏酵母屬(yarrowia)、甲基桿菌屬(methylobacterium)、羅爾斯通氏菌屬(ralstonia)、假單胞菌屬(pseudomonas)、紅螺菌屬(rhodospirillum)、紅細(xì)菌屬(rhodobacter)、伯克霍爾德氏菌屬(burkholderia)、梭菌屬(clostridium)和貪銅菌屬(cupriavidus)。更特別地，細(xì)胞可以選自構(gòu)巢曲霉(aspergillus?nidulans)、黑曲霉(aspergillus?niger)、肥大產(chǎn)堿菌(alcaligenes?latus)、巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)、枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)、黃色短桿菌(brevibacteriumflavum)、乳糖發(fā)酵短桿菌(brevibacterium?lactofermentum)、須芒草伯克霍爾德氏菌(burkholderia?andropogonis)、b.brasilensis、b.caledonica、b.caribensis、石竹伯克霍爾德氏菌(b.caryophylli)、真菌伯克霍爾德氏菌(b.?fungorum)、唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(b.gladioli)、格氏伯克霍爾德氏菌(b.glathei)、穎殼伯克霍爾德氏菌(b.glumae)、禾伯克霍爾德氏菌(b.graminis)、醫(yī)院伯克霍爾德氏菌(b.hospita)、久留里伯克霍爾德氏菌(b.kururiensis)、吩嗪伯克霍爾德氏菌(b.phenazinium)、結(jié)瘤伯克霍爾德氏菌(b.phymatum)、b.phytofirmans、植物伯克霍爾德氏菌(b.plantarii)、蔗糖伯克霍爾德氏菌(b.sacchari)、b.singaporensis、b.sordidicola、b.terricola、熱帶伯克霍爾德氏菌(b.tropica)、根瘤伯克霍爾德氏菌(b.tuberum)、烏汶伯克霍爾德氏菌(b.ubonensis)、烏拉姆伯克霍爾德氏菌(b.unamae)、b.xenovorans、b.anthina、吡咯菌素伯克霍爾德氏菌(b.pyrrocinia)、泰國(guó)伯克霍爾德氏菌(b.thailandensis)、布蘭克假絲酵母(candidablankii)、皺褶假絲酵母(candida?rugosa)、谷氨酸棒狀桿菌、高效棒狀桿菌(corynebacterium?efficiens)、大腸桿菌、多形漢遜酵母(hansenula?polymorpha)、乳酸克魯維酵母(kluveromyces?lactis)、扭脫甲基桿菌(methylobacterium?extorquens)、善變副球菌(paracoccus?versutus)、阿根廷假單胞菌(pseudomonas?argentinensis)、爛泥假單胞菌(p.borbori)、香茅醇假單胞菌(p.citronellolis)、變黃假單胞菌(p.flavescens)、門(mén)多薩假單胞菌(p.mendocina)、硝基還原假單胞菌(p.nitroreducens)、食油假單胞菌(p.oleovorans)、假產(chǎn)堿假單胞菌(p.pseudoalcaligenes)、食樹(shù)脂假單胞菌(p.resinovorans)、稻草假單胞菌(p.straminea)、桔黃假單胞菌(p.aurantiaca)、致黃假單胞菌(p.aureofaciens)、綠針假單胞菌(p.chlororaphis)、莓實(shí)假單胞菌(p.?fragi)、隆德假單胞菌(p.lundensis)、腐臭假單胞菌(p.taetrolens)、南極假單胞菌(p.antarctica)、產(chǎn)氮假單胞菌(p.azotoformans)、'p.blatchfordae'、油菜假單胞菌(p.brassicacearum)、布氏假單胞菌(p.brenneri)、松柏假單胞菌(p.cedrina)、皺紋假單胞菌(p.corrugata)、熒光假單胞菌(p.fluorescens)、蓋氏假單胞菌(p.gessardii)、黎巴嫩假單胞菌(p.libanensis)、孟氏假單胞菌(p.mandelii)、邊緣假單胞菌(p.marginalis)、地中海假單胞菌(p.mediterranea)、子午線(xiàn)假單胞菌(p.meridiana)、米氏假單胞菌(p.migulae)、霉味假單胞菌(p.mucidolens)、東方假單胞菌(p.orientalis)、人參假單胞菌(p.panacis)、解朊假單胞菌(p.proteolytica)、羅氏假單胞菌(p.rhodesiae)、類(lèi)黃假單胞菌(p.synxantha)、賽維瓦爾假單胞菌(p.thivervalensis)、托拉斯假單胞菌(p.tolaasii)、維羅納假單胞菌(p.veronii)、脫氮假單胞菌(p.denitrificans)、穿孔素假單胞菌(p.pertucinogena)、乳脂色假單胞菌(p.cremoricolorata)、黃褐假單胞菌(p.fulva)、蒙氏假單胞菌(p.monteilii)、摩氏假單胞菌(p.mosselii)、副黃假單胞菌(p.parafulva)、惡臭假單胞菌(p.putida)、巴利阿里假單胞菌(p.balearica)、施氏假單胞菌(p.stutzeri)、扁桃假單胞菌(p.amygdali)、榛色假單胞菌(p.avellanae)、卡氏假單胞菌(p.caricapapayae)、菊苣假單胞菌(p.cichorii)、p.coronafaciens、無(wú)花果假單胞菌(p.ficuserectae)、'p.helianthi'、p.meliae、薩瓦斯坦假單胞菌(p.savastanoi)、丁香假單胞菌(p.syringae)、番茄假單胞菌(p.tomato)、淺綠黃假單胞菌(p.viridiflava)、嗜松香假單胞菌(p.abietaniphila)、p.acidophila、傘菌假單胞菌(p.agarici)、嗜堿假單胞菌(p.alcaliphila)、解堿假單胞菌(p.alkanolytica)、多支淀粉假單胞菌(p.amyloderamosa)、鐵角蕨假單胞菌(p.asplenii)、固氮假單胞菌(p.azotifigens)、大麻假單胞菌(p.cannabina)、p.coenobios、結(jié)冰假單胞菌(p.congelans)、康氏假單胞菌(p.costantinii)、p.cruciviae、p.delhiensis、p.excibis、遠(yuǎn)東假單胞菌(p.extremorientalis)、弗雷德里克斯堡假單胞菌(p.frederiksbergensis)、褐鞘假單胞菌(p.fuscovaginae)、石花菜假單胞菌(p.gelidicola)、格氏假單胞菌(p.grimontii)、印度假單胞菌(p.indica)、杰氏假單胞菌(p.jessenii)、晉州假單胞菌(p.jinjuensis)、基爾假單胞菌(p.kilonensis)、克氏假單胞菌(p.knackmussii)、韓國(guó)假單胞菌(p.koreensis)、亞麻假單胞菌(p.lini)、黃色假單胞菌(p.lutea)、摩拉維亞假單胞菌(p.moraviensis)、耳炎假單胞菌(p.otitidis)、海綿假單胞菌(p.pachastrellae)、帕勒隆尼氏假單胞菌(p.palleroniana)、p.papaveris、爛泥假單胞菌(p.peli)、p.perolens、草假單胞菌(p.poae)、p.pohangensis、嗜冷假單胞菌(p.psychrophila)、耐冷假單胞菌(p.psychrotolerans)、p.rathonis、食爬蟲(chóng)假單胞菌(p.reptilivora)、p.resiniphila、根際假單胞菌(p.rhizosphaerae)、紅假單胞菌(p.rubescens)、薩氏假單胞菌(p.salomonii)、p.segitis、敗血假單胞菌(p.septica)、猴假單胞菌(p.simiae)、豬假單胞菌(p.suis)、耐熱假單胞菌(p.thermotolerans)、銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)、山黃麻假單胞菌(p.tremae)、平凡假單胞菌(p.trivialis)、p.turbinellae、p.tuticorinensis、陰城假單胞菌(p.umsongensis)、溫哥華假單胞菌(p.vancouverensis)、弗村假單胞菌(p.vranovensis)、黃色海假單胞菌(p.xanthomarina)、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(ralstoniaeutropha)、深紅紅螺菌(rhodospirillum?rubrum)、類(lèi)球紅細(xì)菌(rhodobactersphaeroides)、釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)、需鈉弧菌(vibrio?natrigens)、解脂耶氏酵母(yarrowia?lipolytica)和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(zymomonas?mobile)。更特別地，細(xì)胞可以是選自以下屬的細(xì)菌細(xì)胞：假單胞菌屬、藍(lán)藻屬(cyanobacteria)、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、沙門(mén)氏菌屬(salmonella)、根瘤菌屬(rhizobium)、弧菌屬(vibrio)、酵母菌屬、耶氏酵母屬、曲霉屬、木霉屬(trichoderma)、小球藻屬(chlorella)、念珠藻屬(nostoc)和埃希氏菌屬。甚至更特別地，細(xì)胞可以選自惡臭假單胞菌、大腸桿菌、泰國(guó)伯克霍爾德氏菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、施氏假單胞菌、泰國(guó)伯克霍爾德氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(klebsiella?oxytoca)、苜蓿根瘤菌(rhizobiummeliloti)、枯草芽孢桿菌、需鈉弧菌和谷氨酸棒狀桿菌。更特別地，細(xì)胞可以是谷氨酸棒狀桿菌或大腸桿菌。

28、術(shù)語(yǔ)“外來(lái)的”、“外源的”和“異源的”在本文中可互換使用，并且指在來(lái)自具有遺傳修飾的微生物的細(xì)胞(即重組細(xì)胞)中，而不在來(lái)自沒(méi)有任何遺傳修飾的微生物的細(xì)胞(即野生型細(xì)胞)中產(chǎn)生或表達(dá)的分子，例如多核苷酸(例如基因)、蛋白質(zhì)(例如酶)或代謝產(chǎn)物。

29、如本文與細(xì)胞或微生物結(jié)合使用的，短語(yǔ)“野生型”可以表示具有以如野外天然可見(jiàn)形式的基因組構(gòu)成的細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)可能既適用于整個(gè)細(xì)胞，又適用于各種基因。因此，術(shù)語(yǔ)‘野生型’還可以包括已在其它方面(即就一種或多種基因而言)進(jìn)行遺傳修飾，但與感興趣的基因無(wú)關(guān)的細(xì)胞。因此，術(shù)語(yǔ)“野生型”并不包括其中具體感興趣的基因的基因序列已使用重組方法至少部分地人為改變的此類(lèi)細(xì)胞。因此，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的野生型細(xì)胞指關(guān)于整個(gè)基因組和/或特定基因沒(méi)有遺傳突變的細(xì)胞。因此，在一個(gè)實(shí)例中，關(guān)于酶e1的野生型細(xì)胞可以指在細(xì)胞中具有酶e1的天然/未改變的表達(dá)的細(xì)胞。關(guān)于酶e2、e3、e4、e5等的野生型細(xì)胞可以以相同的方式加以解釋?zhuān)⑶铱梢灾冈诩?xì)胞中分別具有酶e2、e3、e4、e5等的天然/未改變的表達(dá)的細(xì)胞。

30、術(shù)語(yǔ)“天然的”、“自然的”、“內(nèi)源的”和“同源的”可互換使用，并且指來(lái)自沒(méi)有任何遺傳修飾的微生物的細(xì)胞中產(chǎn)生或表達(dá)的分子，例如多核苷酸(例如基因)、蛋白質(zhì)(例如酶)或代謝產(chǎn)物。

31、術(shù)語(yǔ)“生產(chǎn)”和“表達(dá)”在本文中可互換使用，并且指通過(guò)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄和/或mrna轉(zhuǎn)錄物翻譯成蛋白質(zhì)。

32、如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“原料”指在培養(yǎng)基中供應(yīng)給重組細(xì)胞用于產(chǎn)生期望分子(例如代謝產(chǎn)物)的營(yíng)養(yǎng)素。例如，碳源例如生物質(zhì)或衍生自生物質(zhì)的碳化合物是在發(fā)酵過(guò)程或者其它生長(zhǎng)背景例如活疫苗載體或免疫療法中用于微生物的原料。原料可以含有營(yíng)養(yǎng)素以及能量來(lái)源。

33、如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“碳源”指用于根據(jù)本發(fā)明的任何方面的重組細(xì)胞以產(chǎn)生比蘇卡林和/或其類(lèi)似物的適合于用作碳的來(lái)源的物質(zhì)。換言之，碳源被視為用于形成去鐵胺和/或其類(lèi)似物的原材料。碳源包括但不限于葡萄糖、生物質(zhì)水解物、淀粉、蔗糖、纖維素、半纖維素、木糖、木質(zhì)素以及這些底物的單體組分。非限制性地，碳源可以包括以各種形式的各種有機(jī)化合物，包括聚合物、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸和肽。這些的實(shí)例包括各種單糖，例如葡萄糖、右旋糖(d-葡萄糖)、麥芽糖、寡糖、多糖、飽和或不飽和脂肪酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、乙醇、米糠、糖蜜、玉米分解液、纖維素分解液以及前述的混合物。特別地，碳源可以選自葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、賴(lài)氨酸和尸胺。更特別地，根據(jù)本發(fā)明的任何方面使用的碳源可以是簡(jiǎn)單碳源。術(shù)語(yǔ)“簡(jiǎn)單碳源”應(yīng)理解為意指其中碳骨架中的至少一個(gè)c-c鍵已斷裂的碳源。特別地，簡(jiǎn)單碳源可以是至少一種碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素、甘油和半纖維素，但碳源還可以包括丙三醇或非常簡(jiǎn)單的有機(jī)分子，例如co2、co或合成氣。

34、本文使用的術(shù)語(yǔ)“底物”指通過(guò)一種或多種酶的作用轉(zhuǎn)換為另一種化合物，或預(yù)期用于此類(lèi)轉(zhuǎn)換的化合物。該術(shù)語(yǔ)不僅包括單一類(lèi)型的化合物，還包括化合物的任何組合，例如含有至少一種底物或其衍生物的溶液、混合物或其它物質(zhì)。此外，術(shù)語(yǔ)“底物”不僅包括提供衍生自生物質(zhì)的適合于用作原材料的碳源例如糖的化合物，還包括與本說(shuō)明書(shū)中描述的代謝操縱的微生物相關(guān)的途徑中使用的中間體和最終產(chǎn)物代謝產(chǎn)物。

35、術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互換使用，并且指包含兩個(gè)或更多個(gè)單體包括核苷酸、核苷或其類(lèi)似物的有機(jī)聚合物，并且包括但不限于任意長(zhǎng)度的單鏈或雙鏈有義或反義脫氧核糖核酸(dna)，以及適當(dāng)時(shí)，任意長(zhǎng)度的單鏈或雙鏈有義或反義核糖核酸(rna)，包括sirna。

36、術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可互換使用，并且指由兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸單體和/或類(lèi)似物構(gòu)成，并且通過(guò)相鄰氨基酸殘基的羧基和氨基基團(tuán)之間的肽鍵連接在一起的有機(jī)聚合物。

37、術(shù)語(yǔ)“氨基酸”和“氨基酸單體”在本文中可互換使用，并且指天然或合成的氨基酸，例如甘氨酸和d-或l-光學(xué)異構(gòu)體。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸類(lèi)似物”指其中一個(gè)或多個(gè)個(gè)別原子已被不同原子或不同功能團(tuán)替換的氨基酸。

38、根據(jù)本發(fā)明的任何方面使用的任何酶可以是分離的酶。特別地，根據(jù)本發(fā)明的任何方面使用的酶可以在活性狀態(tài)下，并且在所有輔因子、底物、輔助和/或活化多肽或?qū)τ谄浠钚员匦璧囊蜃拥拇嬖谙率褂?。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“分離的”意指感興趣的酶與它天然存在于其中的細(xì)胞相比是富集的。酶可以通過(guò)sds聚丙烯酰胺電泳和/或活性測(cè)定進(jìn)行富集。例如，如通過(guò)在用考馬斯亮藍(lán)染料染色之后聚丙烯酰胺凝膠的目視檢查所判斷的，感興趣的酶可以構(gòu)成制劑中存在的所有多肽的多于5、10、20、50、75、80、85、90、95或99％。根據(jù)本發(fā)明的任何方面使用的酶可以是重組的。

39、技術(shù)人員能夠使用本領(lǐng)域已知的任何方法，以對(duì)細(xì)胞或微生物進(jìn)行遺傳修飾。根據(jù)本發(fā)明的任何方面，可以對(duì)遺傳修飾的細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，使得在限定的時(shí)間間隔內(nèi)，在2小時(shí)內(nèi)，特別是在8小時(shí)或24小時(shí)內(nèi)，它形成的比蘇卡林和/或其類(lèi)似物是野生型細(xì)胞的至少一倍或兩倍，尤其是至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10000倍。產(chǎn)物形成的增加可以例如通過(guò)以下進(jìn)行確定：在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中在相同條件(相同細(xì)胞密度、相同營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、相同培養(yǎng)條件)下各自分開(kāi)地培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞和野生型細(xì)胞指定的時(shí)間間隔，然后確定營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中的靶產(chǎn)物(比蘇卡林和/或其類(lèi)似物)的量。

40、遺傳修飾的細(xì)胞或微生物可能在遺傳上不同于野生型細(xì)胞或微生物。根據(jù)本發(fā)明的任何方面的遺傳修飾的微生物與野生型微生物之間的遺傳差異可能是遺傳修飾的微生物中存在完整的基因、氨基酸、核苷酸等，其可能不存在于野生型微生物中。在一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的遺傳修飾的微生物可能包含使微生物能夠產(chǎn)生與野生型細(xì)胞相比更多的比蘇卡林和/或其類(lèi)似物的酶。相對(duì)于本發(fā)明的遺傳修飾的微生物，野生型微生物可能不具有能夠使遺傳修飾的微生物產(chǎn)生比蘇卡林和/或其類(lèi)似物的酶的活性或不具有所述酶的可檢測(cè)活性。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)‘遺傳修飾的微生物’可以與術(shù)語(yǔ)‘遺傳修飾的細(xì)胞’互換使用。根據(jù)本發(fā)明的任何方面的遺傳修飾對(duì)微生物的細(xì)胞進(jìn)行。

41、根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。特別地，細(xì)胞可以根據(jù)wo2013024114中公開(kāi)的方法產(chǎn)生。

42、如本文使用的，短語(yǔ)‘與其野生型相比，遺傳修飾的細(xì)胞具有增加的酶活性’指各個(gè)酶的活性至少2倍，特別是至少10倍，更特別是至少100倍，再更特別是至少1000倍，且甚至更特別是至少10000倍的增加。

