本公開一般涉及免疫學(xué)、炎癥和癌癥治療領(lǐng)域。更具體地，本公開涉及編碼溶瘤病毒諸如小核糖核酸病毒(例如，柯薩奇病毒(coxsackievirus))的病毒基因組的rna多核苷酸的產(chǎn)生和用于此種病毒基因組表達(dá)的重組dna分子的設(shè)計(jì)。本公開還涉及增殖性病癥諸如癌癥的治療和預(yù)防。

背景技術(shù)：

1、溶瘤病毒是具有復(fù)制能力的病毒，具有裂解生命周期，能夠感染和裂解腫瘤細(xì)胞。直接的腫瘤細(xì)胞裂解不僅會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，還會生成針對局部抗原呈遞細(xì)胞攝取和呈遞的腫瘤抗原的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。因此，溶瘤病毒通過直接細(xì)胞裂解以及通過促進(jìn)能夠在病毒清除后維持抗腫瘤反應(yīng)的抗原特異性適應(yīng)性反應(yīng)來對抗腫瘤細(xì)胞生長。

2、然而，具有復(fù)制能力的病毒的臨床使用面臨著一些挑戰(zhàn)?？傮w來說，病毒暴露會激活先天免疫通路，導(dǎo)致廣泛的、非特異性的炎癥反應(yīng)。如果患者之前沒有暴露于病毒，那么這種最初的先天免疫反應(yīng)可能導(dǎo)致適應(yīng)性抗病毒反應(yīng)的發(fā)展和中和抗體的產(chǎn)生。如果患者之前暴露于病毒，那么現(xiàn)存的中和抗病毒抗體可能防止期望的裂解作用。在這兩種情況下，中和抗體的存在不僅可以防止病毒裂解靶細(xì)胞，還會使得再次施用病毒治療劑無效。這些因素限制了病毒治療劑在轉(zhuǎn)移性癌癥治療中的用途，因?yàn)橹委煷祟惏┌Y所需的重復(fù)全身施用的功效受到天然存在的抗病毒反應(yīng)的阻礙。

3、克服此類挑戰(zhàn)的一種策略是使用人工顆粒(例如，脂質(zhì)納米顆粒)而不是天然病毒顆粒，以將編碼病毒基因組的多核苷酸遞送至靶細(xì)胞。生成這些人工顆粒通常需要體外產(chǎn)生和包裝編碼病毒基因組的重組多核苷酸，并且此類重組多核苷酸一旦引入細(xì)胞就需要能夠有效地生成病毒rna。然而，許多病毒基因組(例如，各種小核糖核酸病毒的基因組)需要病毒基因組的天然5’和/或3’端才能有效地復(fù)制。并且，本領(lǐng)域?qū)τ谂c體外產(chǎn)生含有對應(yīng)病毒基因組的天然5’和/或3’端的重組多核苷酸相關(guān)的組合物和方法仍然存在長期且未得到滿足的需求。本公開提供了此類組合物和方法等等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在一個方面，本公開提供了一種重組dna分子，所述重組dna分子從5’至3’包含啟動子序列、5’連接切割序列，以及編碼包含合成rna病毒基因組的rna分子的多核苷酸序列，其中5’連接切割序列包含env27核酶編碼序列或由其組成。

2、在一個方面，本公開提供了一種重組dna分子，所述重組dna分子從5’至3’包含啟動子序列、5’連接切割序列、編碼包含合成rna病毒基因組的rna分子的多核苷酸序列、poly-a尾，以及3’連接切割序列，其中5’連接切割序列包含env27核酶編碼序列或由其組成。

3、在一些實(shí)施方案中，env27核酶編碼序列包含與seq?id?no:132(不包括其對應(yīng)于seq?id?no:132的核苷酸49-54的p3莖插入物)具有至少80％的同一性的多核苷酸序列(不包括p3莖插入物)或由其組成。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸序列(不包括p3莖插入物)與seq?id?no:132(不包括其對應(yīng)于seq?id?no:132的核苷酸49-54的p3莖插入物)相比100％同一，或具有最多1個、最多2個、最多3個、最多4個、最多5個、最多6個、最多7個、最多8個、最多9個、最多10個或最多11個突變(插入、缺失或取代)。在一些實(shí)施方案中，突變是取代。在一些實(shí)施方案中，env27核酶編碼序列包含對應(yīng)于seq?id?no:132的核苷酸25-30的位置處的多核苷酸“tttatt”或“tttgtt”。在一些實(shí)施方案中，env27核酶編碼序列包含對應(yīng)于seqid?no:132的核苷酸25-30的位置處的多核苷酸“tttatt”。在一些實(shí)施方案中，env27核酶編碼序列包含長度為約1-30、約1-20、約6-20或約6-10個多核苷酸的p3莖插入物。在一些實(shí)施方案中，p3莖插入物的長度為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，p3莖插入物的長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，p3莖插入物包含對應(yīng)于seqid?no:132的核苷酸49-54的區(qū)域處的多核苷酸“agatct”或由其組成。在一些實(shí)施方案中，p3莖插入物包含對應(yīng)于seq?id?no:132的核苷酸49-54的區(qū)域處的多核苷酸“agagaaatct”(seq?id?no:137)或由其組成。在一些實(shí)施方案中，p3莖插入物包含對應(yīng)于seq?id?no:132的核苷酸49-54的區(qū)域處的多核苷酸“agaacgagaaatcgttct”(seq?id?no:138)或由其組成。

