發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于治療成熟生物膜相關(guān)銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)感染的兩種已知藥物的協(xié)同組合。本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院(nih)，約65％的所有微生物感染和80％的所有慢性感染都與細(xì)菌生物膜的存在相關(guān)。然而，最近才定義細(xì)菌生物膜代表對公共衛(wèi)生的重大威脅，因為它們使病原體對抗生素和對宿主免疫系統(tǒng)的敏感性降低。此外，生物膜相關(guān)的感染與多種由mdr(多重耐藥)細(xì)菌引起的感染性疾病的惡化有關(guān)，所述mdr細(xì)菌通常對更最近開發(fā)的抗生素發(fā)展耐藥性。事實上，通常目前使用的抗生素可以減少生物膜中的細(xì)菌的數(shù)量，但它們不能完全根除在該受保護環(huán)境中的細(xì)菌(fernandez?barat,2017等人j.cyst.fibros.16,222-229doi:https://doi.org/10.1016/j.jcf.2016.08.005)。胞外聚合物(eps)(在下文中為生物膜)由蛋白質(zhì)(<1-2％，包括酶)、dna(<1％)、多糖(1-2％)、rna(<1％)和允許營養(yǎng)素在生物膜基質(zhì)內(nèi)流動的水(最高達(dá)97％)制成。生物膜形成是由于細(xì)菌機制和基因轉(zhuǎn)錄的激活，這些機制和基因轉(zhuǎn)錄對于浮游階段是不常見的。事實上，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)變至生長的生物膜階段時，它經(jīng)歷行為的表型轉(zhuǎn)換，其中大量基因被差異調(diào)節(jié)和表達(dá)(blasi?f.等人respiratory?medicine,2016,117:190-197；becker?p.等人,appl.env.microbiology,2001年7月,67(7):2958-2965；trubenova等人trends?in?microbiol,2022年3月22日,https://doi.org/10.1016/j.tim.2022.02.005)。事實上，形成生物膜的病原體展示與由相同病原體在浮游生長階段中所展示的特征不同的特征，包括對抗生素的耐藥性或敏感性。這些差異解釋了為什么許多對浮游(快速生長)的細(xì)菌有效的抗生素對包埋在生物膜中的相同細(xì)菌無效，在所述生物膜中包埋的細(xì)菌還具有降低的生長速率或是靜止的，并且因此對最常見的抗生素活性背后的機制較不敏感。這也可以解釋為什么診斷方法也可能無法確定細(xì)菌感染中的抗生素敏感性和最適合的抗生素療法：診斷試驗通常是針對處于生長的浮游階段中的細(xì)菌進行的，而感染則通過生物膜生長的細(xì)菌維持在潛伏狀態(tài)中(trubenova等人2022)。此外，直到最近，生物膜生長的細(xì)菌都通過為浮游細(xì)菌開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)測定進行研究，而處于該階段中的生物膜生長的細(xì)菌的研究需要特定的試驗，不幸的是，這些試驗仍然缺乏良好的標(biāo)準(zhǔn)化。如blasi,2016(如上所引用，參見圖1)中所明確概述的，生物膜形成是一個多步驟的過程，其中細(xì)菌需要以可逆的方式粘附到基質(zhì)上，然后它們的粘附變成不可逆的，只有那時它們才發(fā)展出小菌落，并且之后，它們才發(fā)展出具有成熟生物膜的穩(wěn)定菌落。銅綠假單胞菌在醫(yī)院獲得性感染中具有高發(fā)病率，并且與高死亡率相關(guān)。此外，它參與多種持續(xù)性生物膜感染，并且是肺部慢性感染中的主要病原體。morse等人(frontiersin?immunology,2021,12:1-15)綜述了處于生長的生物膜階段中的該病原體與人類免疫系統(tǒng)之間的相互作用，并且圖1報告了生物膜的不同成熟階段的清晰示意圖，其中包括年輕的生物膜和成熟/年老的生物膜，每種生物膜都包含不同的細(xì)胞群以及不同的特征。