43、如本文使用的，短語(yǔ)‘增加的酶活性和/或表達(dá)’應(yīng)理解為增加的細(xì)胞內(nèi)活性?；旧?，酶促活性的增加可以通過(guò)以下實(shí)現(xiàn)：增加編碼酶的一個(gè)或多個(gè)基因序列的拷貝數(shù)，使用強(qiáng)啟動(dòng)子或采用編碼具有增加活性的相應(yīng)酶的基因或等位基因，改變基因的密碼子利用率，以各種方式增加mrna或酶的半衰期，修改基因表達(dá)的調(diào)控以及任選地通過(guò)組合這些措施。使用含有所需基因、該基因的等位基因或其部分的載體，以及使得基因表達(dá)成為可能的載體，例如通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、綴合或這些方法的組合來(lái)產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的任何方面使用的遺傳修飾的細(xì)胞。異源表達(dá)特別通過(guò)將基因或等位基因整合到細(xì)胞的染色體或染色體外復(fù)制的載體中來(lái)實(shí)現(xiàn)。特別地，酶的活性或表達(dá)可以通過(guò)選自以下的方法在細(xì)胞中得到增加或增強(qiáng)：

44、a)將可操作地連接到編碼酶的基因的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子引入所述細(xì)胞的染色體內(nèi)，

45、b)通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體引入所述細(xì)胞內(nèi)來(lái)增加編碼酶的基因的拷貝數(shù)，以及

46、c)其組合。

47、特別地，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞包含以下的遺傳修飾：

48、a)至少一個(gè)啟動(dòng)子，其可操作地連接到細(xì)胞的合適染色體中編碼任何一種酶的基因，或

49、b)細(xì)胞中的至少一個(gè)表達(dá)載體，以增加編碼酶的基因的拷貝數(shù)，或

50、c)(a)和(b)的組合

51、以增加酶活性的表達(dá)。

52、在一個(gè)實(shí)例中，酶是e1、e2和e3。甚至更特別地，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞包含以下的遺傳修飾：

53、a)至少一個(gè)啟動(dòng)子，其可操作地連接到細(xì)胞的合適染色體中編碼酶e1、e2和e3中的任何一種的基因，或

54、b)細(xì)胞中的至少一個(gè)表達(dá)載體，以增加編碼酶e1、e2和e3的基因的拷貝數(shù)，或

55、c)(a)和(b)的組合，

56、以增加根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞中的酶e1、e2和e3的表達(dá)。

57、在另一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞可以包含進(jìn)一步的遺傳修飾，以包含

58、a)至少一個(gè)啟動(dòng)子，其可操作地連接到細(xì)胞的合適染色體中編碼酶e6-e14和e17-e19中的任何一種的基因，或

59、b)細(xì)胞中的至少一個(gè)表達(dá)載體，以增加編碼酶e6-e14和e17-e19中的任何一種的基因的拷貝數(shù)，或

60、c)(a)和(b)的組合

61、以增加細(xì)胞中的酶e6-e14和e17-e19中的任何一種的活性和/或

62、d)編碼酶e15和e16中的至少一種的基因中的外來(lái)dna；

63、e)缺失編碼酶e15和e16中的至少一種的基因的至少一個(gè)部分；

64、f)編碼酶e15和e16中的至少一種的基因和/或該基因的調(diào)控序列中的至少一個(gè)點(diǎn)突變、rna干擾(sirna)、反義rna；或

65、g)(d)、(e)和/或(f)的組合

66、以減少細(xì)胞中的酶e15和e16中的至少一種的活性。

67、在一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞包含導(dǎo)致至少酶e2、e3的活性增加的遺傳修飾，并且包含進(jìn)一步的遺傳修飾以增加賴(lài)氨酸的產(chǎn)生。在這個(gè)實(shí)例中，賴(lài)氨酸產(chǎn)生的增加可能是由于細(xì)胞具有進(jìn)一步的遺傳修飾，其增加選自e6-e14和e17-e19的至少一種酶的活性和/或減少選自e15和e16的至少一種酶的活性。在此上下文中，術(shù)語(yǔ)‘合適的染色體’指編碼酶e1、e2和/或e3的基因所在的原始染色體。因此，合適的染色體是基因源自其的染色體的來(lái)源。

68、在相同的上下文中，關(guān)于本發(fā)明的任何方面使用的短語(yǔ)“酶ex的活性和/或表達(dá)減少”可以理解為意指活性減少到至多0.5、特別是至多0.1、更特別是至多0.01、甚至更特別是至多0.001且最特別是至多0.0001倍。短語(yǔ)“活性減少”還包含無(wú)法檢測(cè)到的活性(“活性為零”)。某種酶的活性減少可以例如通過(guò)選擇性突變或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于減少某種酶活性的其它措施來(lái)實(shí)現(xiàn)。特別地，本領(lǐng)域技術(shù)人員例如至少在dubeau等人2009.singh&2008.，lee等人，2009等等中找到借助于中斷特異性基因用于修改和減少蛋白質(zhì)表達(dá)并同時(shí)降低促酶活性的說(shuō)明。根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞中的酶促活性的減少可以通過(guò)修飾包含核酸序列之一的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中所述修飾選自包含以下、由以下組成的組：在基因中插入外來(lái)dna、缺失基因的至少一部分、基因序列中的點(diǎn)突變、rna干擾(sirna)、反義rna或者調(diào)控序列例如如啟動(dòng)子和終止子或基因側(cè)翼的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的修飾(插入、缺失或點(diǎn)突變)。特別地，為了減少細(xì)胞中的酶活性，細(xì)胞可以包含

69、d)編碼酶的基因中的外來(lái)dna；

70、e)缺失編碼酶的基因的至少一個(gè)部分；

71、f)編碼酶的基因和/或該基因的調(diào)控序列中的至少一個(gè)點(diǎn)突變、rna干擾(sirna)、反義rna；或

72、g)(d)、(e)和(f)的組合

73、上文提到的酶和基因和下文提到的所有酶和基因的表達(dá)都可借助于單向和雙向蛋白質(zhì)凝膠分離隨后為用適當(dāng)?shù)脑u(píng)估軟件光學(xué)鑒定凝膠中的蛋白質(zhì)濃度來(lái)確定。

74、如果酶活性的增加唯一地基于增加相應(yīng)基因的表達(dá)，則酶活性增加的定量可以通過(guò)比較野生型細(xì)胞和遺傳修飾的細(xì)胞之間的單向或雙向蛋白質(zhì)分離簡(jiǎn)單地進(jìn)行確定。制備具有細(xì)菌的蛋白質(zhì)凝膠和鑒定蛋白質(zhì)的常見(jiàn)方法是通過(guò)hermann等人(electrophoresis，22:1712-23(2001)描述的程序。蛋白質(zhì)濃度也可以通過(guò)用對(duì)于待測(cè)定的蛋白質(zhì)特異性的抗體的蛋白質(zhì)印跡雜交進(jìn)行分析(sambrook等人，molecular?cloning:alaboratory?manual，第二版，cold?spring?harbor?laboratory?press，cold?spring?harbor，n.y.usa，1989)，隨后為用適當(dāng)軟件的光學(xué)評(píng)估用于濃度確定(lohaus和meyer(1989)biospektrum，5:32-39；lottspeich(1999)，angewandte?chemie?111:2630-2647)。當(dāng)通過(guò)待確定的酶活性催化的反應(yīng)的可能產(chǎn)物在微生物中可能被快速代謝，或者野生型中的活性本身太低而無(wú)法充分確定待基于生產(chǎn)形成而確定的酶活性時(shí)，這種方法也始終是一個(gè)選項(xiàng)。

75、根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞是遺傳修飾的，或者可能包含相對(duì)于其野生型細(xì)胞增加選自e1、e2和e3的至少兩種酶的活性的遺傳修飾，其中：

76、e1是能夠?qū)①?lài)氨酸轉(zhuǎn)換為尸胺的賴(lài)氨酸脫羧酶(ec：4.1.1.18)；

77、e2是能夠?qū)⑹忿D(zhuǎn)換為n5-羥基-尸胺的尸胺n5-單加氧酶(ec?1.14.13.-)；和

78、e3是能夠?qū)5-羥基-尸胺和琥珀酰輔酶a轉(zhuǎn)換為n5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸或n-羥基-n-琥珀酰腐胺的n5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸合酶(ec：2.3.-.-)。

79、在一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞可能包含相對(duì)于其野生型細(xì)胞增加至少e2和e3的活性的遺傳修飾。在另一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞可能包含相對(duì)于其野生型細(xì)胞增加e1、e2和e3的活性的遺傳修飾。賴(lài)氨酸脫羧酶(e1)能夠?qū)①?lài)氨酸轉(zhuǎn)換為尸胺。特別地，e1將賴(lài)氨酸轉(zhuǎn)換為尸胺，也稱(chēng)為1,5-戊二胺。編碼賴(lài)氨酸脫羧酶(e1)的合適多核苷酸可以得自例如以下的菌株：大腸桿菌、耐鹽芽孢桿菌(bacillus?halodurans)、蠟狀芽孢桿菌(bacillus?cereus)、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringensis)、雙向伯克霍爾德氏菌(burkholderia?ambifaria)、越南伯克霍爾德氏菌(burkholderia?vietnamensia)、新洋蔥伯克霍爾德氏菌(burkholderia?cenocepatia)、紫色色桿菌(chromobacterium?violaceum)、干燥棒狀桿菌(corynebacterium?xerosis)、反芻月形單胞菌(selenomonas?ruminantium)、霍亂弧菌(vibrio?cholerae)、副溶血弧菌(vibrio?parahaemolyticus)、天藍(lán)色鏈霉菌(streptomyces?coelicolor)、紫紅鏈霉菌(streptomyces?violaceoruber)、毛鏈霉菌、嚙蝕艾肯菌(eikenalla?corrodens)、嗜氨基酸真桿菌(eubacterium?acidaminophilum)、土拉弗朗西斯菌(francisellatulariensis)、好熱地芽孢桿菌(geobacillus?kaustophilus)、傷寒沙門(mén)氏菌(salmonellatyphi)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(salmonella?typhimurium)、蜂房哈夫尼菌(hafnia?alvei)、腦膜炎奈瑟球菌(neisseria?meningitidis)、嗜酸熱原體(thermoplasma?acidophilum)、惡性瘧原蟲(chóng)(plasmodium?falciparum)、耐輻射動(dòng)球菌(kineococcus?radiotolerans)、伊平屋橋大洋芽孢桿菌(oceanobacillus?iheyensis)、深淵火球菌(pyrococcus?abyssi)、海洋原綠球藻(porochlorococcus?marinus)、普通變形桿菌(proteus?vulgaris)、鐵還原紅育菌(rhodoferax?ferrireducens)、降解糖菌(saccharophagus?degradans)、肺炎鏈球菌(streptococcus?pneumoniae)、聚球藻屬物種(synechococcus?sp.)。這些賴(lài)氨酸脫羧酶的氨基酸序列已在數(shù)據(jù)庫(kù)(genbank)中登記。

80、可以用于根據(jù)本發(fā)明的任何方面的方法中的合適賴(lài)氨酸脫羧酶應(yīng)理解為能夠使賴(lài)氨酸，特別是l-賴(lài)氨酸脫羧的酶及其等位基因或突變體。

81、特別地，賴(lài)氨酸脫羧酶(e1)選自其安全性已得到確認(rèn)的大腸桿菌、干燥棒狀桿菌、天藍(lán)色鏈霉菌、紫紅鏈霉菌和毛鏈霉菌。更特別地，e1可以選自紫紅鏈霉菌、毛鏈霉菌和大腸桿菌。甚至更特別地，e1包含相對(duì)于seq?id?no:15(e1a)、seq?id?no:25(e1b)或seq?id?no:50(e1c).seq?id?no:至少70％的序列同一性。這些序列可在國(guó)際可訪(fǎng)問(wèn)數(shù)據(jù)庫(kù)中免費(fèi)獲得，所述數(shù)據(jù)庫(kù)例如美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書(shū)館(national?library?of?medicine)和美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(national?institute?of?health)(nih)的數(shù)據(jù)庫(kù)。相同的序列也可在巴斯德研究所(institute?pasteur)(法國(guó))的colibri網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器上在基因名稱(chēng)cada下免費(fèi)獲得。相同的序列也可通過(guò)經(jīng)由瑞士生物信息學(xué)研究所(swiss?institute?of?bioinformatics)維護(hù)的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器expasy在基因名稱(chēng)cada下免費(fèi)獲得。

82、e2是能夠?qū)⑹忿D(zhuǎn)換為n5-羥基尸胺的尸胺n5-單加氧酶。特別地，e2將尸胺轉(zhuǎn)換為n5-羥基尸胺。e2還可以被稱(chēng)為desb，或賴(lài)氨酸n(6)-羥化酶/l-鳥(niǎo)氨酸n(5)-加氧酶家族蛋白或l-賴(lài)氨酸6-單加氧酶(dfoa)。更特別地，e2可以來(lái)自列文虎克氏鏈霉菌(streptomycesleeuwenhoekii)(cqr63915.1?gi:822880125)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(streptomycesvenezuelae)atcc?10712(cca55857.1?gi:328882618)、極暗黃鏈霉菌(streptomycesfulvissimus)dsm?40593(agk77332.1?gi:485094149)、瘡茄病鏈霉菌(streptomycesscabiei)87.22(cbg72818.1gi:260649703)、鏈霉菌屬物種pamc?26508(agj55094.1gi:478746514)、天藍(lán)色鏈霉菌a3(2)(cab87220.1?gi:7544047)、天藍(lán)色鏈霉菌cai-140、產(chǎn)二素鏈霉菌(streptomyces?ambofaciens)atcc?23877(akz55867.1?gi:917649198)、產(chǎn)二素鏈霉菌(cal18383.1gi:115501977)、鏈霉菌屬物種(qtk16919.1?gi:2021361636)、鏈霉菌屬物種om5714(kaf2779951.1gi:1812043702)、鏈霉菌屬物種cbmai?2042(rlv66814.1?gi:1495247117)、擬諾卡氏菌屬物種(nocardiopsis?sp.)jb363(sio88001.1?gi:1143070536)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(alo08592.1?gi:952470254)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(cum41036.1gi:932870025)、甲酸鏈霉菌(streptomyces?formicae)(atl27940.1gi:1259310059)、紫紅鏈霉菌、毛鏈霉菌、orrella?dioscoreae(soe50134.1?gi:1253556185)、orrella?dioscoreae(sbt27311.1gi:1037119819)、鏈霉菌屬物種nl15-2k(gcb49137.1gi:1493708164)、小單孢菌屬物種(micromonospora?sp.)b006(axo35035.1?gi:1450456451)、波卓鏈霉菌(streptomyces?bottropensis)atcc?25435(emf50428.1?gi:456384850)、放線(xiàn)菌綱細(xì)菌(actinobacteria?bacterium)ov450(kpi33963.1?gi:930403533)、薩愛(ài)利塞斯小單孢菌(micromonospora?saelicesensis)(ran96846.1gi:1408858225)或者具有以下登錄號(hào)的植物宏基因組：vgo10077.1gi:1613564795、vfr50302.1?gi:1591769534、vfr49623.1gi:1591759477、vfr70778.1?gi:1591736834、vfr85324.1gi:1591730130、vfr90816.1?gi:1591727176、vfr74009.1gi:1591713764、vfr35744.1?gi:1591707917、vfr18051.1gi:1591706292、vfr25000.1?gi:1591690076、或vfr75029.1gi:1591683182。