4、在一些實(shí)施方案中，重組dna分子從5’至3’包含啟動子序列、5’連接切割序列、編碼包含合成rna病毒基因組的rna分子的多核苷酸序列，以及poly-a尾。

5、在一些實(shí)施方案中，重組dna分子從5’至3’包含啟動子序列、5’連接切割序列、編碼包含合成rna病毒基因組的rna分子的多核苷酸序列，以及3’連接切割序列。

6、在一些實(shí)施方案中，重組dna分子從5’至3’包含啟動子序列、5’連接切割序列、編碼包含合成rna病毒基因組的rna分子的多核苷酸序列、poly-a尾，以及3’連接切割序列。

7、在一些實(shí)施方案中，合成rna病毒基因組編碼小核糖核酸病毒。在一些實(shí)施方案中，小核糖核酸病毒是柯薩奇病毒。在一些實(shí)施方案中，rna病毒基因組的5’末端以“uuaaa”開頭。在一些實(shí)施方案中，柯薩奇病毒是cva21毒株。在一些實(shí)施方案中，cva21毒株選自kuykendall毒株、ef毒株和ky毒株。在一些實(shí)施方案中，rna病毒基因組的5’末端包含與seqid?no:1、5或9中任一個的核苷酸1-260具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的多核苷酸序列或由其組成。

8、在一些實(shí)施方案中，重組dna分子在5’連接切割序列與編碼rna分子的多核苷酸序列之間不包含額外核酸。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄后5’連接切割序列和/或3’連接切割序列的切割產(chǎn)生合成rna病毒基因組的天然5’和/或3’末端。

9、在一些實(shí)施方案中，本公開的重組dna分子進(jìn)一步包含在啟動子序列與5’連接切割序列之間的前導(dǎo)序列。在一些實(shí)施方案中，前導(dǎo)序列的長度小于100bp、小于90bp、小于80bp、小于70bp、小于60bp、小于50bp或小于40bp。在一些實(shí)施方案中，前導(dǎo)序列包含根據(jù)seq?id?no:135或136具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多核苷酸序列或由其組成。在一些實(shí)施方案中，前導(dǎo)序列包含根據(jù)seq?id?no:135具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多核苷酸序列或由其組成。

10、在一些實(shí)施方案中，重組dna分子在啟動子序列與前導(dǎo)序列之間不包含額外核酸。在一些實(shí)施方案中，重組dna分子在前導(dǎo)序列與5’連接切割序列之間不包含額外核酸。

11、在一些實(shí)施方案中，啟動子序列是t7啟動子序列。在一些實(shí)施方案中，t7啟動子序列包含seq?id?no:91或由其組成。

12、在一些實(shí)施方案中，poly-a尾長度為約50bp-90bp或長度為約65bp-75bp。在一些實(shí)施方案中，poly-a尾長度為約70bp。在一些實(shí)施方案中，poly-a尾長度為約10bp-50bp或25bp-35bp。

13、在一些實(shí)施方案中，3’連接切割序列包含核酶序列或由其組成。在一些實(shí)施方案中，3’核酶序列是丁型肝炎病毒核酶序列。

14、在一些實(shí)施方案中，3’連接切割序列包含限制酶識別序列或由其組成。在一些實(shí)施方案中，3’連接切割序列包含iis型限制酶識別序列或由其組成。在一些實(shí)施方案中，3’連接切割序列包含bsmbi識別序列或由其組成。在一些實(shí)施方案中，3’連接切割序列包含bsai識別序列或由其組成。

15、在一些實(shí)施方案中，啟動子序列是t7啟動子序列，前導(dǎo)序列由根據(jù)seq?id?no:135的多核苷酸序列組成，5’連接切割序列包含根據(jù)seq?id?no:132-134中任一個的env27核酶序列或由其組成，poly-a尾長度為約70bp，并且3’連接切割序列包含bsmbi識別序列或由其組成。

