本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物活性物質(zhì)提取純化領(lǐng)域，尤其一種樟樹籽仁中植物活性成分及其分離純化方法。

背景技術(shù)：

1、植物活性成分如多酚、黃酮、生物堿等，是植物體內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)生的一類天然有機(jī)化合物，廣泛存在于植物體的各個(gè)組織中。植物活性成分具有很好的生理活性，如：清除自由基、抗氧化、延緩衰老、抑菌消炎、改善腸道菌群、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤和抗癌變等作用。

2、近年來(lái)，從農(nóng)副產(chǎn)品餅粕中回收利用天然活性物質(zhì)(植物蛋白、多糖多酚、黃酮、生物堿、皂苷等)是提高農(nóng)副產(chǎn)品資源化利用的有效方法。采用溶劑提取法分離和大孔樹脂純化結(jié)合得到植物原料中的植物活性成分是較為成熟的方法。如申請(qǐng)公布號(hào)為cn103012544a公開了一種從茶油籽餅粕中提取皂素和多糖的方法，包括石油醚脫脂、水提取皂素和多糖、大孔樹脂純化皂素等步驟，從茶油籽餅粕中提取皂素和多糖。相較于水乳化萃取方法，該方法需使用有毒、易燃易爆的有機(jī)溶劑，生產(chǎn)過(guò)程中存在易燃易爆等安全隱患，植物副產(chǎn)物中存在有機(jī)溶劑殘留等問(wèn)題。

3、在(乙醇酸法脫菜籽酚及硫苷的工藝研究及對(duì)蛋白品質(zhì)的影響，食品工業(yè)科技，張逸濛，2020年)中用乙醇對(duì)菜籽進(jìn)行脫酚、脫硫苷處理，以節(jié)能環(huán)保的水媒法對(duì)提油后得到的水相蛋白進(jìn)行提取，得到了純度為63.63％的高品質(zhì)蛋白。該方法為減少乙醇處理對(duì)蛋白溶出的影響，采用乙醇對(duì)整粒菜籽預(yù)處理，脫除了菜籽中的多酚和硫苷，從而得到高品質(zhì)水相蛋白。但(醇變性大豆蛋白在物理改性條件下的溶出行為和機(jī)理，食品與發(fā)酵工業(yè)，華欲飛，2004年)指出，乙醇溶液會(huì)造成蛋白質(zhì)醇變性，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。醇變性蛋白的變性態(tài)構(gòu)象的α-螺旋程度比天然態(tài)構(gòu)象的更高，而熱變性等其他變性方式處理后，蛋白質(zhì)構(gòu)象一般從有規(guī)律的α-螺旋、β-折疊變成不規(guī)則的隨機(jī)卷曲構(gòu)象。因此，乙醇預(yù)處理雖然能得到高純度的蛋白，但可能存在使蛋白結(jié)構(gòu)變性的風(fēng)險(xiǎn)。

4、在(醇洗前處理對(duì)樟樹籽仁分離蛋白產(chǎn)品及其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，中國(guó)油脂，孫旦，2022年)中使用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)脫脂樟樹籽仁粉進(jìn)行前處理后，用堿溶酸沉法制備了高純度的樟樹籽仁分離蛋白。雖然該方法經(jīng)體積分?jǐn)?shù)55％～85％乙醇能有效脫除酚類物質(zhì)，且醇處理對(duì)樟樹籽仁蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響。但是堿溶酸沉的工藝會(huì)導(dǎo)致樟樹籽仁蛋白質(zhì)分子間的氫鍵被破壞，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角減少，無(wú)規(guī)卷曲和α-螺旋增加等問(wèn)題。因此，找到合適的高品質(zhì)蛋白提取方法對(duì)農(nóng)副產(chǎn)品資源化利用至關(guān)重要。

5、樟樹作為景觀樹被廣泛栽培于我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)，年產(chǎn)量達(dá)500萬(wàn)噸以上，而樟樹籽除用于培育樟樹苗外，至今未得到合理開發(fā)利用，每遇果實(shí)成熟季節(jié)脫落而嚴(yán)重污染城鄉(xiāng)環(huán)境。樟樹籽仁富含中鏈油脂(56～60％)和蛋白質(zhì)(18～25％)，是全球唯一、中國(guó)獨(dú)有的天然中鏈油脂和蛋白資源。目前有關(guān)樟樹籽開發(fā)利用的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中于樟樹籽仁油的提取技術(shù)、生理作用(生物活性)及轉(zhuǎn)化修飾等方面，但有關(guān)樟樹籽仁中含量達(dá)40％以上的蛋白、多糖、多酚、黃酮、生物堿物質(zhì)的分離、鑒定及利用方面的研究報(bào)道很少。

6、以水為分離介質(zhì)、采用乳化萃取-破乳化分離(水乳化萃取法)提取樟樹籽仁油，不僅可以得到優(yōu)質(zhì)中鏈油脂(中鏈脂肪酸含量大于95％)，還不會(huì)破壞副產(chǎn)物中蛋白、多糖、多酚、黃酮、生物堿等物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物活性。然而，工業(yè)中未能將水提植物油過(guò)程中的中間層水相進(jìn)行有效利用而直接排放，這造成了能源浪費(fèi)和環(huán)境污染。因此，為實(shí)現(xiàn)樟樹籽的高值化利用，將水提樟樹籽仁油過(guò)程的中間層水相中的生物活性物質(zhì)富集回收具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述存在的問(wèn)題，本發(fā)明提出一種樟樹籽仁中植物活性成分及其分離純化方法,采用水乳化萃取法自樟樹籽仁中分離出乳化相(樟樹籽仁油)、水相(中間層水相)和渣相，再經(jīng)大孔樹脂吸附對(duì)水相(中間層水相)富集和純化得到樟樹籽仁植物活性成分，具有方法簡(jiǎn)單、綠色無(wú)污染，成本低等優(yōu)點(diǎn)，而且制備得到的樟樹籽仁植物活性成分產(chǎn)量高，提取率高，質(zhì)量高，提高了樟樹籽資源的綜合利用效率，可滿足更多領(lǐng)域的要求。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是根據(jù)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、本發(fā)明第一方面提供一種樟樹籽仁中植物活性成分的分離純化方法，包括以下步驟：