83、e2還可以被稱(chēng)為鐵載體生物合成蛋白、單加氧酶，并且還可以選自干燥棒狀桿菌(slm95113.1)、奶酪發(fā)酵短狀桿菌(brachybacterium?tyrofermentans)(wp_193116041.1)、人參土短狀桿菌(brachybacterium?ginsengisoli)(wp_096799042.1)、短狀桿菌屬物種(brachybacteriumsp.)hmsc06h03(wp_070499498.1)、放線(xiàn)菌目細(xì)菌(actinomycetales?bacterium)(nma75681.1)、候選種brachybacteriumintestinipullorum(hjc70675.1)、短狀桿菌屬物種ag952(wp_133677657.1)、副凝聚短狀桿菌(brachybacterium?paraconglomeratum)(wp_010552292.1)、短狀桿菌屬物種sw0106-09(wp_053916852.1)、短狀桿菌屬物種sponge(wp_062950357.1)、短狀桿菌屬物種sgair0954(wp_137770520.1)、抗酚短狀桿菌(brachybacterium?phenoliresistens)(wp_038369982.1)、brachybacterium?subflavum(wp_152352729.1)、brachybacteriumendophyticum(wp_109276394.1)、教堂短狀桿菌(brachybacterium?sacelli)(wp_209904120.1)、耐鹽短狀桿菌(brachybacterium?halotolerans)(wp_200500938.1)、短狀桿菌屬物種cba3105(wp_228358231.1)、短狀桿菌屬物種p6-10-x1(wp_083713362.1)、短狀桿菌屬物種p6-10-x1(apx34711.1)、短狀桿菌屬物種fme24(wp_193105844.1)、短狀桿菌屬物種yjgr34(wp_114855299.1)、isoptericola?cucumis(wp_188524545.1)、海湖微桿菌(microbacterium?marinilacus)(wp_221859754.1)、agreia?bicolorata(wp_044440800.1)、變異棲白蟻菌(isoptericola?variabilis)(wp_144881770.1)、變異棲白蟻菌(wp_013837804.1)、xylanimonas?oleitrophica(wp_111251928.1)、短桿菌屬(wp_113902445.1)、antribacter物種klbmp9083(wp_236088632.1)、棲白蟻菌屬(isoptericola)(wp_106267363.1)、解纖維素木聚糖單胞菌(xylanimonascellulosilytica)(wp_012878564.1)、isoptericola?chiayiensis(wp_172152929.1)、檸檬原小單孢菌(promicromonospora?citrea)(wp_171102616.1)、江蘇棲白蟻菌(isoptericola?jiangsuensis)(wp_098462726.1)、brevibacterium?renqingii(wp_209323545.1)、brevibacterium?renqingii(wp_209371577.1)、短桿菌屬物種w7.2(wp_211978854.1)、乳酪短桿菌(brevibacterium?casei)(wp_198499439.1)、brevibacteriumsandarakinum(wp_092106697.1)、擴(kuò)展短桿菌(brevibacterium?linens)(wp_052239998.1)、短桿菌屬物種rit?803(wp_204232889.1)、短桿菌屬物種vcm10(wp_025776857.1)、碘短桿菌(brevibacterium?iodinum)(wp_101543359.1)、短桿菌屬(wp_137827005.1)、短桿菌屬物種cfh?10365(wp_152347365.1)、本色短桿菌(brevibacteriumpigmentatum)(wp_167198402.1)、西里古里短桿菌(brevibacterium?siliguriense)(wp_092011613.1)、brevibacterium?limosum(wp_166822890.1)、沉積物短桿菌(brevibacterium?sediminis)(wp_181272454.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_096178869.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_114384950.1)、短桿菌屬物種ucma11754(wp_235346449.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_143924264.1)、古老短桿菌(brevibacterium?antiquum)(wp_198396798.1)、短桿菌屬物種ccug?69071(wp_230744765.1)、海洋短桿菌(brevibacterium?marinum)(wp_167950433.1)、短桿菌屬物種hy170(wp_231442298.1)、短桿菌屬物種s22(wp_135810285.1)、brevibacteriumaurantiacum(wp_193102124.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_193086562.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_101639104.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_125178290.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_135446719.1)、表皮短桿菌(brevibacterium?epidermidis)(wp_098731558.1)、擴(kuò)展短桿菌(wp_062862175.1)、表皮短桿菌(wp_062243347.1)、擴(kuò)展短桿菌(wp_139908726.1)、表皮短桿菌(hje77366.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_096157398.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_193084517.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_101584429.1)、brevibacteriumaurantiacum(wp_096167625.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_096145959.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_096160423.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_069600710.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_009883551.1)、短桿菌屬物種ucma11752(wp_235350997.1)、短桿菌屬物種mg-1(wp_139468396.1)、候選種brevibacteriumintestinavium(hja61508.1)、短桿菌屬物種smbl_hhyl_hb1(wp_212129584.1)、brevibacterium?atlanticum(wp_166973261.1)、brevibacteriumaurantiacum(wp_193078848.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_096163051.1)、短桿菌屬物種ct2-23b(wp_172170764.1)、擴(kuò)展短桿菌(hjf75769.1)、brevibacteriumaurantiacum(wp_101598305.1)、短桿菌屬物種'marine'(wp_169252964.1)、短桿菌屬物種s111(wp_135540314.1)、大洋短桿菌(brevibacterium?oceani)(wp_210602990.1)、大洋短桿菌(wp_181273084.1)、古老短桿菌(wp_101620895.1)、短桿菌屬物種239c(wp_101574167.1)、短桿菌屬物種fme17(wp_193096434.1)、短桿菌屬物種fme37(wp_193073001.1)、短桿菌屬(wp_009376218.1)、彼爾姆短桿菌(brevibacterium?permense)(wp_173151746.1)、乳酪短桿菌(wp_095376411.1)、乳酪短桿菌(wp_119296730.1)、乳酪短桿菌(wp_063249380.1)、或乳酪短桿菌(wp_144588713.1)。

84、在另一個(gè)實(shí)例中，e2還可以被稱(chēng)為賴(lài)氨酸n(6)-羥化酶/l-鳥(niǎo)氨酸n(5)-加氧酶家族蛋白或l-賴(lài)氨酸6-單加氧酶(dfoa)，并且可以來(lái)自嗜酸放線(xiàn)線(xiàn)束菌(actinospicaacidiphila)(nea95037.1)、鏈霉菌屬物種i5(wp_199217164.1)、鏈霉菌屬物種zs0098(wp_122217404.1)、鏈霉菌屬物種rk31(wp_210906078.1)、鏈霉菌屬物種bse7-9(wp_128126623.1)、鏈霉菌屬物種i4(2020)(wp_199206420.1)、鏈霉菌屬物種pam3c(wp_216716554.1)、鏈霉菌屬物種e2n171(wp_121720277.1)、鏈霉菌屬物種e1n211(wp_114873827.1)、酒紅鏈霉菌(streptomyces?vinaceus)(ql65622.1)、嗜酸放線(xiàn)線(xiàn)束菌(nea78438.1)、鏈霉菌屬物種z38(wp_156699446.1)、鏈霉菌屬物種sms_su21(wp_102641626.1)、變異鏈霉菌(streptomyces?variabilis)(wp_189366530.1)、鏈霉菌屬物種hns054(wp_048457763.1)、鏈霉菌屬物種4f(alv50328.1)、馬特鏈霉菌(streptomycesmatensis)(ggt60880.1)、嗜酸放線(xiàn)線(xiàn)束菌(wp_203550773.1)、纖維素鏈霉菌(streptomyces?cellulosae)(ghe36673.1)、灰略紅鏈霉菌(streptomyces?griseorubens)(wp_037639705.1)、灰略紅鏈霉菌(ggq93424.1)、韋臘鏈霉菌(streptomyces?werraensis)(wp_190000755.1)、鏈霉菌屬物種di50b(scd87686.1)、鏈霉菌屬物種mnu103(wp_230228098.1)、韋臘鏈霉菌(wp_225629336.1)、嗜酸放線(xiàn)線(xiàn)束菌(wp_163087763.1)、鏈霉菌屬物種geseq-13(wp_210633992.1)、異硫霉素鏈霉菌(streptomyces?althioticus)(ggq52599.1)、鏈霉菌屬物種xht-2(wp_161107407.1)、鏈霉菌屬(wp_028959209.1)、白淺灰鏈霉菌(streptomyces?albogriseolus)(ghc05278.1)、鏈霉菌屬物種mcg8(mbt2905834.1)、鏈霉菌屬(wp_086020175.1)、鏈霉菌屬物種dh-12(wp_106414114.1)、鏈霉菌屬(wp_093767215.1)、鏈霉菌屬物種dh20(wp_228916768.1)、唐德鏈霉菌(streptomyces?tendae)(wp_150156576.1)、鏈霉菌屬物種t12(wp_145827643.1)、鏈霉菌屬(wp_215209974.1)、鏈霉菌屬(wp_006131547.1)、鏈霉菌屬物種nrrl?f-5527(wp_031060218.1)、假灰鏈霉菌(streptomyces?pseudogriseolus)(wp_225654116.1)、毛鏈霉菌(wp_189555971.1)、孔雀石褐鏈霉菌(streptomyces?malachitofuscus)(wp_190164278.1)、淺灰白鏈霉菌(streptomyces?griseoloalbus)(ggv56407.1)、鏈霉菌屬(wp_125506339.1)、白丘鏈霉菌(streptomyces?albaduncus)(wp_184760471.1)、鏈霉菌屬(wp_161176537.1)、禿裸鏈霉菌(streptomyces?calvus)(wp_142232871.1)、禿裸鏈霉菌(wp_142195206.1)、綠孢鏈霉菌(streptomyces?viridosporus)(wp_081236127.1)、摩洛哥鏈霉菌(streptomyces?marokkonensis)(wp_149548377.1)、鏈霉菌屬(wp_040907108.1)、鏈霉菌屬物種nwu49(wp_109540000.1)、綠孢鏈霉菌(wp_004987747.1)、殺真菌素鏈霉菌(streptomyces?fungicidicus)(wp_121546080.1)、鏈霉菌屬物種dh5(wp_228966784.1)、綠孢鏈霉菌(wp_016826156.1)、鏈霉菌屬物種na02536(wp_176117311.1)、鏈霉菌屬物種ac558_rss880(wp_217127653.1)、鏈霉菌屬物種13-12-16(wp_085570641.1)、鏈霉菌屬物種tu?3180(wp_159533060.1)、鏈霉菌屬物種cb02400(wp_073931738.1)、灰黃鏈霉菌(streptomyces?griseoflavus)(wp_190095098.1)、微管螺旋鏈霉菌(streptomycescapillispiralis)(wp_145869103.1)、鏈霉菌屬(wp_184825089.1)、鏈霉菌屬物種chd11(wp_215205176.1)、鏈霉菌屬物種nrrl?s-37(wp_030869334.1)、鏈霉菌屬物種sm1(wp_103541522.1)、豐加鏈霉菌(streptomyces?toyocaensis)(wp_037931691.1)、浦那鏈霉菌(streptomyces?poonensis)(wp_189862605.1)、鏈霉菌屬物種nrrl?wc-3626(wp_030217203.1)、streptomyces?rubradiris(wp_189995711.1)、鏈霉菌屬(wp_086696892.1)、黃麻鏈霉菌(streptomyces?corchorusii)(wp_059261504.1)、鏈霉菌屬物種eas-ab2608(wp_059249696.1)、鏈霉菌屬物種fbkl.4005(wp_094373911.1)、吸水鏈霉菌(streptomyces?hygroscopicus)(wp_014672887.1)、streptomyces?populi(wp_103552166.1)、streptomyces?spongiae(wp_152774423.1)、橙灰鏈霉菌(streptomycesaurantiogriseus)(wp_189941416.1)、鏈霉菌屬(wp_030825112.1)、streptomycescyanogenus(wp_208032394.1)、吸水鏈霉菌(wp_058080637.1)、灰黃鏈霉菌tu4000(efl41232.1)、鏈霉菌屬(wp_030782431.1)、鏈霉菌屬物種ru62(wp_103810221.1)、streptomyces?ferrugineus(wp_194045781.1)、鏈霉菌屬物種m2cj-2(wp_202277307.1)、蓬刺鏈霉菌(streptomyces?hirsutus)(wp_055628641.1)、streptomyces?triticiradicis(wp_151470815.1)、鏈霉菌屬(wp_189754126.1)、鏈霉菌屬物種nrrl?wc-3725(wp_031028778.1)、streptomyces?phyllanthi(wp_152789148.1)、蓬刺鏈霉菌(wp_055595050.1)、不產(chǎn)色鏈霉菌(streptomyces?achromogenes)(wp_030618669.1)、鏈霉菌屬物種nrrl?b-3648(wp_053710495.1)、鏈霉菌屬(wp_031094998.1)、鏈霉菌屬物種imtb2501(wp_076088759.1)、泛菌屬(pantoea)(wp_010247061.1)、成團(tuán)泛菌(pantoeaagglomerans)(wp_158132335.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163641339.1)、泛菌屬(wp_039389956.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191924047.1)、成團(tuán)泛菌(wp_111534207.1)、成團(tuán)泛菌(wp_172608646.1)、成團(tuán)泛菌(wp_060679206.1)、成團(tuán)泛菌(wp_201500585.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187500285.1)、成團(tuán)泛菌(wp_033787054.1)、泛菌屬(wp_124890595.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163852070.1)、泛菌屬(wp_154210120.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187506787.1)、成團(tuán)泛菌(wp_010670383.1)、成團(tuán)泛菌(wp_143789438.1)、泛菌屬物種(rzk07466.1)、成團(tuán)泛菌(mbs7708199.1)、成團(tuán)泛菌(wp_089414761.1)、成團(tuán)泛菌(wp_182500641.1)、成團(tuán)泛菌(wp_193585707.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191921679.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163794175.1)、成團(tuán)泛菌(wp_208003523.1)、成團(tuán)泛菌(wp_064690801.1)、成團(tuán)泛菌(wp_069026760.1)、成團(tuán)泛菌(wp_033768947.1)、成團(tuán)泛菌(wp_086906736.1)、成團(tuán)泛菌(wp_062758876.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191938763.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163658683.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163845107.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163638697.1)、成團(tuán)泛菌(wp_115765005.1)、泛菌屬物種wmus005(wp_179898292.1)、泛菌屬(wp_039661441.1)、桉樹(shù)泛菌(pantoea?eucalypti)(awd37912.1)、泛菌屬(wp_105099754.1)、pantoea?vagans(wp_095707818.1)、泛菌屬(wp_008924643.1)、pantoea?vagans(wp_135910763.1)、泛菌屬物種s62(wp_201251339.1)、pantoea?vagans(wp_107320322.1)、桉樹(shù)泛菌(wp_187513086.1)、成團(tuán)泛菌(pei06058.1)、泛菌屬物種pnt01(wp_192377898.1)、桉樹(shù)泛菌(awd37907.1)、桉樹(shù)泛菌(awd37904.1)、pantoea?jilinensis(qxg56954.1)、泛菌屬物種ov426(wp_090965310.1)、pantoea?vagans(wp_161736341.1)、pantoea?vagans(wp_061060758.1)、pantoea?vagans(wp_033735770.1)、pantoea?vagans(wp_013196309.1)、泛菌屬(wp_150011557.1)、成團(tuán)泛菌(wp_222925733.1)、泛菌屬(wp_046102688.1)、長(zhǎng)尾噬菌體科物種(siphoviridae?sp.)(dal43156.1)、斯氏珀椿(plautia?stali)的f型共生體(wp_058958199.1)、泛菌屬(wp_009092930.1)、泛菌屬物種ekm101v(wp_167428608.1)、pantoeadeleyi(wp_140917098.1)、泛菌屬物種arc607(wp_111138385.1)、timema?californicum(cad7569022.1)、enterobacter?soli(wp_014063925.1)、成團(tuán)泛菌(wp_233988771.1)、歐文氏菌屬物種(erwinia?sp.)198(wp_125287552.1)、歐文氏菌屬物種(hbv39119.1)、pantoea?allii(wp_218994922.1)、泛菌屬物種3_1284(wp_113655326.1)、泛菌屬物種icbg1758(wp_104085642.1)、泛菌屬(wp_063878329.1)、泛菌屬物種psnih1(wp_145339666.1)、泛菌屬物種ae16(wp_071668352.1)、泛菌屬(wp_040113515.1)、泛菌屬物種rit?413(wp_108569844.1)、易分離泛菌(pantoea?eucrina)(wp_065647647.1)、泛菌屬物種acro-807(wp_166714195.1)、泛菌屬(wp_094111611.1)、pantoea?allii(wp_096011383.1)、歐文氏菌屬物種9145(wp_034916568.1)、歐文氏菌屬物種ervv1(wp_067700592.1)、erwiniaoleae(wp_034947936.1)、沙雷氏菌屬物種(serratia?sp.)m24t3(wp_009636530.1)、斯氏泛菌(pantoea?stewartia)(wp_039338790.1)、rouxiella?badensis(wp_165429960.1)、rouxiella?badensis(wp_084912800.1)、泛菌屬(wp_110267872.1)、斯氏泛菌(wp_054634525.1)、rouxiella?badensis(wp_227989822.1)、泛菌屬(wp_033740201.1)、斯氏泛菌(wp_058702088.1)、斯氏泛菌(wp_185199936.1)、塔斯曼尼亞歐文氏菌(erwiniatasmaniensis)(wp_012442726.1)、變黑梨花歐文氏菌(erwinia?piriflorinigrans)(wp_023656444.1)、菠蘿泛菌(pantoea?ananatis)(wp_019106389.1)、菠蘿泛菌(wp_03024531.1)、菠蘿泛菌(wp_194761606.1)、菠蘿泛菌(wp_064352874.1)、解淀粉歐文氏菌(erwinia?amylovora)(wp_004160307.1)、解淀粉歐文氏菌(wp_099350830.1)、解淀粉歐文氏菌cfbp1430(5o8p_a)、解淀粉歐文氏菌(wp_168394395.1)、解淀粉歐文氏菌(wp_168415207.1)、解淀粉歐文氏菌(wp_004171022.1)、沙梨歐文氏菌(erwinia?pyrifoliae)dsm?12163(cay75870.1)、沙梨歐文氏菌(wp_012669440.1)、歐文氏菌屬物種ejp617(wp_014542490.1)、印刷歐文氏菌(erwinia?typographi)(wp_034899164.1)、歐文氏菌屬(wp_013202517.1)、比氏歐文氏菌(erwinia?billingiae)(wp_053142707.1)、菠蘿泛菌(wp_210512032.1)、菠蘿泛菌(wp_161611345.1)、菠蘿泛菌(awd37900.1)、泛菌屬(wp_014606631.1)、泛菌屬物種bav?3049(wp_158784840.1)、菠蘿泛菌(wp_029568444.1)、菠蘿泛菌(wp_110956821.1)、菠蘿泛菌(wp_105077110.1)、mixta?mediterraneensis(wp_193405262.1)、菠蘿泛菌(wp_210451676.1)、菠蘿泛菌(wp_028724620.1)、番石榴歐文氏菌(erwinia?psidii)(wp_124232197.1)、菠蘿泛菌(wp_058705541.1)、erwinia?iniecta(wp_052902396.1)、泛菌屬物種imh(wp_024968324.1)、歐文氏菌屬(wp_099707479.1)、或成團(tuán)泛菌(wp_111534207.1)。

85、特別地，e2可以來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌、紫紅鏈霉菌、毛鏈霉菌、解淀粉歐文氏菌、成團(tuán)泛菌或干燥棒狀桿菌。更特別地，e2可以選自天藍(lán)色鏈霉菌(nuv53723.1)、紫紅鏈霉菌、毛鏈霉菌(wp_189555971.1)、解淀粉歐文氏菌(wp_004160307.1)、成團(tuán)泛菌(wp_010247061.1)或干燥棒狀桿菌(slm95113.1)。甚至更特別地，e2可以包含相對(duì)于seq?idno:4(e2a)、seq?id?no:16(e2b)、seq?id?no:26(e2c)、seq?id?no:33(e2d)、seq?id?no:39(e2e)或seq?id?no:45(e2f)至少70％的序列同一性。