16、在一些實(shí)施方案中，啟動子序列是t7啟動子序列，前導(dǎo)序列由根據(jù)seq?id?no:135的多核苷酸序列組成，5’連接切割序列包含根據(jù)seq?id?no:132-134中任一個的env27核酶序列或由其組成，poly-a尾長度為約70bp，并且3’連接切割序列包含bsai識別序列或由其組成。

17、在一些實(shí)施方案中，重組dna分子在跨越啟動子序列和3’連接切割序列的區(qū)域內(nèi)不包含額外核酸。

18、在一個方面，本公開提供了產(chǎn)生重組rna分子的方法，所述方法包括本公開的重組dna分子的體外轉(zhuǎn)錄和所得重組rna分子的純化。在一些實(shí)施方案中，重組rna分子包含由重組rna分子編碼的病毒基因組天然的5’和3’末端。

19、在一個方面，本公開提供了由本公開的重組dna分子轉(zhuǎn)錄的重組rna分子。在一些實(shí)施方案中，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％的重組rna分子包含由重組rna分子編碼的病毒基因組天然的5’和3’末端。在一些實(shí)施方案中，不超過30％、不超過25％、不超過20％、不超過15％、不超過10％、不超過5％、不超過4％、不超過3％、不超過2％、不超過1％、不超過0.5％或不超過0.1％的重組rna分子包含由env27核酶編碼序列編碼的rna序列。在一些實(shí)施方案中，至少一個重組rna分子包含由env27核酶編碼序列編碼的rna序列。在一些實(shí)施方案中，至少0.0001％、至少0.001％、至少0.01％、至少0.1％或至少1％的重組rna分子包含由env27核酶編碼序列編碼的rna序列。

20、在一個方面，本公開提供了包含有效量的本公開的重組rna分子的組合物，以及適合施用于哺乳動物受試者的載劑。

21、在一個方面，本公開提供了包含本公開的重組rna分子的顆粒。在一些實(shí)施方案中，顆粒選自由以下組成的組：納米顆粒、外泌體、脂質(zhì)體和脂質(zhì)體復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，顆粒是脂質(zhì)納米顆粒。

22、在一個方面，本公開提供了包含本公開的多個顆粒的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，將組合物遞送至受試者會將包封的重組rna分子遞送至靶細(xì)胞，并且其中包封的重組rna分子產(chǎn)生能夠裂解靶細(xì)胞的傳染性病毒。

23、在一個方面，本公開提供了殺傷癌細(xì)胞的方法，所述方法包括在足以將顆粒胞內(nèi)遞送至所述癌細(xì)胞的條件下，將癌細(xì)胞暴露于本公開的顆粒或其組合物，其中由包封的多核苷酸產(chǎn)生的具有復(fù)制能力的病毒導(dǎo)致殺傷癌細(xì)胞。在一個方面，本公開提供了治療受試者的癌癥的方法，所述方法包括向患有癌癥的受試者施用有效量的本公開的顆粒或其組合物。在一些實(shí)施方案中，方法在體內(nèi)、體外或離體進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，癌癥是肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌或胰腺癌，并且其中合成rna病毒基因組包含源自ky毒株的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，癌癥是膀胱癌、腎細(xì)胞癌、卵巢癌、胃癌或肝癌，并且其中合成rna病毒基因組包含源自ef毒株的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，癌癥選自：肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、睪丸癌、結(jié)直腸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌、腎細(xì)胞癌、胃癌、頭頸癌、甲狀腺癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、b細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、意義未明的單克隆丙種球蛋白病(mgus)、默克爾細(xì)胞癌(merkel?cell?carcinoma)、彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤(dlbcl)、肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、橫紋肌肉瘤、髓母細(xì)胞瘤、膀胱癌和邊緣區(qū)淋巴瘤(mzl)。在一些實(shí)施方案中，癌癥選自由以下組成的組：肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌、卵巢癌、胃癌和肝癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是腎細(xì)胞癌、肺癌或肝癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是小細(xì)胞肺癌或非小細(xì)胞肺癌(例如，鱗狀細(xì)胞肺癌或肺腺癌)。在一些實(shí)施方案中，癌癥是肝細(xì)胞癌(hcc)(例如，乙型肝炎病毒相關(guān)的hcc)。在一些實(shí)施方案中，癌癥是治療引發(fā)的神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是肺癌、肝癌、前列腺癌(例如，crpc-ne)、膀胱癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞癌、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、髓母細(xì)胞瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、默克爾細(xì)胞癌或黑色素瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是神經(jīng)母細(xì)胞瘤。