通常，生物膜相關(guān)的感染保持無癥狀，直到生物膜已達(dá)到成熟/年老的階段并且開始釋放浮游細(xì)胞或生物膜碎片(即，所謂的腐敗性栓子(septic?emboli))，這些是疾病的臨床表現(xiàn)的原因。常規(guī)的抗生素治療通常可以殺滅從生物膜中釋放的浮游細(xì)胞和部分生物膜包埋細(xì)胞，“耐藥株(persister)”細(xì)胞(由于特有的生理狀態(tài)，對抗生素不敏感的休眠細(xì)胞)維持在生物膜內(nèi)，并且準(zhǔn)備促進感染的復(fù)發(fā)。此外，已顯示銅綠假單胞菌中的多糖組分，特別是鼠李糖脂，充當(dāng)強力清潔劑，引起細(xì)胞壞死和中性粒細(xì)胞消除，因此進一步屏蔽病原體免受宿主免疫反應(yīng)(jensen?p.等人,microbiology,2007,153:1329-1338)。在文獻中，關(guān)于抗生素和粘液溶解劑如nac之間的假設(shè)的相互作用，報告了有爭議的結(jié)果。在1981年，roberts和cole發(fā)現(xiàn)2％-5％的nac展示出對銅綠假單胞菌的抗微生物活性，并且低濃度的nac增強了羧芐西林對銅綠假單胞菌的作用(journal?of?infection第3卷,第4期,1981年12月,353-359頁)。在2016年，由landini等人進行的關(guān)于高nac濃度對針對一系列呼吸系統(tǒng)病原體的抗生素活性的影響的研究結(jié)果，證明高nac濃度不干擾最常使用的抗生素的活性，而nac損害碳青霉烯類的活性(landini等人.antimicrob.agents?chemother.2016年12月第60卷第12期7513-7517)。然而，所有nac誘導(dǎo)的生物學(xué)機制尚未被完全闡明。nac和粘菌素對嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(s.maltophilia)和鮑氏不動桿菌(a.baumannii)的強協(xié)同活性已由相同的申請人在wo2018/154091中描述。這些病原體的感染通常對健康人無害，僅在免疫功能低下的患者中引起嚴(yán)重肺炎，并且僅很少與致命后果相關(guān)。charrier等人在：“cysteaminea?novel?mucoactiveantimicrobial&antibiofilm?agent?for?the?treatment?of?cystic?fibrosis”orphanetjournal?of?rare?diseases?2014?9:189；doi:10.1186/s13023-014-0189-2)中公開了半胱胺在增加銅綠假單胞菌對妥布霉素的敏感性方面的活性。他關(guān)注了該粘液溶解劑的活性，主要關(guān)注半胱胺對dna和粘蛋白(粘液的兩種主要組分)的粘彈性性質(zhì)、對預(yù)防生物膜形成的影響、和半胱胺的殺滅作用。銅綠假單胞菌參與多種持續(xù)性生物膜感染。在慢性肺部患者中，銅綠假單胞菌感染與頻繁加重和較高的死亡率相關(guān)(malhotra等人2019clin.microbiol.rev.32(3):e00138-18；parkins等人clin?microbiol?rev31(4):e00019-18)。此外，宿主固有免疫和適應(yīng)性免疫的激活導(dǎo)致慢性炎癥狀態(tài)和導(dǎo)致廣泛的組織損傷，深刻影響肺功能。這使得對該病原體的有效治療變得極其緊迫，特別是對這些患者而言。值得注意的是，在患有囊性纖維化或其他慢性呼吸系統(tǒng)疾病的患者中，粘菌素常常用作被由該病原體或其他多重耐藥非發(fā)酵革蘭氏陰性病原體(例如，鮑氏不動桿菌(acinetobacter?baumannii)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(stenotrophomonas?maltophilia))引起的感染的最后的治療手段，因此也增加了在屬于不同菌株的病原體之間發(fā)展和傳播對該抗生素的耐藥性的風(fēng)險。因此，鑒于過去幾年內(nèi)多重耐藥表型的擴散和新一代抗生素的低功效，能夠克服和繞過細(xì)菌病原體(特別是主要病原體銅綠假單胞菌)的免疫逃逸機制的新的治療選擇極為緊迫。