86、e3是n5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸合酶(ec:2.3.-.-)，其能夠?qū)5-羥基-尸胺和琥珀酰輔酶a轉(zhuǎn)換為n5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸。特別地，酶e3將n5-羥基-尸胺和琥珀酰輔酶a轉(zhuǎn)換為n5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸。e3可以是乙酰轉(zhuǎn)移酶或gnat家族n-乙酰轉(zhuǎn)移酶，或者也稱(chēng)為鐵載體合成酶超家族組c的去鐵胺e生物合成蛋白desd，或鐵載體合成酶組分連接酶。更特別地，e3可以來(lái)自鏈霉菌屬(wp_048457762.1)、鏈霉菌屬物種i4(2020)(wp_199206419.1)、鏈霉菌屬物種i5(wp_199217165.1)、鏈霉菌屬物種z38(wp_156699445.1)、鏈霉菌屬物種rk31(wp_210906077.1)、嗜酸放線(xiàn)線(xiàn)束菌(wp_163087761.1)、鏈霉菌屬(wp_102641627.1)、鏈霉菌屬物種di50b(scd87678.1)、韋臘鏈霉菌(wp_190000756.1)、灰略紅鏈霉菌(ggq93417.1)、鏈霉菌屬物種mnu103(wp_230228100.1)、馬特鏈霉菌(ggt60873.1)、灰略紅鏈霉菌(wp_033274713.1)、鏈霉菌屬(wp_136238514.1)、嗜酸放線(xiàn)線(xiàn)束菌(wp_203550772.1)、鏈霉菌屬(wp_215209975.1)、纖維素鏈霉菌(ghe36667.1)、鏈霉菌屬(wp_019525183.1)、唐德鏈霉菌(wp_150156577.1)、異硫霉素鏈霉菌(ggq52607.1)、鏈霉菌屬物種geseq-13(wp_210633991.1)、鏈霉菌屬物種f-7(wp_093767214.1)、稍黃鏈霉菌(streptomyces?rubiginosus)(wp_189480783.1)、鏈霉菌屬物種t12(wp_145827642.1)、鏈霉菌屬物種dh20(wp_228916770.1)、綠淀粉酶鏈霉菌(streptomyces?viridodiastaticus)(wp_189909874.1)、鏈霉菌屬(wp_006131548.1)、鏈霉菌屬物種2bbp-j2(wp_167741843.1)、假灰鏈霉菌(wp_225654117.1)、鏈霉菌屬物種dh-12(wp_106414113.1)、毛鏈霉菌(wp_189555972.1)、摩洛哥鏈霉菌(wp_149548376.1)、鏈霉菌屬物種cb02400(wp_073931737.1)、鏈霉菌屬(wp_164333385.1)、鏈霉菌屬物種sm1(wp_103541521.1)、鏈霉菌屬(wp_192229625.1)、鏈霉菌屬物種chd11(wp_215205175.1)、鏈霉菌屬物種ac558_rss880(wp_217127652.1)、鏈霉菌屬(wp_171113987.1)、刺疣鏈霉菌(streptomyces?spinoverrucosus)(wp_141313135.1)、豐加鏈霉菌(wp_037931694.1)、鏈霉菌屬物種13-12-16(wp_085570642.1)、鏈霉菌屬物種dh5(wp_228966783.1)、灰黃鏈霉菌(wp_004931114.1)、鏈霉菌屬物種na02536(wp_176117312.1)、鏈霉菌屬(wp_142195205.1)、刺疣鏈霉菌(wp_196462535.1)、鏈霉菌屬物種slbn-134(wp_142170642.1)、洛蒙德鏈霉菌(streptomyces?lomondensis)(wp_190048216.1)、鏈霉菌屬物種jcm17656(qwa22516.1)、微管螺旋鏈霉菌(wp_145869102.1)、鏈霉菌屬(wp_215154691.1)、綠產(chǎn)色鏈霉菌(streptomyces?viridochromogenes)(wp_004001040.1)、鏈霉菌屬(wp_125510363.1)、褐色鏈霉菌(streptomyces?chromofuscus)(wp_189699031.1)、灰黃鏈霉菌(wp_190095097.1)、鏈霉菌屬(wp_126900012.1)、鏈霉菌屬物種nrrl?wc-3626(wp_030217191.1)、箭毒鏈霉菌(streptomyces?curacoi)(wp_062155922.1)、孔雀石褐鏈霉菌(ggx09391.1)、孔雀石褐鏈霉菌(wp_190164476.1)、阿富汗鏈霉菌(streptomycesafghaniensis)772(epj38539.1)、殺真菌素鏈霉菌(wp_121546081.1)、教酒色鏈霉菌(streptomyces?chartreusis)(wp_107905561.1)、鏈霉菌屬物種wac?05379(wp_125529404.1)、streptomyces?wuyuanensis(wp_093654151.1)、streptomycesswartbergensis(wp_086603880.1)、教酒色鏈霉菌(wp_176577002.1)、美麗鏈霉菌(streptomyces?bellus)(wp_193505879.1)、天藍(lán)微紅鏈霉菌(streptomycescoeruleorubidus)(wp_150481012.1)、streptomyces?dysideae(wp_067021295.1)、非洲鏈霉菌(streptomyces?africanus)(wp_086560822.1)、綠青鏈霉菌(streptomyces?iakyrus)(wp_033308050.1)、雅加達(dá)鏈霉菌(streptomyces?djakartensis)(wp_190197820.1)、鏈霉菌屬物種xy152(wp_053636056.1)、鏈霉菌屬(wp_030825115.1)、鏈霉菌屬物種sid5643(wp_161369364.1)、天青鏈霉菌(streptomyces?caelestis)(wp_184984045.1)、柴達(dá)木鏈霉菌(streptomyces?qaidamensis)(wp_062927006.1)、streptomyces?regalis(wp_062703120.1)、赭褐鏈霉菌(streptomyces?umbrinus)(wp_190227783.1)、鏈霉菌屬物種nrrl?s-146(wp_031102640.1)、赭褐鏈霉菌(wp_189843349.1)、山丘鏈霉菌(streptomycescollinus)(mbb5811277.1)、鏈霉菌屬物種wac04114(wp_221757552.1)、印度鏈霉菌(wp_234847835.1)、堆孢鏈霉菌(streptomyces?massasporeus)(wp_189588732.1)、鏈霉菌屬(wp_104779799.1)、紫產(chǎn)色鏈霉菌(streptomyces?violaceochromogenes)(wp_191845917.1)、streptomyces?montanus(wp_138046192.1)、鏈霉菌屬物種a244(wp_107455124.1)、鏈霉菌屬(wp_031130500.1)、意外鏈霉菌(streptomyces?paradoxus)(wp_184558435.1)、紫藍(lán)鏈霉菌(streptomyces?tuirus)(wp_190899118.1)、鏈霉菌屬物種nrrls-475(wp_030838074.1)、夏威夷鏈霉菌(streptomyces?hawaiiensis)(wp_175432717.1)、淺絳紅鏈霉菌(streptomyces?purpurascens)(wp_189723836.1)、紫花鏈霉菌(streptomyces?janthinus)(wp_193478232.1)、鏈霉菌屬物種ak010(wp_185013999.1)、藤黃灰鏈霉菌(streptomyces?luteogriseus)(wp_184910807.1)、或毛鏈霉菌(wp_189555972.1)。

87、在一個(gè)實(shí)例中，e3可以是來(lái)自以下的乙酰轉(zhuǎn)移酶：鏈霉菌屬物種(qtk16920.1?gi:2021361637)、desulfosarcina?cetonica(vtr67244.1gi:2039686980)、列文虎克氏鏈霉菌(cqr63914.1?gi:822880124)、鏈霉菌屬物種pamc?26508(agj55095.1?gi:478746515)、瘡茄病鏈霉菌87.22(cbg72817.1?gi:260649702)、天藍(lán)色鏈霉菌a3(2)(cab87221.1?gi:7544048)、紫紅鏈霉菌、耐干燥假關(guān)節(jié)桿菌(pseudarthrobacter?siccitolerans)(ccq47788.1?gi:635350230)、產(chǎn)二素鏈霉菌(cal18384.1?gi:115501978)、節(jié)桿菌屬物種(arthrobactersp.)9ax(vxb93179.1?gi:17893988879、產(chǎn)二素鏈霉菌atcc?23877(akz55868.1?gi:917649199)、甲酸鏈霉菌(atl27941.1gi:1259310060)、orrelladioscoreae(soe50046.1?gi:1253556130)、擬諾卡氏屬物種jb363(sio88002.1?gi:1143070537)、orrella?dioscoreae(sbt27366.1?gi:1037119874)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(cum41035.1gi:932870024)、按蚊伊麗莎白菌(elizabethkingia?anophelis)nuhp1(ail46075.1?gi:675104782)、木糖氧化無(wú)色桿菌(achromobacter?xylosoxidans)nbrc15126＝atcc?27061(ahc47452.1?gi:566051779)、desulfosarcina?cetonica(vtr65358.1gi:2039688767)、desulfosarcina?cetonica(vtr65683.1?gi:2039688264)、desulfosarcina?cetonica(vtr64064.1?gi:2039690162)、desulfosarcina?cetonica(vtr64557.1gi:2039689733)、desulfosarcina?cetonica(vtr64494.1?gi:2039689672)、desulfosarcina?cetonica(vtr65495.1?gi:2039688584)、desulfosarcina?cetonica(vtr65880.1?gi:2039688461)、desulfosarcina?cetonica(vtr65802.1?gi:2039688383)、desulfosarcina?cetonica(vtr67337.1gi:2039686714)、desulfosarcina?cetonica(vtr67722.1?gi:2039686548)、desulfosarcina?cetonica(vtr67458.1?gi:2039686284)、desulfosarcina?cetonica(tr67453.1?gi:2039686279)、desulfosarcina?cetonica(vtr68479.1?gi:2039685800)、desulfosarcina?cetonica(vtr68453.1gi:2039685774)、desulfosarcina?cetonica(vtr69949.1?gi:2039683894)、desulfosarcina?cetonica(vtr70394.1?gi:2039683642)、desulfosarcina?cetonica(vtr70461.1?gi:2039683453)、desulfosarcina?cetonica(vtr70443.1?gi:2039683435)、簡(jiǎn)單脂肪桿菌(pimelobactersimplex)(aiy15770.1?gi:723622294)、鏈霉菌屬物種nl15-2k(cb49136.1gi:1493708163)、馬氏水纖細(xì)桿菌(aquitalea?magnusonii)(bbf86346.1gi:1435241518)、小單孢菌屬物種b006(axo35036.1?gi:1450456452)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(alo08593.1?gi:952470255)、波卓鏈霉菌atcc?25435(emf50429.1?gi:456384851)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌atcc10712(cca55858.1?gi:328882619)、黑腹果蠅(drosophila?melanogaster)(caa17683.1gi:2924547)、desulfosarcina?cetonica(vtr64151.1gi:2039689961)、desulfosarcinacetonica(vtr64706.1?gi:2039689502)、desulfosarcina?cetonica(vtr65910.1?gi:2039688142)、desulfosarcina?cetonica(vtr65903.1?gi:2039688135)、desulfosarcinacetonica(vtr68069.1?gi:2039685916)、desulfosarcina?cetonica(vtr69458.1gi:2039684725)、desulfosarcina?cetonica(vtr63766.1?gi:2039690355)、desulfosarcinacetonica(vtr64871.1?gi:2039689205)、desulfosarcina?cetonica(vtr64990.1?gi:2039688983)、desulfosarcina?cetonica(vtr65346.1?gi:2039688755)、desulfosarcinacetonica(vtr65983.1gi:2039688006)、desulfosarcina?cetonica(vtr66132.1?gi:2039687832)、desulfosarcina?cetonica(vtr67865.1?gi:2039686223)、desulfosarcinacetonica(vtr67945.1?gi:2039686120)、desulfosarcina?cetonica(vtr68557.1?gi:2039685499)、desulfosarcina?cetonica(vtr69047.1gi:2039685372)、desulfosarcinacetonica(vtr68952.1?gi:2039685277)、desulfosarcina?cetonica(vtr69234.1?gi:2039684917)、desulfosarcina?cetonica(vtr69164.1?gi:2039684847)、desulfosarcinacetonica(vtr69124.1?gi:2039684807)、desulfosarcina?cetonica(vtr69451.1gi:2039684718)、desulfosarcina?cetonica(vtr69548.1?gi:2039684504)、desulfosarcinacetonica(vtr70126.1?gi:2039684068)、desulfosarcina?cetonica(vtr70315.1?gi:2039683696)、desulfosarcina?cetonica(vtr70566.1?gi:2039683558)、馬來(lái)西亞鏈霉菌(streptomyces?malaysiensis)(atl84885.1?gi:1266921847)、極暗黃鏈霉菌dsm?40593(agk77333.1?gi:485094150)、大洋短桿菌(wp_181273085.1)、短桿菌屬物種hy170(wp_231442296.1)、短桿菌屬物種fme17(wp_193096435.1)、乳酪短桿菌(wp_009376215.1)、本色短桿菌(wp_167198399.1)、brevibacterium?atlanticum(wp_166973259.1)、短桿菌屬(wp_137827008.1)、短桿菌屬物種s22(tgd29889.1)、表皮短桿菌(wp_098731557.1)、擴(kuò)展短桿菌(hjf75768.1)、短桿菌屬物種ls14(wp_131248027.1)、短桿菌屬物種vcm10(wp_025776856.1)、短桿菌屬物種ucma?11752(wp_235350998.1)、彼爾姆短桿菌(wp_173151748.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_125240720.1)、brevibacteriumaurantiacum(wp_193078849.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_096145960.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_114384949.1)、西里古里短桿菌(wp_092011616.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_096160424.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_193086563.1)、短桿菌屬物種'marine'(wp_169252963.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_135446718.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_193084516.1)、海洋短桿菌(wp_167950434.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_101639105.1)、brevibacteriumlimosum(wp_166822893.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_096167624.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_143924263.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_096178868.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_096157397.1)、brevibacteriumaurantiacum(wp_096163052.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_009883550.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_069600709.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_101557621.1)、乳酪短桿菌(wp_119296729.1)、短桿菌屬物種cfh?10365(wp_152347364.1)、brevibacterium?aurantiacum(wp_101598306.1)、乳酪短桿菌(wp_082834881.1)、乳酪短桿菌(wp_144588711.1)、agreia?bicolorata(wp_078715081.1)、短桿菌屬物種smbl_hhyl_hb1(wp_212129586.1)、乳酪短桿菌(kze22294.1)、乳酪短桿菌(wp_232623671.1)、乳酪短桿菌(qqb16215.1)、agreia?bicolorata(wp_044440798.1)、膿腫分枝桿菌膿腫亞種(mycobacteroides?abscessus?subsp.abscessus)(sih96297.1)、乳酪短桿菌(wp_101624625.1)、乳酪短桿菌(wp_190247010.1)、短桿菌屬物種s111(wp_135540312.1)、短桿菌屬物種w7.2(wp_211979250.1)、干燥棒狀桿菌(slm95104.1gi:1188028261)，或者來(lái)自具有以下登錄號(hào)的植物宏基因組：go10018.1?gi:1613564736、vfr50243.1?gi:1591769475、vfr49444.1gi:1591759418、vfr42273.1?gi:1591739264、vfr87867.1gi:1591734832、vfr79172.1?gi:1591731713、vfr90674.1gi:1591727121、vfr73697.1?gi:1591713709、vfr35670.1gi:1591707861、vfr17966.1?gi:1591706236、vfr24793.1gi:1591690017、或vfr74915.1?gi:1591683123。

88、在另一個(gè)實(shí)例中，e3可以是來(lái)自以下的去鐵胺鐵載體生物合成蛋白dfoc：成團(tuán)泛菌(awd37890.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187507962.1)、成團(tuán)泛菌(hat00136.1)、成團(tuán)泛菌(wp_010247060.1)、成團(tuán)泛菌(wp_201500586.1)、成團(tuán)泛菌(wp_124890596.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187496373.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163852072.1)、成團(tuán)泛菌(wp_154210121.1)、成團(tuán)泛菌(wp_033760513.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187512465.1)、成團(tuán)泛菌(wp_207253898.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187495053.1)、成團(tuán)泛菌(wp_060679208.1)、泛菌屬物種ekm10t(wp_167430078.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187500286.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187492242.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163763414.1)、成團(tuán)泛菌(wp_122459787.1)、成團(tuán)泛菌(wp_061902164.1)、pantoea?vagans(wp_061703165.1)、成團(tuán)泛菌(mbs7708200.1)、泛菌屬(wp_159226815.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187513802.1)、pantoeavagans(wp_050679331.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187484792.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163799890.1)、泛菌屬物種ova07a(wp_223565934.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191917404.1)、成團(tuán)泛菌(wp_033773381.1)、成團(tuán)泛菌(wp_064690802.1)、成團(tuán)泛菌(wp_111534208.1)、成團(tuán)泛菌(wp_223564415.1)、成團(tuán)泛菌(wp_129063349.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191920297.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163641337.1)、成團(tuán)泛菌(wp_022624353.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187492906.1)、成團(tuán)泛菌(wp_157353121.1)、泛菌屬物種(rzk07467.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191914122.1)、成團(tuán)泛菌(wp_045140091.1)、泛菌屬物種ekm20t(wp_167433056.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187501430.1)、泛菌屬(wp_167423161.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191921680.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163658684.1)、成團(tuán)泛菌(wp_172608645.1)、成團(tuán)泛菌(wp_192073070.1)、泛菌屬物種cfsan033090(wp_052270704.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187511066.1)、成團(tuán)泛菌(wp_158149880.1)、成團(tuán)泛菌(wp_132499089.1)、成團(tuán)泛菌(mbt8497800.1)、植物短小桿菌(curtobacterium?plantarum)(wp_122889392.1)、成團(tuán)泛菌(wp_192033741.1)、成團(tuán)泛菌(wp_033768945.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187515506.1)、成團(tuán)泛菌(wp_182505410.1)、成團(tuán)泛菌(wp_182500640.1)、成團(tuán)泛菌(wp_158132336.1)、成團(tuán)泛菌(wp_010670384.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187506786.1)、成團(tuán)泛菌(wp_179256483.1)、成團(tuán)泛菌(wp_115765004.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191922816.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191914536.1)、成團(tuán)泛菌(awd37885.1)、成團(tuán)泛菌(wp_033780267.1)、成團(tuán)泛菌(wp_062758877.1)、成團(tuán)泛菌(wp_115388310.1)、成團(tuán)泛菌(wp_089414760.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191918109.1)、成團(tuán)泛菌(wp_137228077.1)、成團(tuán)泛菌(wp_039389954.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191924048.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191920726.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163845109.1)、泛菌屬物種paga(wp_143990819.1)、成團(tuán)泛菌(wp_031590726.1)、成團(tuán)泛菌(wp_143789436.1)、pantoeavagans(wp_083069696.1)、成團(tuán)泛菌(wp_033787056.1)、成團(tuán)泛菌(wp_208003520.1)、成團(tuán)泛菌(wp_235765353.1)、側(cè)耳泛菌(pantoea?pleuroti)(wp_182686862.1)、成團(tuán)泛菌(wp_069026761.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163638696.1)、成團(tuán)泛菌(wp_208442935.1)、成團(tuán)泛菌(wp_207091826.1)、成團(tuán)泛菌(wp_064702866.1)、成團(tuán)泛菌(wp_086906737.1)、成團(tuán)泛菌(key40395.1)、泛菌屬物種ov426(wp_090965308.1)、泛菌屬(wp_150037408.1)、桉樹(shù)泛菌(awd37908.1)、泛菌屬(wp_150011559.1)、泛菌屬物種wmus005(wp_179898291.1)、桉樹(shù)泛菌(awd37911.1)、pantoea?vagans(wp_161736340.1)、解淀粉歐文氏菌(wp_004160308.1)、解淀粉歐文氏菌(qjq67970.1?gi:1839296356)、解淀粉歐文氏菌(qjq64271.1gi:1839292579)、解淀粉歐文氏菌(qjq60469.1?gi:1839288766)、解淀粉歐文氏菌(qjq56770.1?gi:1839285065)、解淀粉歐文氏菌(qjq53072.1?gi:1839281365)、卡氏致病桿菌(xenorhabdus?cabanillasii)jm26(phm78217.1?gi:1269095937)、卡氏致病桿菌jm26(phm78208.1?gi:1269095928)、xenorhabdus?hominickii(phm56127.1gi:1269072847)、xenorhabdus?mauleonii(phm37952.1?gi:1269054189)、xenorhabdus?mauleonii(phm37944.1?gi:1269054181)、xenorhabdus?budapestensis(phm29821.1?gi:1269045843)、xenorhabdus?budapestensis(phm29812.1?gi:1269045834)、解淀粉歐文氏菌cfbp1430(cba23308.1?gi:291555140)、沙梨歐文氏菌dsm?12163(cay75871.1gi:283479955)、解淀粉歐文氏菌la637(cdk23310.1?gi:566688504)、解淀粉歐文氏菌la636(cdk19939.1?gi:565455063)、解淀粉歐文氏菌la635(cdk16572.1?gi:565423714)、變黑梨花歐文氏菌cfbp?5888(ccg88689.1?gi:560105768)、解淀粉歐文氏菌mr1(ccp08595.1gi:478726734)、解淀粉歐文氏菌ea644(ccp04532.1?gi:478723237)、解淀粉歐文氏菌upn527(ccp00585.1?gi:478719346)、解淀粉歐文氏菌nbrc?12687＝cfbp?1232(cco95265.1?gi:478715307)、解淀粉歐文氏菌01sfr-bo(cco91470.1?gi:478711918)、解淀粉歐文氏菌cfbp2585(cco87679.1?gi:478708144)、解淀粉歐文氏菌ea266(cco83917.1gi:478703932)、解淀粉歐文氏菌ea356(cco80113.1?gi:478700098)、解淀粉歐文氏菌acw56400(ekv52685.1gi:426274945)、或解淀粉歐文氏菌atcc?baa-2158(cbx82136.1?gi:312173882)。

89、特別地，e3選自來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌的desc，來(lái)自毛鏈霉菌、紫紅鏈霉菌的desc，來(lái)自干燥棒狀桿菌、成團(tuán)泛菌或解淀粉歐文氏菌的desc蛋白的n末端結(jié)構(gòu)域。更特別地，e3選自天藍(lán)色鏈霉菌、紫紅鏈霉菌、毛鏈霉菌(wp_189555972.1)、干燥棒狀桿菌(slm95104.1gi:1188028261)、成團(tuán)泛菌(awd37890.1)和解淀粉歐文氏菌(wp_004160308.1)。甚至更特別地，e3包含相對(duì)于seq?id?no:5(e3a)、seq?id?no:17(e3b)、seq?id?no:27(e3c)，seq?id?no46(e3d)的n末端結(jié)構(gòu)域、或seq?id?no:40(e3e)或seq?id?no:34(e3f)至少70％的序列同一性。

90、根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞進(jìn)一步遺傳修飾為或包含進(jìn)一步的遺傳修飾，所述進(jìn)一步的遺傳修飾相對(duì)于野生型細(xì)胞增加選自以下的至少一種e4酶的表達(dá)：

91、-能夠?qū)5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸轉(zhuǎn)換為去鐵胺b或h的去鐵胺合成酶(ec?6.3.-.-)(e4i)；

92、-能夠?qū)5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸轉(zhuǎn)換為至少一種去鐵胺的去鐵胺合成酶(ec?6.3.-.-)(e4ii)；

93、-能夠?qū)5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸轉(zhuǎn)換為比蘇卡林b的比蘇卡林合成酶(ec?6.3.-.-)(e4iii)；和

94、-能夠?qū)5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸轉(zhuǎn)換為比蘇卡林的比蘇卡林合成酶(ec?6.3.-.-)(e4iv)。

95、特別地，e4i、e4ii、e4iii或e4iv還可以被稱(chēng)為去鐵胺e生物合成蛋白(desd)，其通常來(lái)自鐵載體合成酶超家族，組c，鐵載體合成酶組分，連接酶。e4i、e4ii、e4iii或e4iv還可以被稱(chēng)為iuca/iucc家族鐵載體生物合成蛋白。特別地，e4i、e4ii、e4iii或e4iv可以是來(lái)自以下的desd：天藍(lán)色鏈霉菌(nuv53721.1)、鏈霉菌屬物種i5(wp_199217166.1)、鏈霉菌屬物種pam3c(wp_216716553.1)、鏈霉菌屬物種zs0098(wp_122217405.1)、酒紅鏈霉菌(mql65620.1)、鏈霉菌屬物種rk31(wp_210906076.1)、鏈霉菌屬物種e1n211(wp_114873828.1)、變異鏈霉菌(wp_189366531.1)、鏈霉菌屬物種hns054(wp_048457761.1)、嗜酸放線(xiàn)線(xiàn)束菌(nea78436.1)、鏈霉菌屬物種e2n171(wp_121720278.1)、鏈霉菌屬物種z38(wp_156699444.1)、鏈霉菌屬物種i4(2020)(wp_199206418.1)、鏈霉菌屬物種bse7-9(wp_199215200.1)、鏈霉菌屬物種sms_su21(wp_102641628.1)、鏈霉菌屬物種mnu103(wp_230228103.1)、馬特鏈霉菌(ggt60866.1)、灰略紅鏈霉菌(ggq93410.1)、異硫霉素鏈霉菌(ggq52613.1)、嗜酸放線(xiàn)線(xiàn)束菌(wp_203550771.1)、鏈霉菌屬物種4f(alv50330.1)、嗜酸放線(xiàn)線(xiàn)束菌(wp_163087759.1)、灰略紅鏈霉菌(wp_037639707.1)、鏈霉菌屬物種di50b(scd87662.1)、鏈霉菌屬(wp_167741844.1)、鏈霉菌屬物種f-7(wp_093767213.1)、白淺灰鏈霉菌(ghc05289.1)、纖維素鏈霉菌(ghe36661.1)、韋臘鏈霉菌(ghe82670.1)、鏈霉菌屬物種dh20(wp_228916771.1)、韋臘鏈霉菌(wp_225641487.1)、韋臘鏈霉菌(wp_225629337.1)、唐德鏈霉菌(wp_150156578.1)、假灰鏈霉菌(wp_225654118.1)、鏈霉菌屬物種nrrl?f-5527(wp_031060221.1)、鏈霉菌屬物種t12(wp_145827641.1)、鏈霉菌屬物種geseq-13(wp_210633990.1)、滅癌素鏈霉菌(streptomyces?gancidicus)(wp_006131549.1)、鏈霉菌屬物種nrrl?s-1314(wp_031017402.1)、鏈霉菌屬(wp_215209976.1)、假灰鏈霉菌組8wp_189406281.19、鏈霉菌屬(wp_028959208.1)、鏈霉菌屬物種s-9(wp_203350072.1)、鏈霉菌屬物種mcg8(wp_215188574.1)、鏈霉菌屬(wp_019525182.1)、鏈霉菌屬物種dh-12(wp_106414112.1)、摩洛哥鏈霉菌(wp_149548375.1)、孔雀石褐鏈霉菌(wp_190164277.1)、鏈霉菌屬(wp_142195204.1)、禿裸鏈霉菌(wp_142232870.1)、鏈霉菌屬物種sm1(wp_103541520.1)、豐加鏈霉菌(wp_037931697.1)、鏈霉菌屬物種chd11(wp_215205174.1)、鏈霉菌屬(wp_030825118.1)、鏈霉菌屬物種nrrl?s-37(wp_030869328.1)、鏈霉菌屬物種ac558_rss880(wp_217127651.1)、鏈霉菌屬物種dh5(wp_228966782.1)、毛鏈霉菌(wp_189555973.1)、毛鏈霉菌(wp_189595561.1)、灰黃鏈霉菌(wp_190095096.1)、鏈霉菌屬物種nrrl?wc-3626(wp_030217188.1)、鏈霉菌屬物種13-12-16(wp_085570643.1)、微管螺旋鏈霉菌(wp_145869101.1)、灰黃鏈霉菌(wp_004931111.1)、鏈霉菌屬物種cb02400(wp_073931736.1)、鏈霉菌屬物種slbn-134(wp_142170640.1)、鏈霉菌屬(wp_125506338.1)、鏈霉菌屬物種na02536(wp_176117313.1)、殺真菌素鏈霉菌(wp_121546082.1)、列文虎克氏鏈霉菌(wp_048573206.1)、列文虎克氏鏈霉菌(wp_029382123.1)、白丘鏈霉菌(wp_184760469.1)、綠產(chǎn)色鏈霉菌(wp_048584025.1)、綠產(chǎn)色鏈霉菌(wp_053200122.1)、鏈霉菌屬(wp_215154693.1)、綠產(chǎn)色鏈霉菌(wp_004001039.1)、鏈霉菌屬物種isl-14(mbt2673677.1)、藍(lán)灰鏈霉菌(streptomyces?cyaneogriseus)(wp_044381715.1)、灰色霉素鏈霉菌(streptomyces?griseomycini)(wp_193473351.1)、箭毒鏈霉菌(wp_062155921.1)、鏈霉菌屬物種uw30(wp_147999450.1)、黑藍(lán)鏈霉菌(streptomycescaeruleatus)(wp_062720821.1)、streptomyces?harenosi(wp_164393243.1)、灰草黃鏈霉菌(streptomyces?griseostramineus)(wp_184825094.1)、雙色鏈霉菌(streptomycesbicolor)(wp_031478546.1)、streptomyces?regali(wp_062703122.1)、鏈霉菌屬物種cf386(wp_093908265.1)、遠(yuǎn)青鏈霉菌(streptomyces?azureus)(wp_059420174.1)、教酒色鏈霉菌(wp_150502416.1)、streptomyces?swartbergensis(wp_086603881.1)、鏈霉菌屬物種cb02414(wp_073723308.1)、教酒色鏈霉菌(wp_176577001.1)、鏈霉菌屬物種ks_5(wp_030944363.1)、鏈霉菌屬物種tu102(wp_214335617.1)、鏈霉菌屬物種(nut26959.1)、streptomyces?cyaneochromogenes(wp_126392412.1)、刺疣鏈霉菌(wp_196462534.1)、鏈霉菌屬物種hgb0020(wp_016434996.1)、天藍(lán)微紅鏈霉菌(wp_150481013.1)、鏈霉菌屬物種trm?s81-3(wp_188181662.1)、甲酸鏈霉菌(atl27942.1gi:1259310061)、藤黃微球菌(micrococcus?luteus)mu201(sjn33943.1gi:1145375606)、嗜中溫粘著桿菌(tenacibaculum?mesophilum)(bax07670.1?gi:1172208181)、嗜中溫粘著桿菌(bax07668.1gi:1172208179)、γ-變形菌綱(gammaproteobacteria)細(xì)菌(bal45578.1gi:371940279)、擬諾卡氏屬菌物種jb363(sio88003.1?gi:1143070538)、腸桿菌科細(xì)菌(enterobacteriaceae?bacterium)bta3-1(ajr02043.1gi:764043809)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(cum41034.1?gi:932870023)、按蚊伊麗莎白菌nuhp1(ail46076.1?gi:675104783)、鏈霉菌屬物種pamc?26508(agj55096.1?gi:478746516)、鹽單胞菌屬物種(halomonassp.)td01(cah1042919.1gi:2174847834)、干燥棒狀桿菌(slm95104.1gi:1188028261)、鏈霉菌屬物種cs113(wp_087809199.1gi:1205101816)、花青藍(lán)鏈霉菌(streptomyces?anthocyanicus)(wp_189283040.1gi:1906517697)、鏈霉菌屬(wp_161377959.1gi:1801827430)、鏈霉菌屬(wp_121702379.1gi:1495472518)、鏈霉菌屬物種lbum?1480(qtu54121.1?gi:2025348499)、灰褐鏈霉菌(streptomyces?griseofuscus)(qnt95273.1?gi:1906918764)、鏈霉菌屬(wp_106517219.1gi:1370674867)、花青藍(lán)鏈霉菌(wp_191849566.1gi:1912958734)、唐德鏈霉菌(wp_189742138.1gi:1907050264)、鏈霉菌屬(wp_164410815.1gi:1817780094)、林肯鏈霉菌(streptomyces?lincolnensis)(qmv07193.1gi:1886115140)、天藍(lán)色鏈霉菌(qkn66532.1?gi:1851833442)、唐德鏈霉菌(wp_164458103.1gi:1817832929)、紅灰鏈霉菌(streptomyces?rubrogriseus)(wp_164277235.1gi:1817618112)、鏈霉菌屬物種sid10362(wp_165285357.1gi:1819611045)、鏈霉菌屬(wp_030400073.1gi:663404431)、鏈霉菌屬(wp_011028585.1gi:499338877)、唐德鏈霉菌(wp_159327807.1gi:1797887667)、天藍(lán)色鏈霉菌a3(2)(qfi42889.1?gi:1759037058)、鏈霉菌屬(wp_093456207.1gi:1225447207)、鏈霉菌屬物種lra12(wp_136207792.1gi:1621656934)、鏈霉菌屬物種e5n91(wp_121709362.1gi:1495480291)、紅灰鏈霉菌(wp_109032792.1gi:1389010967)、鏈霉菌屬物種mh60(wp_104632151.1gi:1351098821)、淀粉酶鏈霉菌(streptomyces?diastaticus)(wp_102929444.1gi:1332972289)、鏈霉菌屬物種m1013(wp_076974458.1gi:1141434617)、暗灰鏈霉菌(streptomyces?canus)(wp_059300524.1gi:976140927)、紫紅鏈霉菌(wp_030866491.1gi:664338305)、鏈霉菌屬(wp_003976015.1gi:490073840)、甘薯鏈霉菌(streptomycesipomoeae)(tqe33528.1gi:1697190356)、甘薯鏈霉菌(tqe25637.1?gi:1697182207)、streptomyces?sporangiiformans(tpq23018.1?gi:1693045467)、鏈霉菌屬物種akac8(thc55740.1?gi:1616616223)、鏈霉菌屬物種lra12(tha97810.1?gi:1616076702)、鏈霉菌屬物種h23(wp_134652861.1gi:1604860203)、灰綠鏈霉菌(streptomyces?griseoviridis)(azs87080.1gi:1547213271)、木糖氧化無(wú)色桿菌nbrc?15126＝atcc?27061(ahc47453.1gi:566051780)、淺青紫鏈霉菌(streptomyces?lividans)1326(eoy47845.1?gi:509518532)、山丘鏈霉菌(uja16738.1gi:2179595515)、山丘鏈霉菌(uja08397.1?gi:2179587162)、streptomyces?hyderabadensis(wp_226024665.1gi:2112773893)、鏈霉菌屬物種s10(2018)(wp_127893570.1gi:1553510828)、鏈霉菌屬物種nl15-2k(gcb49135.1?gi:1493708162)、瘡茄病鏈霉菌87.22(cbg72816.1?gi:260649701)、小單孢菌屬物種b006(axo35037.1gi:1450456453)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(alo08594.1?gi:952470256)、短狀桿菌屬物種sw0106-09(gap78407.1?gi:926973312)、假交替單胞菌屬物種(pseudoalteromonassp.)sw0106-04(gap73945.1gi:924441201)、按蚊伊麗莎白菌(kmu63886.1?gi:874590592)、或委內(nèi)瑞拉鏈霉菌atcc?10712(cca55859.1?gi:328882620)。

96、在另一個(gè)實(shí)例中，e4i、e4ii、e4iii或e4iv還可以被稱(chēng)為鏈a或b，去鐵胺e生物合成蛋白desd。在該實(shí)例中，desd可能是具有登錄號(hào)6xrc_bgi:1950842083或6xrc_a?gi:1950842082或6nl2_b?gi:179970866或6nl2_a?gi:1799708661的序列。desd也可能來(lái)自actinokineospora?spheciospongiae(ewc61612.1?gi:583002104)、簡(jiǎn)單脂肪桿菌(iy15768.1?gi:723622292)、馬氏水纖細(xì)桿菌(bbf86345.1gi:1435241517)或鹽水球形菌屬物種(salinisphaera?sp.)lb1(awn17872.1?gi:1393627878)。

97、在另外一個(gè)實(shí)例中，e4i、e4ii、e4iii或e4iv還可以被稱(chēng)為去鐵胺e生物合成蛋白desc作為鐵載體合成酶的小組分，乙酰轉(zhuǎn)移酶。desc可能來(lái)自具有以下登錄號(hào)的植物宏基因組：vgo10018.1?gi:1613564736、vfr50243.1?gi:1591769475、vfr49444.1?gi:1591759418、vfr42273.1gi:1591739264、vfr87867.1?gi:1591734832、vfr79172.1gi:1591731713、vfr90674.1?gi:1591727121、vfr73697.1gi:1591713709、vfr35670.1?gi:1591707861、vfr17966.1gi:1591706236、vfr24793.1?gi:1591690017、或vfr74915.1gi:1591683123，或者來(lái)自蟻鏈霉菌(streptomyces?formicae)(atl27941.1?gi:1259310060)、orrelladioscoreae(soe50046.1gi:1253556130)、擬諾卡氏菌屬物種jb363(sio88002.1gi:1143070537)、orrella?dioscoreae(sbt27366.1?gi:1037119874)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(cum41035.1?gi:932870024)、按蚊伊麗莎白菌nuhp1(ail46075.1?gi:675104782)、木糖氧化無(wú)色桿菌nbrc?15126＝atcc?27061(ahc47452.1?gi:566051779)、淺青紫鏈霉菌1326(eoy47844.1gi:509518531)、鏈霉菌屬物種pamc?26508(agj55095.1gi:478746515)、簡(jiǎn)單脂肪桿菌(aiy15770.1?gi:723622294)、鏈霉菌屬物種nl15-2k(gcb49136.1?gi:1493708163)、或馬氏水纖細(xì)桿菌(bbf86346.1?gi:1435241518)。