背景技術(shù)：

技術(shù)實現(xiàn)思路

0、發(fā)明概述

1、本發(fā)明涉及粘菌素和n-乙酰半胱氨酸(nac)的協(xié)同組合用于治療由病原體銅綠假單胞菌引起的細(xì)菌感染中的用途，其中所述病原體處于生長的生物膜階段中。優(yōu)選地，所述細(xì)菌感染與呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)，如慢性阻塞性肺疾病(copd)、囊性纖維化(cf)，非囊性纖維化支氣管擴張(ncfb)、呼吸機相關(guān)性肺炎(vap)及其加重。

2、所述組合對病原體具有多重耐藥(mdr)或粘菌素耐藥(cstr)表型的銅綠假單胞菌感染特別有用，如，例如在醫(yī)院相關(guān)感染(hai)或醫(yī)療保健相關(guān)感染(hcai)中。

3、當(dāng)所述兩種藥物通過相同或不同的施用途徑，在施用時間段重疊或不重疊的情況下，按順序或分開地同時施用，即使不是一起施用時，粘菌素和nac的組合也是協(xié)同的。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，粘菌素通過吸入途徑施用。

4、本發(fā)明的另外的目的是部件套盒，其包含一小瓶呈散劑的粘菌素和一小瓶nac水性溶液或作為片劑或顆粒劑的nac，任選地與稀釋裝置組合，用于聯(lián)合施用粘菌素和nac的協(xié)同組合。

5、用粘菌素和nac的協(xié)同組合用于治療銅綠假單胞菌感染的治療方法(其中病原體處于生長的生物膜階段中)，以及用于根除有此需要的受試者中這樣的細(xì)菌感染的治療方法，也是被包含在本發(fā)明內(nèi)的實施方案。

6、附圖簡要描述

7、圖1.n-乙酰半胱氨酸(nac)8000mg/l(灰色方塊)，粘菌素2、4和8mg/l(分別帶有淺灰色、深灰色和黑色邊框的空心方塊)，以及nac?8000mg/l與粘菌素2、4和8mg/l的組合(分別帶有淺灰色、深灰色和黑色邊框的灰色方塊)對來自cf(粘液型和粘菌素敏感的)的銅綠假單胞菌z154的抗生物膜活性。填充的圓圈表示不存在nac和/或粘菌素的生物膜(即，對照)。符號上面的黑色實線表示中位數(shù)值。x軸設(shè)定在檢測限處(即，20cfu/peg)。使用帶有dunn氏校正的克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(kruskal-wallis?test)確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。****,p<0.0001。cfu：菌落形成單位。

8、圖2.n-乙酰半胱氨酸(nac)8000mg/l(灰色方塊)、粘菌素8mg/l(空心方塊)和nac/粘菌素組合(帶有黑色邊框的灰色方塊)對銅綠假單胞菌pao1(a)和來自cf的銅綠假單胞菌z34(b)(兩者均為非粘液型和粘菌素敏感的)的抗生物膜活性。填充的圓圈表示不存在nac和/或粘菌素的生物膜(即，對照)。符號上面的黑色實線表示中位數(shù)值。x軸設(shè)定在檢測限處(即，20cfu/peg)。使用帶有dunn氏校正的克魯斯卡爾-沃利斯檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。***,p<0.001；****,p<0.0001。cfu：菌落形成單位。

9、圖3.n-乙酰半胱氨酸(nac)8000mg/l(灰色方塊)、粘菌素8mg/l(空心方塊)和nac/粘菌素組合(帶有黑色邊框的灰色方塊)對銅綠假單胞菌m19(a)和銅綠假單胞菌m25(b)(兩者均來自cf，為粘液型和粘菌素敏感的)的抗生物膜活性。填充的圓圈表示不存在nac和/或粘菌素的生物膜(即，對照)。符號上面的黑色實線表示中位數(shù)值。x軸設(shè)定在檢測限處(即，20cfu/peg)。使用帶有dunn氏校正的克魯斯卡爾-沃利斯檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001。cfu：菌落形成單位。

10、圖4.n-乙酰半胱氨酸(nac)8000mg/l(灰色方塊)、粘菌素32mg/l(空心方塊)和nac/粘菌素組合(帶有黑色邊框的灰色方塊)對來自cf的銅綠假單胞菌fc238(非粘液型和粘菌素敏感的)的抗生物膜活性。填充的圓圈表示不存在nac和/或粘菌素的生物膜(即，對照)。符號上面的黑色實線表示中位數(shù)值。x軸設(shè)定在檢測限處(即，20cfu/peg)。使用帶有dunn氏校正的克魯斯卡爾-沃利斯檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。****,p<0.0001。cfu：菌落形成單位。

11、圖5.n-乙酰半胱氨酸(nac)8000mg/l(灰色方塊)、粘菌素64mg/l(空心方塊)和nac/粘菌素組合(帶有黑色邊框的灰色方塊)在asm生物膜模型中對銅綠假單胞菌z154(a)和銅綠假單胞菌z34(b)的抗生物膜活性。填充的圓圈表示不存在nac和/或粘菌素的生物膜(即，對照)。符號上面的黑色實線表示中位數(shù)值。x軸設(shè)定在檢測限處(即，100cfu/ml)。使用帶有dunn氏校正的克魯斯卡爾-沃利斯檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001。cfu：菌落形成單位。

12、圖6.殺滅曲線，其顯示無氧(a)和有氧(b)條件對n-乙酰半胱氨酸(nac)8000mg/l(灰色方塊)、粘菌素0.25mg/l(空心方塊)、和nac/粘菌素組合(帶有黑色邊框的灰色方塊)治療指數(shù)生長的銅綠假單胞菌z154的浮游培養(yǎng)物的差異影響。填充的圓圈表示不存在nac和/或粘菌素的浮游培養(yǎng)物(即，對照)。繪制帶有范圍的中位數(shù)值。虛線指示檢測限(即，17cfu/ml)。cfu：菌落形成單位。