98、在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)例中，e4i、e4ii、e4iii或e4iv還可以被稱(chēng)為具有登錄號(hào)5o7o_d?gi:1351638365的鏈d，去鐵胺鐵載體生物合成蛋白dfoc，或者具有登錄號(hào)5o7o_c?gi:1351638364的鏈c，去鐵胺鐵載體生物合成蛋白dfoc，或者具有登錄號(hào)5o7o_b?gi:1351638363的鏈b，去鐵胺鐵載體生物合成蛋白dfoc，或者具有登錄號(hào)5o7o_a?gi:1351638362的鏈a，去鐵胺鐵載體生物合成蛋白dfoc，或者來(lái)自以下的去鐵胺鐵載體生物合成蛋白dfoc：成團(tuán)泛菌(awd37890.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187507962.1)、成團(tuán)泛菌(hat00136.1)、成團(tuán)泛菌(wp_010247060.1)、成團(tuán)泛菌(wp_201500586.1)、成團(tuán)泛菌(wp_124890596.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187496373.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163852072.1)、成團(tuán)泛菌(wp_154210121.1)、成團(tuán)泛菌(wp_033760513.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187512465.1)、成團(tuán)泛菌(wp_207253898.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187495053.1)、成團(tuán)泛菌(wp_060679208.1)、泛菌屬物種ekm10t(wp_167430078.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187500286.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187492242.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163763414.1)、成團(tuán)泛菌(wp_122459787.1)、成團(tuán)泛菌(wp_061902164.1)、pantoea?vagans(wp_061703165.1)、成團(tuán)泛菌(mbs7708200.1)、泛菌屬(wp_159226815.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187513802.1)、pantoea?vagans(wp_050679331.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187484792.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163799890.1)、泛菌屬物種ova07a(wp_223565934.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191917404.1)、成團(tuán)泛菌(wp_033773381.1)、成團(tuán)泛菌(wp_064690802.1)、成團(tuán)泛菌(wp_111534208.1)、成團(tuán)泛菌(wp_223564415.1)、成團(tuán)泛菌(wp_129063349.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191920297.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163641337.1)、成團(tuán)泛菌(wp_022624353.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187492906.1)、成團(tuán)泛菌(wp_157353121.1)、泛菌屬物種(rzk07467.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191914122.1)、成團(tuán)泛菌(wp_045140091.1)、泛菌屬物種ekm20t(wp_167433056.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187501430.1)、泛菌屬(wp_167423161.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191921680.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163658684.1)、成團(tuán)泛菌(wp_172608645.1)、成團(tuán)泛菌(wp_192073070.1)、泛菌屬物種cfsan033090(wp_052270704.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187511066.1)、成團(tuán)泛菌(wp_158149880.1)、成團(tuán)泛菌(wp_132499089.1)、成團(tuán)泛菌(mbt8497800.1)、植物短小桿菌(wp_122889392.1)、成團(tuán)泛菌(wp_192033741.1)、成團(tuán)泛菌(wp_033768945.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187515506.1)、成團(tuán)泛菌(wp_182505410.1)、成團(tuán)泛菌(wp_182500640.1)、成團(tuán)泛菌(wp_158132336.1)、成團(tuán)泛菌(wp_010670384.1)、成團(tuán)泛菌(wp_187506786.1)、成團(tuán)泛菌(wp_179256483.1)、成團(tuán)泛菌(wp_115765004.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191922816.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191914536.1)、成團(tuán)泛菌(awd37885.1)、成團(tuán)泛菌(wp_033780267.1)、成團(tuán)泛菌(wp_062758877.1)、成團(tuán)泛菌(wp_115388310.1)、成團(tuán)泛菌(wp_089414760.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191918109.1)、成團(tuán)泛菌(wp_137228077.1)、成團(tuán)泛菌(wp_039389954.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191924048.1)、成團(tuán)泛菌(wp_191920726.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163845109.1)、泛菌屬物種paga(wp_143990819.1)、成團(tuán)泛菌(wp_031590726.1)、成團(tuán)泛菌(wp_143789436.1)、pantoeavagans(wp_083069696.1)、成團(tuán)泛菌(wp_033787056.1)、成團(tuán)泛菌(wp_208003520.1)、成團(tuán)泛菌(wp_235765353.1)、側(cè)耳泛菌(wp_182686862.1)、成團(tuán)泛菌(wp_069026761.1)、成團(tuán)泛菌(wp_163638696.1)、成團(tuán)泛菌(wp_208442935.1)、成團(tuán)泛菌(wp_207091826.1)、成團(tuán)泛菌(wp_064702866.1)、成團(tuán)泛菌(wp_086906737.1)、成團(tuán)泛菌(key40395.1)、泛菌屬物種ov426(wp_090965308.1)、泛菌屬(wp_150037408.1)、桉樹(shù)泛菌(awd37908.1)、泛菌屬(wp_150011559.1)、泛菌屬物種wmus005(wp_179898291.1)、桉樹(shù)泛菌(awd37911.1)、pantoeavagans(wp_161736340.1)、解淀粉歐文氏菌(qjq67970.1?gi:1839296356)、解淀粉歐文氏菌(qjq64271.1gi:1839292579)、解淀粉歐文氏菌(qjq60469.1?gi:1839288766)、解淀粉歐文氏菌(qjq56770.1?gi:1839285065)、解淀粉歐文氏菌(qjq53072.1?gi:1839281365)、解淀粉歐文氏菌(wp_004160308.1)、解淀粉歐文氏菌cfbp1430(5o7o_a)、解淀粉歐文氏菌(qjq53072.1)、解淀粉歐文氏菌nbrc?12687＝cfbp?1232(gaj89919.1)、解淀粉歐文氏菌(wp_168428660.1)、解淀粉歐文氏菌(wp_099350829.1)、解淀粉歐文氏菌(wp_168384929.1)、解淀粉歐文氏菌(wp_168404295.1)、解淀粉歐文氏菌mr1(ccp08595.1)、解淀粉歐文氏菌(wp_004171023.1)、解淀粉歐文氏菌(wp_168402725.1)、解淀粉歐文氏菌(wp_168394396.1)、歐文氏菌屬物種ejp617(adp10409.1)、歐文氏菌屬物種ejp617(wp_041474304.1)、沙梨歐文氏菌(wp_012669441.1)、變黑梨花歐文氏菌(wp_023656445.1)、塔斯曼尼亞歐文氏菌(wp_012442727.1)、卡氏致病桿菌jm26(phm78217.1?gi:1269095937)、卡氏致病桿菌jm26(phm78208.1gi:1269095928)、xenorhabdus?hominickii(phm56127.1gi:1269072847)、xenorhabdus?mauleonii(phm37952.1?gi:1269054189)、xenorhabdus?mauleonii(phm37944.1?gi:1269054181)、xenorhabdus?budapestensis(phm29821.1?gi:1269045843)、xenorhabdus?budapestensis(phm29812.1?gi:1269045834)、解淀粉歐文氏菌cfbp1430(cba23308.1?gi:291555140)、沙梨歐文氏菌dsm12163(cay75871.1gi:283479955)、解淀粉歐文氏菌la637(cdk23310.1?gi:566688504)、解淀粉歐文氏菌la636(cdk19939.1?gi:565455063)、解淀粉歐文氏菌la635(cdk16572.1?gi:565423714)、變黑梨花歐文氏菌cfbp?5888(ccg88689.1?gi:560105768)、解淀粉歐文氏菌mr1(ccp08595.1gi:478726734)、解淀粉歐文氏菌ea644(ccp04532.1?gi:478723237)、解淀粉歐文氏菌upn527(ccp00585.1?gi:478719346)、解淀粉歐文氏菌nbrc?12687＝cfbp?1232(cco95265.1?gi:478715307)、解淀粉歐文氏菌01sfr-bo(cco91470.1?gi:478711918)、解淀粉歐文氏菌cfbp?2585(cco87679.1?gi:478708144)、解淀粉歐文氏菌ea266(cco83917.1gi:478703932)、解淀粉歐文氏菌ea356(cco80113.1?gi:478700098)、解淀粉歐文氏菌acw56400(ekv52685.1?gi:426274945)、或解淀粉歐文氏菌atcc?baa-2158(cbx82136.1?gi:312173882)。

99、特別地，e4ii或e4iv選自來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌的desd、來(lái)自紫紅鏈霉菌的desd、來(lái)自毛鏈霉菌的desd、來(lái)自嗜中溫粘著桿菌的iuca/iucc、來(lái)自干燥棒狀桿菌的desc蛋白的c末端結(jié)構(gòu)域、來(lái)自解淀粉歐文氏菌或成團(tuán)泛菌的dfoc蛋白的c末端結(jié)構(gòu)域。更特別地，e4ii或e4iv選自天藍(lán)色鏈霉菌(nuv53721.1)、紫紅鏈霉菌、毛鏈霉菌(wp_189555973.1)、解淀粉歐文氏菌(wp_004160308.1)、成團(tuán)泛菌(awd37890.1)和干燥棒狀桿菌(slm95104.1?gi:1188028261)，且甚至更特別地，e4ii或e4iv包含相對(duì)于seq?id?no:6(e4a)、seq?id?no:18(e4b)、seq?id?no:28(e4c)，seq?id?no:34(e4d)的c末端結(jié)構(gòu)域、seq?id?no:40(e4e)或seq?idno:46(e4f)至少70％的序列同一性。

100、本說(shuō)明書(shū)自始至終提到的與本發(fā)明結(jié)合陳述的登錄號(hào)對(duì)應(yīng)于日期為07.02.2022的ncbiproteinbank數(shù)據(jù)庫(kù)條目；通常，條目的版本號(hào)在此處由“數(shù)字”例如“.1”標(biāo)識(shí)。

101、在一個(gè)實(shí)例中，e4i、e4ii、e4iii和e4iv是細(xì)胞中的相同酶，并且因此，可以產(chǎn)生比蘇卡林、比蘇卡林b以及去鐵胺e、h、x1和x2的混合物。所產(chǎn)生的每種化合物的量在每個(gè)反應(yīng)中可能不同，取決于來(lái)自所使用的e4i、e4ii、e4iii和e4iv的列表中的酶和/或反應(yīng)在其中進(jìn)行的條件。在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)e3與e4(e4ii和e4iv)融合時(shí)，可以產(chǎn)生與比蘇卡林相比更多的去鐵胺e，如fujita?mj，mol.biosyst.，8，482–485(2012)和fujita?mj，biosci.biotechnol.biochem.，77(12)，2467–2472，2013中所示的。

102、特別地，細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行遺傳修飾或具有進(jìn)一步的遺傳修飾，以相對(duì)于野生型細(xì)胞增加選自以下的至少一種e4酶的活性：

103、-能夠?qū)5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸轉(zhuǎn)換為去鐵胺b或h的去鐵胺合成酶(ec?6.3.-.-)(e4i)；和

104、-能夠?qū)5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸轉(zhuǎn)換為比蘇卡林b的比蘇卡林合成酶(ec?6.3.-.-)(e4iii)

105、以產(chǎn)生至少一種式ii的化合物：

106、

107、n＝1-3

108、r1＝h或coch3或ch2ch2cox，其中x＝oh或o-

109、r2＝ch3或ch2ch2cox，其中x＝oh或o-。

110、特別地，n是2或3。

111、根據(jù)本發(fā)明的任何方面具有結(jié)構(gòu)式ii的化合物可以是去鐵胺和/或其類(lèi)似物。特別地，該化合物可以是具有式ii的去鐵胺b：

112、

113、其中

114、n＝2，r1＝h和r2＝ch3。

115、更特別地，去鐵胺b具有下式。

116、

117、在一個(gè)實(shí)例中，化合物可以是具有式ii的去鐵胺h：

118、

119、其中

120、n＝2，r1＝h和r2＝ch2ch2cox，其中x＝oh或o-。

121、去鐵胺的類(lèi)似物，結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，也稱(chēng)為化學(xué)類(lèi)似物，具有落入式ii內(nèi)的結(jié)構(gòu)并且與去鐵胺相似，但在某個(gè)成分方面與去鐵胺不同。例如，去鐵胺的類(lèi)似物可能在一個(gè)或多個(gè)原子、官能團(tuán)或子結(jié)構(gòu)方面不同，所述原子、官能團(tuán)或子結(jié)構(gòu)被其它原子、基團(tuán)或子結(jié)構(gòu)替換。結(jié)構(gòu)類(lèi)似物經(jīng)常是等電子的。

122、賴(lài)氨酸脫羧酶(e1)、尸胺n5-單加氧酶(e2)、n5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸合酶(e3)、去鐵胺/比蘇卡林合成酶(e4)以及根據(jù)本發(fā)明的任何方面提到的任何其它酶的實(shí)例，還包括與上述的那些除了取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸之外(只要其功能得到維持)具有相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“幾個(gè)”在本文中通常意指約1至7個(gè)，特別是約1至5個(gè)，更特別是約1至2個(gè)。賴(lài)氨酸脫羧酶(e1)、尸胺n5-單加氧酶(e2)、n5-氨基戊基-n-(羥基)-琥珀酰胺酸合酶(e3)、去鐵胺/比蘇卡林合成酶(e4)以及根據(jù)本發(fā)明的任何方面提到的任何其它酶各自可以是這樣的蛋白質(zhì)，其具有的氨基酸序列與原始氨基酸序列具有通常不低于70、75、80、85％、特別是不低于90％、更特別是不低于95％的序列同一性，只要其功能得到維持。

123、上述氨基酸序列中的取代、缺失、插入和/或添加特別是保守取代。原始氨基酸由另一種氨基酸保守取代的實(shí)例包括ala由ser或thr的取代；arg由gln、his或lys的取代；asn由glu、gln、lys、his或asp的取代；asp由asn、glu或gln的取代；cys由ser或ala的取代；gln由asn、glu、lys、his、asp或arg的取代；glu由asn、gln、lys或asp的取代；gly由pro的取代；his由asn、lys、gln、arg或tyr的取代；ile由leu、met、val或phe的取代；leu由ile、met、val或phe的取代；lys由asn、glu、gln、his或arg的取代；met由ile、leu、val或phe的取代；phe由trp、tyr、met、ile或leu的取代；ser由thr或ala的取代；thr由ser或ala的取代；trp由phe或tyr的取代；tyr由his、phe或trp的取代；以及val由met、ile或leu的取代。

124、特別地，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞可以進(jìn)行遺傳修飾或可以包含遺傳修飾，以包含相對(duì)于其野生型細(xì)胞選自e1、e2和e3的至少兩種其它酶的表達(dá)增加。在一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞具有e1和e2、或e1和e3、或e2和e3的活性增加。更特別地，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞可以進(jìn)行遺傳修飾或包含遺傳修飾，以包含相對(duì)于其野生型細(xì)胞酶e1、e2和e3的表達(dá)或活性增加。甚至更特別地，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞可以進(jìn)行遺傳修飾或包含遺傳修飾，以包含相對(duì)于其野生型細(xì)胞e4、e1和e2或e4、e1和e3或e4、e2和e3的活性增加。

125、甚至更特別地，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾或包含遺傳修飾，以包含相對(duì)于其野生型細(xì)胞所有四種酶e1、e2、e3和e4的表達(dá)增加。

126、根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行遺傳修飾或包含進(jìn)一步遺傳修飾，以增加l-賴(lài)氨酸和/或尸胺的產(chǎn)生。特別地，該細(xì)胞具有l(wèi)-賴(lài)氨酸和/或尸胺的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生增加。更特別地，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞中的進(jìn)一步遺傳修飾導(dǎo)致賴(lài)氨酸的產(chǎn)生增加，并且包括相對(duì)于野生型細(xì)胞下述酶e6–e19中的至少一種的表達(dá)增加或減少。更特別地，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的進(jìn)一步遺傳修飾包括下述酶中的至少一種的表達(dá)增加：

127、-丙酮酸羧化酶(ec?6.4.1.1)(e6)，

128、-天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ec?2.6.1.1)(e7)

129、-天冬氨酸激酶，特別是反饋抗性天冬氨酸激酶(ec?2.7.2.4)(e8)，

130、-天冬氨酸半醛脫氫酶(ec?1.2.1.11)(e9)，

131、-二氫吡啶二羧酸合酶(ec?4.3.3.7)(e10)，

132、-二氫吡啶二羧酸還原酶(ec?30?1.17.1.8)(e11)，

133、-二氨基庚二酸脫氫酶(ec?1.4.1.16)(e12)，

134、-二氨基庚二酸表異構(gòu)酶(ec?5.1.1.7)(e13)，

135、-二氨基庚二酸脫羧酶(ec?4.1.1.20)(e14)，

136、-n-琥珀酰-氨基酮庚二酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ec?2.6.1.17)(e17)，

137、-2,3,4,5-四氫吡啶-2,6-二羧酸n-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(ec?2.3.1.117)(e18)，和/或

138、-琥珀酰二氨基庚二酸去琥珀酰化酶(ec?3.5.1.18)(e19)；

139、和/或下述酶中的至少一種的表達(dá)減少：

140、-磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(ec?4.1.1.32)(e15)，和/或

141、-高絲氨酸脫氫酶(ec?1.1.1.3)(e16)。

142、在一個(gè)實(shí)例中，e6可以由至少在wo1999018228或ep2107128中公開(kāi)的谷氨酸棒狀桿菌的基因pyc?p458s編碼。在一個(gè)實(shí)例中，e7可以由至少在ep0219027或wo2008033001中公開(kāi)的谷氨酸棒狀桿菌的基因aspb編碼。在一個(gè)實(shí)例中，e8可以是變體t311i，并且可以由至少在us6893848中公開(kāi)的谷氨酸棒狀桿菌的基因lysc編碼。在一個(gè)實(shí)例中，e9可以由至少在ep0387527或wo2008033001中公開(kāi)的谷氨酸棒狀桿菌的基因asd編碼。在一個(gè)實(shí)例中，e10可以由至少在ep0197335中公開(kāi)的谷氨酸棒狀桿菌的基因dapa編碼。在一個(gè)實(shí)例中，e11可以由至少在us8637295或ep0841395中公開(kāi)的谷氨酸棒狀桿菌的基因dapb編碼。在一個(gè)實(shí)例中，e12可以由至少在ep0811682中描述的谷氨酸棒狀桿菌的基因ddh編碼。在一個(gè)實(shí)例中，e13可以由至少在us6670156中描述的谷氨酸棒狀桿菌的基因dapf編碼。在一個(gè)實(shí)例中，e14可以由至少在ep0811682中描述的谷氨酸棒狀桿菌的基因lysa編碼。在一個(gè)實(shí)例中，e15可以由谷氨酸棒狀桿菌的基因pck編碼。在一個(gè)實(shí)例中，e16可以由谷氨酸棒狀桿菌的基因homv59a編碼。在一個(gè)實(shí)例中，e17可以由谷氨酸棒狀桿菌的基因dapc編碼。在一個(gè)實(shí)例中，e18可以由谷氨酸棒狀桿菌的基因dapd編碼。在一個(gè)實(shí)例中，e19可以由谷氨酸棒狀桿菌的基因dape編碼。

143、在另一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞可以進(jìn)行遺傳修飾，以增加選自e6至e19的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14種酶的表達(dá)。

144、在另外一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞可以進(jìn)行遺傳修飾，以如至少在jp6219481b2中公開(kāi)的增加至少丙酮酸羧化酶(ec?6.4.1.1)(e6)和天冬氨酸激酶(ec2.7.2.4)(e8)的表達(dá)，以增加賴(lài)氨酸的產(chǎn)生。

145、在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞可以進(jìn)行遺傳修飾，以增加至少二氫吡啶二羧酸合酶(ec?4.3.3.7)(e10)、天冬氨酸激酶(ec?2.7.2.4)(e8)、二氫吡啶二羧酸還原酶(ec?30?1.17.1.8)(e11)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(ec?4.1.1.32)(e16)和天冬氨酸半醛脫氫酶(ec?1.2.1.11)(e9)的表達(dá)，如us8062869b2中公開(kāi)的。

146、在一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞可以進(jìn)行遺傳修飾，以增加至少天冬氨酸半醛脫氫酶(ec?1.2.1.11)(e9)、二氫吡啶二羧酸合酶(ec?4.3.3.7)(e10)和二氫吡啶二羧酸還原酶(ec?30?1.17.1.8)(e11)的表達(dá)，如至少在jp5486029b2中公開(kāi)的。細(xì)胞可以進(jìn)一步進(jìn)行遺傳修飾，以增加二氨基庚二酸脫氫酶(ec?1.4.1.16)(e12)和/或二氨基庚二酸脫羧酶(ec?4.1.1.20)(e15)的表達(dá)。

147、在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞可以進(jìn)行遺傳修飾，以增加丙酮酸羧化酶(ec?6.4.1.1)(e6)、天冬氨酸激酶(ec?2.7.2.4)(e8)、天冬氨酸半醛脫氫酶(ec?1.2.1.11)(e9)、二氫吡啶二羧酸合酶(ec?4.3.3.7)(e10)、二氫吡啶二羧酸還原酶(ec301.17.1.8)(e11)、二氨基庚二酸脫氫酶(ec?1.4.1.16)(e12)和/或二氨基庚二酸脫羧酶(ec?4.1.1.20)(e14)的表達(dá)，并且減少磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(ec?4.1.1.32)(e15)和/或高絲氨酸脫氫酶(ec?1.1.1.3)(e16)的表達(dá)。至少在us8637295、us2011039313、ep1725672和ep1320593中顯示提供了e6-e19序列以及增加和減少相關(guān)酶表達(dá)的手段的實(shí)例。

148、進(jìn)一步地，實(shí)例使用菌株谷氨酸棒狀桿菌dm1933，并且其構(gòu)建至少在blomberg等人，2009(doi:10.1128/aem.01844-08)中公開(kāi)。然后可以使用這種方法來(lái)產(chǎn)生與野生型細(xì)胞相比可能具有增加的賴(lài)氨酸產(chǎn)生的任何細(xì)胞。

149、根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了從至少一種簡(jiǎn)單碳源產(chǎn)生具有結(jié)構(gòu)式i的至少一種化合物的方法：

150、

151、其中n是2。

152、(a)使根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞與至少一種簡(jiǎn)單碳源接觸，其中所述簡(jiǎn)單碳源選自葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和甘油。

153、根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的任何方面的細(xì)胞用于從至少一種簡(jiǎn)單碳源產(chǎn)生具有結(jié)構(gòu)式i的至少一種化合物的用途：

154、

155、其中n是2，并且其中所述簡(jiǎn)單碳源選自葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和甘油。

156、實(shí)施例

157、前文描述了優(yōu)選實(shí)施方案，如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的，所述實(shí)施方案可以經(jīng)受在設(shè)計(jì)、構(gòu)建或操作方面的變化或修改，而不脫離權(quán)利要求的范圍。例如，這些變化預(yù)期由權(quán)利要求的范圍涵蓋。

158、實(shí)施例1

159、天藍(lán)色鏈霉菌n-琥珀酰-n-羥基尸胺生物合成基因desbcd_sco的谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

160、對(duì)于來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌cai-140的desb基因(seq?id?no:1)、desc基因(seq?idno:2)和desd基因(seq?id?no:3)的異源表達(dá)，構(gòu)建了質(zhì)粒pxmj19{ptac}[desbcd_sco]{t}。將分別由以下組成的合成操縱子克隆到大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體pxmj19內(nèi)iptg誘導(dǎo)型啟動(dòng)子ptac的控制下：編碼賴(lài)氨酸n(6)-羥化酶/l-鳥(niǎo)氨酸n(5)-加氧酶家族蛋白(desb，ec?1.14.13.-，seq?id?no:4)的desb_sco、編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶(desc，ec?2.3.-.-，seqid?no:5)的desc_sco、以及編碼iuca/iucc家族鐵載體生物合成蛋白(desd，ec?6.3.-.-，seq?id?no:6)的desd_sco。終止子序列定位于合成操縱子的下游。從eurofins?genomicsgermany?gmbh(ebersberg，德國(guó))訂購(gòu)了包括終止子序列的完整的合成操縱子(3732bp，seqid?no:7)用于基因合成。大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體pxmj19攜帶用于大腸桿菌的puc復(fù)制起點(diǎn)和用于谷氨酸棒狀桿菌atcc?13032中的復(fù)制的pbl1復(fù)制起點(diǎn)。為了克隆，合成操縱子用限制性酶hindiii進(jìn)行切割，并且連接到用相同酶切割的pxmj19內(nèi)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到10-beta電感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(new?england?biolabs?inc.，ipswich，usa，目錄號(hào)c3020k)內(nèi)。克隆和轉(zhuǎn)化程序根據(jù)制造商的手冊(cè)進(jìn)行。通過(guò)限制性分析檢查靶基因的正確插入，并且通過(guò)dna測(cè)序驗(yàn)證所引入的dna片段的真實(shí)性。所得到的表達(dá)載體命名為pxmj19{ptac}[desbcd_sco]{t}(seq?id?no:8，參見(jiàn)下表2)。

161、實(shí)施例2

162、對(duì)于在谷氨酸棒狀桿菌中的表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的天藍(lán)色鏈霉菌n-琥珀酰-n-羥基尸胺生物合成基因desbcd_sco的谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

163、對(duì)于來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌cai-140的desb基因(seq?id?no:1)、desc基因(seq?idno:2)和desd基因(seq?id?no:3)的異源表達(dá)，構(gòu)建了質(zhì)粒pxmj19{ptac}{rbsopt}[desbcd_sco(co_cg)]{t}。將分別由以下組成的合成操縱子克隆到大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體pxmj19內(nèi)iptg誘導(dǎo)型啟動(dòng)子ptac的控制下：編碼賴(lài)氨酸n(6)-羥化酶/l-鳥(niǎo)氨酸n(5)-加氧酶家族蛋白(desb，ec?1.14.13.-，seq?id?no:4)的desb_sco、編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶(desc，ec2.3.-.-，seq?id?no:5)的desc_sco、以及編碼iuca/iucc家族鐵載體生物合成蛋白(desd，ec?6.3.-.-，seq?id?no:6)的desd_sco。在操縱子的上游添加了對(duì)谷氨酸棒狀桿菌的優(yōu)化的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)，并且終止子序列定位于合成操縱子的下游。從eurofinsgenomics?germany?gmbh(ebersberg，德國(guó))訂購(gòu)了包括rbs和終止子序列的完整的合成操縱子(3779bp，seq?id?no:9)用于基因合成，并且基因片段的dna序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化用于在谷氨酸棒狀桿菌atcc?13032中的表達(dá)。大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體pxmj19攜帶用于大腸桿菌的puc復(fù)制起點(diǎn)和用于谷氨酸棒狀桿菌atcc?13032中的復(fù)制的pbl1復(fù)制起點(diǎn)。為了克隆，合成操縱子用限制性酶hindiii進(jìn)行切割，并且連接到用相同酶切割的pxmj19內(nèi)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到10-beta電感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(new?england?biolabsinc.，ipswich，usa，目錄號(hào)c3020k)內(nèi)。克隆和轉(zhuǎn)化程序根據(jù)制造商的手冊(cè)進(jìn)行。通過(guò)限制性分析檢查靶基因的正確插入，并且通過(guò)dna測(cè)序驗(yàn)證所引入的dna片段的真實(shí)性。所得到的表達(dá)載體命名為pxmj19{ptac}{rbsopt}[desbcd_sco(co_cg)]{t}(seq?id?no:10，參見(jiàn)下表2)。

164、實(shí)施例3

165、紫紅鏈霉菌n-琥珀酰-n-羥基尸胺生物合成基因desabcd_svi的谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

166、對(duì)于來(lái)自紫紅鏈霉菌a3(2)的desa基因(seq?id?no:11)、desb基因(seq?id?no:12)、desc基因(seq?id?no:13)和desd基因(seq?id?no:14)的異源表達(dá)，構(gòu)建了質(zhì)粒pxmj19{ptac}[desabcd_svi]。將分別由以下組成的完整操縱子克隆到大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體pxmj19內(nèi)iptg誘導(dǎo)型啟動(dòng)子ptac的控制下：編碼賴(lài)氨酸脫羧酶(desa，ec4.1.1.18，seq?id?no:15的desa、編碼賴(lài)氨酸n(6)-羥化酶/l-鳥(niǎo)氨酸n(5)-加氧酶家族蛋白(desb，ec1.14.13.-，seq?id?no:16)的desb_sco、編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶(desc，ec?2.3.-.-，seq?id?no:17)的desc_sco、以及編碼iuca/iucc家族鐵載體生物合成蛋白(desd，ec?6.3.-.-，seq?idno:18)的desd_sco。使用引物對(duì)mw22_001fw/mw22_002rv(seq?id?no:56，seq?id?no:57，參見(jiàn)下表1)和來(lái)自紫紅鏈霉菌a3(2)的基因組dna作為模板，經(jīng)由pcr擴(kuò)增完整操縱子。大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體pxmj19攜帶用于大腸桿菌的puc復(fù)制起點(diǎn)和用于谷氨酸棒狀桿菌atcc?13032中的復(fù)制的pbl1復(fù)制起點(diǎn)。使用限制性位點(diǎn)hindiii和來(lái)自new?englandbiolabs?inc.，ipswich，usa，目錄號(hào)e5520的hifi?dna?assembly?cloningkit，將pcr產(chǎn)物(5120bp，seq?id?no:19)克隆到載體pxmj19內(nèi)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到10-beta電感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(new?england?biolabs?inc.，ipswich，usa，目錄號(hào)c3020k)內(nèi)?？寺『娃D(zhuǎn)化程序根據(jù)制造商的手冊(cè)進(jìn)行。通過(guò)限制性分析檢查靶基因的正確插入，并且通過(guò)dna測(cè)序驗(yàn)證所引入的dna片段的真實(shí)性。所得到的表達(dá)載體命名為pxmj19{ptac}[desabcd_svi](seq?id?no:20，參見(jiàn)下表2)。

167、

168、表1：引物列表

169、實(shí)施例4

170、毛鏈霉菌n-琥珀酰-n-羥基尸胺生物合成基因desabcd_spi的谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

171、對(duì)于來(lái)自毛鏈霉菌atcc19797的desa基因(seq?id?no:21)、desb基因(seq?id?no:22)、desc基因(seq?id?no:23)和desd基因(seq?id?no:24)的異源表達(dá)，構(gòu)建了質(zhì)粒pxmj19{ptac}[desabcd_spi]。將分別由以下組成的完整操縱子克隆到大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體pxmj19內(nèi)iptg誘導(dǎo)型啟動(dòng)子ptac的控制下：編碼賴(lài)氨酸脫羧酶(desa，ec4.1.1.18，seq?id?no:25的desa、編碼賴(lài)氨酸n(6)-羥化酶/l-鳥(niǎo)氨酸n(5)-加氧酶家族蛋白(desb，ec1.14.13.-，seq?id?no:26)的desb_sco、編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶(desc，ec?2.3.-.-，seq?id?no:27)的desc_sco、以及編碼iuca/iucc家族鐵載體生物合成蛋白(desd，ec?6.3.-.-，seq?idno:28)的desd_sco。經(jīng)由引物序列在操縱子的上游包括了對(duì)谷氨酸棒狀桿菌的優(yōu)化的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)。使用引物對(duì)mw22_006fw/mw22_005rv(seq?id?no:58，seq?id?no:59，參見(jiàn)表1)和來(lái)自毛鏈霉菌atcc19797的基因組dna作為模板，經(jīng)由pcr擴(kuò)增完整操縱子。大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體pxmj19攜帶用于大腸桿菌的puc復(fù)制起點(diǎn)和用于谷氨酸棒狀桿菌atcc?13032中的復(fù)制的pbl1復(fù)制起點(diǎn)。使用限制性位點(diǎn)hindiii和來(lái)自new?englandbiolabs?inc.，ipswich，usa，目錄號(hào)e5520的hifi?dna?assembly?cloningkit，將pcr產(chǎn)物(5102bp，seq?id?no:29)克隆到載體pxmj19內(nèi)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到10-beta電感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(new?england?biolabs?inc.，ipswich，usa，目錄號(hào)c3020k)內(nèi)?？寺『娃D(zhuǎn)化程序根據(jù)制造商的手冊(cè)進(jìn)行。通過(guò)限制性分析檢查靶基因的正確插入，并且通過(guò)dna測(cè)序驗(yàn)證所引入的dna片段的真實(shí)性。所得到的表達(dá)載體命名為pxmj19{ptac}{rbsopt}[desabcd_spi](seq?id?no:30，參見(jiàn)下表2)。

172、實(shí)施例5

173、對(duì)于在谷氨酸棒狀桿菌中的表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的解淀粉歐文氏菌n-琥珀酰-n-羥基尸胺生物合成基因dfoac_eam的谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

174、對(duì)于來(lái)自解淀粉歐文氏菌cfbp1430的dfoa基因(seq?id?no:31)和dfoc基因(seqid?no:32)的異源表達(dá)，構(gòu)建了質(zhì)粒pxmj19{ptac}[dfoac_eam(co_cg)]{t}。將由以下組成的合成操縱子克隆到大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體pxmj19內(nèi)iptg誘導(dǎo)型啟動(dòng)子ptac的控制下：編碼賴(lài)氨酸n(6)-羥化酶/l-鳥(niǎo)氨酸n(5)-加氧酶家族蛋白(dfoa，ec?1.14.13.-，seq?id?no:33)的dfoa_eam、以及編碼gnat家族n-乙酰轉(zhuǎn)移酶(dfoc，ec?2.3.-.-，seq?idno:34)的dfoc_eam。終止子序列定位于合成操縱子的下游。從eurofins?genomics?germanygmbh(ebersberg，德國(guó))訂購(gòu)了包括終止子序列的完整的合成操縱子(3830bp，seq?id?no:35)用于基因合成，并且基因片段的dna序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化用于在谷氨酸棒狀桿菌atcc13032中的表達(dá)。大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體pxmj19攜帶用于大腸桿菌的puc復(fù)制起點(diǎn)和用于谷氨酸棒狀桿菌atcc?13032中的復(fù)制的pbl1復(fù)制起點(diǎn)。為了克隆，合成操縱子用限制性酶hindiii進(jìn)行切割，并且連接到用相同酶切割的pxmj19內(nèi)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到10-beta電感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(new?england?biolabs?inc.，ipswich，usa，目錄號(hào)c3020k)內(nèi)?？寺『娃D(zhuǎn)化程序根據(jù)制造商的手冊(cè)進(jìn)行。通過(guò)限制性分析檢查靶基因的正確插入，并且通過(guò)dna測(cè)序驗(yàn)證所引入的dna片段的真實(shí)性。所得到的表達(dá)載體命名為pxmj19{ptac}[dfoac_eam(co_cg)]{t}(seq?id?no:36，參見(jiàn)下表2)。

175、實(shí)施例6

176、成團(tuán)泛菌n-琥珀酰-n-羥基尸胺生物合成基因dfoac_pag的谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

177、對(duì)于來(lái)自成團(tuán)泛菌菌株dc432的dfoa基因(seq?id?no:37)和dfoc基因(seq?idno:38)的異源表達(dá)，構(gòu)建了質(zhì)粒pxmj19{ptac}[dfoac_pag]{t}。將由以下組成的操縱子克隆到大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體pxmj19內(nèi)iptg誘導(dǎo)型啟動(dòng)子ptac的控制下：編碼賴(lài)氨酸n(6)-羥化酶/l-鳥(niǎo)氨酸n(5)-加氧酶家族蛋白(dfoa，ec?1.14.13.-，seq?id?no:39)的dfoa_pag、以及編碼gnat家族n-乙酰轉(zhuǎn)移酶(dfoc，ec?2.3.-.-，seq?id?no:40)的dfoc_pag。終止子序列定位于合成操縱子的下游。從eurofins?genomics?germany?gmbh(ebersberg，德國(guó))訂購(gòu)了包括終止子序列的操縱子(3842bp，seq?id?no:41)用于基因合成。大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體pxmj19攜帶用于大腸桿菌的puc復(fù)制起點(diǎn)和用于谷氨酸棒狀桿菌atcc?13032中的復(fù)制的pbl1復(fù)制起點(diǎn)。為了克隆，合成操縱子用限制性酶hindiii進(jìn)行切割，并且連接到用相同酶切割的pxmj19內(nèi)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到10-beta電感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(new?england?biolabs?inc.，ipswich，usa，目錄號(hào)c3020k)內(nèi)?？寺『娃D(zhuǎn)化程序根據(jù)制造商的手冊(cè)進(jìn)行。通過(guò)限制性分析檢查靶基因的正確插入，并且通過(guò)dna測(cè)序驗(yàn)證所引入的dna片段的真實(shí)性。所得到的表達(dá)載體命名為pxmj19{ptac}[dfoac_pag]{t}(seq?id?no:42，參見(jiàn)下表2)。

178、實(shí)施例7

179、干燥棒狀桿菌n-琥珀酰-n-羥基尸胺生物合成基因desbc_cx的谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

180、對(duì)于來(lái)自干燥棒狀桿菌的desb基因(seq?id?no:43)和desc基因(seq?id?no:44)的異源表達(dá)，構(gòu)建了質(zhì)粒pxmj19{ptac}[desbc_cx]{t}。將由以下組成的操縱子克隆到大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體pxmj19內(nèi)iptg誘導(dǎo)型啟動(dòng)子ptac的控制下：編碼鐵載體生物合成蛋白單加氧酶(desb，ec?1.14.13.-，seq?id?no:45)的desb_cx、以及編碼去鐵胺生物合成蛋白/鐵載體合成酶超家族組c(desc，ec?2.3.-.-，seq?id?no:46)的desc_cx。終止子序列定位于合成操縱子的下游。從eurofins?genomics?germany?gmbh(ebersberg，德國(guó))訂購(gòu)了包括終止子序列的操縱子(3922bp，seq?id?no:47)用于基因合成。大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體pxmj19攜帶用于大腸桿菌的puc復(fù)制起點(diǎn)和用于谷氨酸棒狀桿菌atcc13032中的復(fù)制的pbl1復(fù)制起點(diǎn)。為了克隆，合成操縱子用限制性酶hindiii進(jìn)行切割，并且連接到用相同酶切割的pxmj19內(nèi)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到10-beta電感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(newengland?biolabs?inc.，ipswich，usa，目錄號(hào)c3020k)內(nèi)?？寺『娃D(zhuǎn)化程序根據(jù)制造商的手冊(cè)進(jìn)行。通過(guò)限制性分析檢查靶基因的正確插入，并且通過(guò)dna測(cè)序驗(yàn)證所引入的dna片段的真實(shí)性。所得到的表達(dá)載體命名為pxmj19{ptac}[desbc_cx]{t}(seq?id?no:48，參見(jiàn)下表2)。

181、實(shí)施例8

182、對(duì)于在谷氨酸棒狀桿菌中的表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的天藍(lán)色鏈霉菌n-琥珀酰-n-羥基尸胺生物合成基因desbc_sco的谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

183、對(duì)于來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌cai-140的desb基因(seq?id?no:1)和desc基因(seq?idno:2)的異源表達(dá)，構(gòu)建了質(zhì)粒pxmj19{ptac}{rbsopt}[desbc_sco(co_cg)]{t}。將由以下組成的合成操縱子克隆到大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體pxmj19內(nèi)iptg誘導(dǎo)型啟動(dòng)子ptac的控制下：編碼賴(lài)氨酸n(6)-羥化酶/l-鳥(niǎo)氨酸n(5)-加氧酶家族蛋白(desb，ec1.14.13.-，seq?id?no:4)的desb_sco、以及編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶的desc_sco。在操縱子的上游添加了對(duì)谷氨酸棒狀桿菌的優(yōu)化的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)。為了克隆，用asisi/bamhi切割質(zhì)粒pxmj19{ptac}{rbsopt}[desbcd_sco(co_cg)]{t}(seq?id?no:10，參見(jiàn)下表2和上文實(shí)施例2)，使得去除desb、desc和desd基因的部分。為了恢復(fù)desb和desc，使用pxmj19{ptac}{rbsopt}[desbcd_sco(co_cg)]{t}作為模板，使用引物對(duì)mw22_013fw/mw22_014rv(seq?idno:66，seq?id?no:67，參見(jiàn)表1)經(jīng)由pcr擴(kuò)增基因。大腸桿菌/谷氨酸棒狀桿菌穿梭載體pxmj19攜帶用于大腸桿菌的puc復(fù)制起點(diǎn)和用于谷氨酸棒狀桿菌atcc?13032中的復(fù)制的pbl1復(fù)制起點(diǎn)。使用來(lái)自new?england?biolabs?inc.，ipswich，usa，目錄號(hào)e5520的hifi?dna?assembly?cloning?kit，將pcr產(chǎn)物(831bp，seq?id?no:68)克隆到載體pxmj19內(nèi)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到10-beta電感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(new?englandbiolabs?inc.，ipswich，usa，目錄號(hào)c3020k)。克隆和轉(zhuǎn)化程序根據(jù)制造商的手冊(cè)進(jìn)行。通過(guò)限制性分析檢查靶基因的正確插入，并且通過(guò)dna測(cè)序驗(yàn)證所引入的dna片段的真實(shí)性。所得到的表達(dá)載體命名為pxmj19{ptac}{rbsopt}[desabc_spi](seq?id?no:69，參見(jiàn)下表2)。

184、 質(zhì)粒 克隆的基因 pxmj19{ptac}[desbcd_sco]{t} desbcd_sco pxmj19{ptac}{rbsopt}[desbcd_sco(co_cg)]{t} desbcd_sco(co_cg) pxmj19{ptac}[desabcd_svi] desabcd_svi pxmj19{ptac}{rbsopt}[desabcd_spi] desabcd_spi pxmj19{ptac}[dfoac_eam(co_cg)]{t} dfoac_eam pxmj19{ptac}[dfoac_pag]{t} dfoac_pag pxmj19{ptac}[desbc_cx]{t} desbc_cx pxmj19{ptac}{rbsopt}[desbc_sco(co_cg)]{t} desbc_sco(co_cg)

185、表2：谷氨酸棒狀桿菌/大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒列表

186、實(shí)施例9

187、通過(guò)將來(lái)自大腸桿菌的l-賴(lài)氨酸脫羧酶ldcc引入產(chǎn)生比野生型細(xì)胞更多賴(lài)氨酸的l-賴(lài)氨酸生產(chǎn)者菌株谷氨酸棒狀桿菌dm1933內(nèi)，構(gòu)建基于谷氨酸棒狀桿菌的尸胺生產(chǎn)者

188、為了構(gòu)建基于谷氨酸棒狀桿菌的尸胺生產(chǎn)者，將編碼l-賴(lài)氨酸脫羧酶(ldcc，ec4.1.1.18，seq?id?no:50)的大腸桿菌ldcc基因(seq?id?no:49)整合到賴(lài)氨酸生產(chǎn)者谷氨酸棒狀桿菌dm1933的基因組內(nèi)。dm1933的詳細(xì)構(gòu)建在blomberg等人，2009(doi:10.1128/aem.01844-08)中進(jìn)行描述。對(duì)于ldcc基因的整合，構(gòu)建了質(zhì)粒pk18mobsacb?ki{ptuf}[ldcc_ec(co_cg)]。將ldcc基因整合到orf?ncgl0013和orf?ncgl0014之間的基因間區(qū)域內(nèi)，并且克隆到組成型谷氨酸棒狀桿菌啟動(dòng)子ptuf的控制下。從eurofins?genomicsgermany?gmbh(ebersberg，德國(guó))訂購(gòu)了{(lán)ptuf}[ldcc_ec(co_cg)]融合產(chǎn)物(seq?id?no:51)用于基因合成。

189、在第一個(gè)克隆步驟中，使用引物對(duì)mw_21_80/mw_21_81(seq?id?no:60，seq?idno:61)和mw_21_82/mw_21_83(seq?id?no:62，seq?id?no:63，參見(jiàn)上表1)，通過(guò)pcr擴(kuò)增ncgl0013和ncgl0014之間的染色體非編碼區(qū)的兩個(gè)側(cè)翼區(qū)，產(chǎn)生片段homa(1046bp，seq?idno:52)和homb(1028bp，seq?id?no:53)。使用限制性位點(diǎn)ecori和來(lái)自new?englandbiolabs?inc.，ipswich，usa，目錄號(hào)e5520的hifi?dna?assembly?cloningkit，將兩個(gè)片段克隆到載體pk18mobsacb(等人，1994，doi:10.1016/0378-1119(94)90324-7)內(nèi)。此外，經(jīng)由引物mw_21_81/mw_21_82，在homa和homb之間引入asci限制性位點(diǎn)。將組裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到10-beta電感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(new?england?biolabs?inc.，ipswich，usa，目錄號(hào)c3020k)內(nèi)?？寺『娃D(zhuǎn)化程序根據(jù)制造商的手冊(cè)進(jìn)行。通過(guò)限制性分析檢查靶基因的正確插入，并且通過(guò)dna測(cè)序驗(yàn)證所引入的dna片段的真實(shí)性。所得到的表達(dá)載體命名為pk18mobsacb[ki?ncgl0013基因座](seq?id?no:54)。

190、在第二個(gè)克隆步驟中，使用引物對(duì)mw_21_93/mw_21_94(seq?id?no:64，seq?idno:65)經(jīng)由pcr擴(kuò)增{ptuf}[ldcc_ec(co_cg)]融合產(chǎn)物(seq?id?no:51，2433bp)，并且使用限制性位點(diǎn)asci和來(lái)自new?england?biolabs?inc.，ipswich，usa，目錄號(hào)e5520的hifi?dna?assembly?cloning?kit，克隆到載體pk18mobsacb[ki?ncgl0013基因座](seq?id?no:54)內(nèi)。將組裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到10-beta電感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(newengland?biolabs?inc.，ipswich，usa，目錄號(hào)c3020k)內(nèi)?？寺『娃D(zhuǎn)化程序根據(jù)制造商的手冊(cè)進(jìn)行。通過(guò)限制性分析檢查靶基因的正確插入，并且通過(guò)dna測(cè)序驗(yàn)證所引入的dna片段的真實(shí)性。所得到的敲入質(zhì)粒命名為pk18mobsacb?ki{ptuf}[ldcc_ec(co_cg)](seq?idno:55)。

191、這種質(zhì)粒經(jīng)由電穿孔轉(zhuǎn)化到谷氨酸棒狀桿菌dm1933內(nèi)。通過(guò)應(yīng)用由等人1994(doi:10.1016/0378-1119(94)90324-7)描述的方法，經(jīng)由同源重組(雙交換)將在啟動(dòng)子ptuf的控制下的基因ldc_ec(co_cg)整合到谷氨酸棒狀桿菌dm1933的染色體內(nèi)，產(chǎn)生谷氨酸棒狀桿菌dm1933?int.ncgl0013/0014::{ptuf}[ldcc_ec(cocg)]。

192、實(shí)施例10

193、基于谷氨酸棒狀桿菌的n-琥珀酰-n-羥基尸胺生產(chǎn)者的構(gòu)建

194、對(duì)于基于谷氨酸棒狀桿菌的n-琥珀酰-n-羥基尸胺生產(chǎn)者的構(gòu)建，實(shí)施例2-4、6、7和8中所述以及表2中列出的質(zhì)粒借助于電穿孔轉(zhuǎn)化到谷氨酸棒狀桿菌dm1933int.ncgl0013/0014::{ptuf}[ldcc_ec(cocg)]內(nèi)。細(xì)胞在補(bǔ)充有氯霉素(7.5mg/l)的lb瓊脂平板上鋪平板。通過(guò)質(zhì)粒制備和分析型限制性分析就正確質(zhì)粒的存在檢查轉(zhuǎn)化子。所得到的菌株在下表3中列出。

195、

196、表3：基于谷氨酸棒狀桿菌的去鐵胺生產(chǎn)者菌株列表

197、實(shí)施例11

198、基于大腸桿菌的n-琥珀酰-n-羥基尸胺生產(chǎn)者的構(gòu)建

199、對(duì)于基于大腸桿菌的n-琥珀酰-n-羥基尸胺生產(chǎn)者的構(gòu)建，實(shí)施例1、2、5和6中所述以及表2中列出的質(zhì)粒借助于電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌w3110內(nèi)。細(xì)胞在補(bǔ)充有氯霉素(20mg/l)的lb瓊脂平板上鋪平板。通過(guò)質(zhì)粒制備和分析型限制性分析就正確質(zhì)粒的存在檢查轉(zhuǎn)化子。

200、所得到的菌株在表4中列出。

201、

202、表4：基于大腸桿菌的去鐵胺生產(chǎn)者菌株列表

203、實(shí)施例12

204、使用谷氨酸棒狀桿菌衍生物的n-琥珀酰-n-羥基尸胺生產(chǎn)

205、為了生產(chǎn)n-琥珀酰-n-羥基尸胺，在100ml帶擋板的搖瓶中補(bǔ)充有氯霉素(7.5mg/l)的10ml?bhi培養(yǎng)基(granuculttm?bhi(brain?heart?infusion)肉湯，merck，darmstadt，德國(guó)，目錄號(hào)：1.10493.0500)用0.1ml原種培養(yǎng)物進(jìn)行接種，并且在30℃和200rpm下溫育16小時(shí)。通過(guò)離心(10分鐘，4000g，4℃)收獲預(yù)培養(yǎng)物，并且團(tuán)塊用10ml?0.9％(w/v)nacl洗滌兩次。對(duì)于主培養(yǎng)物，使用預(yù)培養(yǎng)物接種具有ph和溶解氧光極的flowerplate(48孔mtp，flower，beckman?coulter?life?sciences，baesweiler，德國(guó)，目錄號(hào)：m2p-mtp-48-boh1)，其在每個(gè)孔中含有補(bǔ)充有氯霉素(7.5mg/l)的0.7ml?cgxii培養(yǎng)基(15g/l葡萄糖、20g/l(nh4)2so4、5g/l尿素、1g/l?k2hpo4、1g/l?kh2po4、0.25g/l?mgso4?x?7h2o、42g/l?mops、13.2mg/l?cacl2、0.2mg/l生物素、30mg/l原兒茶酸、微量元素溶液：10g/l?feso4?x?7h2o、10g/lmnso4?x?h2o、1g/l?znso4?x?7h2o、0.2g/l?cuso4、20mg/l?nicl2?x?6h2o，ph?7)，以達(dá)到起始o(jì)d600?0.5。使主培養(yǎng)物在biolector?i系統(tǒng)(beckman?coulter?life?sciences，baesweiler，德國(guó))中在30℃和1400rpm和相對(duì)濕度(85％)下溫育24小時(shí)。在指數(shù)期開(kāi)始時(shí)，用0.5mm?iptg誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，收獲細(xì)胞，并且上清液用0.2μm?pvdf過(guò)濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，并且在分析前貯存于-20℃下。經(jīng)由lc-uv-ms分析所有菌株的n-琥珀酰-n-羥基尸胺濃度(參見(jiàn)實(shí)施例14)。在所有菌株的上清液中都可以檢測(cè)到n-琥珀酰-n-羥基尸胺。

206、實(shí)施例13

207、使用大腸桿菌衍生物的n-琥珀酰-n-羥基尸胺生產(chǎn)

208、為了生產(chǎn)n-琥珀酰-n-羥基尸胺，在100ml帶擋板的搖瓶中補(bǔ)充有氯霉素(20mg/l)的10ml?lb培養(yǎng)基(carl?roth，karlsruhe，德國(guó)，目錄號(hào)：x968.1)用0.1ml原種培養(yǎng)物進(jìn)行接種，并且在37℃和200rpm下溫育16小時(shí)。對(duì)于主培養(yǎng)物，使用預(yù)培養(yǎng)物接種具有ph和溶解氧光極的flowerplate(48孔mtp，flower，beckman?coulter?life?sciences，baesweiler，德國(guó)，目錄號(hào)：m2p-mtp-48-boh1)，其在每個(gè)孔中含有用100mm?mops，ph?7.2緩沖且補(bǔ)充有氯霉素(20mg/l)的0.7ml?lb培養(yǎng)基(carl?roth，karlsruhe，德國(guó)，目錄號(hào)：x968.1)，以達(dá)到起始o(jì)d600?0.1。使主培養(yǎng)物在biolector?i系統(tǒng)(beckman?coulter?life?sciences，baesweiler，德國(guó))中在37℃和1400rpm和相對(duì)濕度(85％)下溫育24小時(shí)。在指數(shù)期開(kāi)始時(shí)，用0.5mm?iptg誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，收獲細(xì)胞，并且上清液用0.2μm?pvdf過(guò)濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，并且在分析前貯存于-20℃下。經(jīng)由lc-uv-ms分析所有菌株的n-琥珀酰-n-羥基尸胺濃度(參見(jiàn)實(shí)施例14)。在所有菌株的上清液中都可以檢測(cè)到n-琥珀酰-n-羥基尸胺。

209、實(shí)施例14

210、n-琥珀酰-n-羥基尸胺的基于hplc的定量

211、借助于hplc進(jìn)行n-琥珀酰-n-羥基尸胺的定量。在分析前，樣品在16100g下離心5分鐘，并且使用0.22μm?pvdf濾膜進(jìn)行過(guò)濾。將20μl過(guò)濾的上清液與80μl硫酸鐵銨溶液混合，并且裝入hplc小瓶?jī)?nèi)。樣品在測(cè)量前貯存于-20℃下。

212、對(duì)于n-琥珀酰-n-羥基尸胺的檢測(cè)和定量，使用dad檢測(cè)器(198和430nm)。借助于agilent?technologies?1200series(santa?clara，calif.，usa)和xb-c18柱(4.6x100mm，2.6μm，phenomenexkinetex)進(jìn)行測(cè)量。注射體積為5μl，并且運(yùn)行時(shí)間為在0.8ml/分鐘的流速下25分鐘。流動(dòng)相a：1l純水，1ml甲酸，流動(dòng)相b：1l乙腈，1ml甲酸。柱溫為40℃。使用保留時(shí)間和相應(yīng)的質(zhì)譜完成n-琥珀酰-n-羥基尸胺的鑒定。

213、梯度：

214、 t[分鐘] [％]a [％]b 流速[ml/min] 最大壓力[巴] 0.0 95 5 0.8 400 5.0 95 5 0.8 400 13.0 70 30 0.8 400 15.0 2 98 0.8 400 20.0 2 98 0.8 400 20.01 95 5 0.8 400 25.0 95 5 0.8 400

215、對(duì)于濃度低于定量限(loq)的分析物，借助于hplc/esi-ms-ms執(zhí)行鑒定。對(duì)于這些測(cè)量使用triple?quadrupol?mass?spectrometer(agilent?6410b，santa?clara，calif.，usa)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(mrm)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路