4、步驟s1：將新鮮樟樹籽仁與水混合，經(jīng)膠體磨濕法超微粉碎后得到漿液ⅰ，經(jīng)離心分離得到上層乳化相ⅰ、中間層水相ⅰ和下層渣相??；將中間層水相ⅰ和下層渣相ⅰ再次經(jīng)膠體磨濕法超微粉碎后得到漿液ⅱ，經(jīng)離心分離得到上層乳化相ⅱ、中間層水相ⅱ和下層渣相ⅱ；收集中間層水相ⅱ，冷藏備用；

5、步驟s2：采用hj-18型大孔樹脂對(duì)中間層水相ⅱ中樟樹籽仁植物活性成分進(jìn)行靜態(tài)或動(dòng)態(tài)吸附，其中，靜態(tài)吸附時(shí)，以樹脂對(duì)多酚的吸附量判定是否達(dá)到吸附平衡；動(dòng)態(tài)吸附時(shí)，中間層水相ⅱ按照5～10倍柱體積以1.5bv/h的流速流經(jīng)樹脂填料，使得樹脂充分吸附，收集流經(jīng)大孔樹脂后的水相；

6、步驟s3：若步驟s2中采用靜態(tài)吸附，吸附平衡后過(guò)濾或離心回收樹脂，同時(shí)收集大孔樹脂富集后的水相；采用80％的乙醇溶液對(duì)樹脂進(jìn)行靜態(tài)解吸附，以上清液中多酚的解吸量判定是否達(dá)到解吸平衡；若步驟s2中采用動(dòng)態(tài)吸附，采用80％的乙醇溶液對(duì)吸附飽和的hj-18型樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)解吸，控制洗脫流速為3.0bv/h；

7、步驟s4：靜態(tài)解吸平衡后進(jìn)行過(guò)濾或離心回收洗脫液，將洗脫液減壓旋轉(zhuǎn)蒸餾回收乙醇，除去洗脫劑后，真空冷凍干燥獲得樟樹籽仁植物活性成分；動(dòng)態(tài)解吸完成后，回收洗脫液，將洗脫液減壓蒸餾，除去洗脫劑后，真空冷凍干燥獲得富集的樟樹籽仁植物活性成分。

8、本發(fā)明采用水乳化萃取法自樟樹籽仁中分離出乳化相(樟樹籽仁油)、水相(中間層水相)和渣相，再經(jīng)大孔樹脂吸附對(duì)水相(中間層水相)富集和純化得到樟樹籽仁植物活性成分。大孔樹脂屬于功能高分子材料，是一類有機(jī)高聚物吸附劑，其孔徑與比表面積都比較大，在樹脂內(nèi)部具有三維空間立體孔結(jié)構(gòu)，具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長(zhǎng)、宜于構(gòu)成閉路循環(huán)、節(jié)省費(fèi)用等諸多優(yōu)點(diǎn)，且不溶于酸、堿及各種溶劑。本發(fā)明提出的一種用大孔樹脂富集純化水乳化萃取樟樹籽仁油過(guò)程的中間層水相中樟樹籽仁植物活性成分的工藝，通過(guò)大孔樹脂富集純化的方法具有方法簡(jiǎn)單、綠色無(wú)污染，成本低等優(yōu)點(diǎn)，而且制備得到的樟樹籽仁植物活性成分產(chǎn)量高，提取率高，質(zhì)量高，可滿足更多領(lǐng)域的要求。此外，經(jīng)大孔樹脂處理可將水相中的活性物質(zhì)和蛋白分離，不僅可以富集得到樟樹籽仁活性物質(zhì)，還可提高樟樹籽仁水相蛋白的品質(zhì)，為水乳化萃取樟樹籽仁油的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

9、一種優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述步驟s1中新鮮樟樹籽仁與水混合的料液比為1：(3-5)；超微粉碎時(shí)間均為4-6min，離心分離轉(zhuǎn)速為4000-6000rpm，時(shí)間為15-30min。

10、一種優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述步驟s2中hj-18型大孔樹脂在進(jìn)行靜態(tài)或動(dòng)態(tài)吸附前進(jìn)行預(yù)處理，其預(yù)處理方法為：將大孔樹脂置于3～4倍樹脂體積的95％乙醇浸泡，待樹脂充分溶脹，溶脹12-24h后，用蒸餾水沖洗樹脂至無(wú)醇味，接著用1m?hcl溶液浸泡6-12h，用純化水沖洗樹脂至中性，再用1m?naoh溶液浸泡6-12h，用純化水沖洗樹脂至中性，即可得處理好的大孔樹脂，將樹脂加純化水浸泡備用。

11、一種優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述步驟s2中靜態(tài)吸附的具體過(guò)程為：將大孔樹脂加入到中間層水相ⅱ中，密封置于150r/min的恒溫?fù)u床中，室溫下振蕩吸附至吸附平衡。

12、一種優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述步驟s2中所述吸附量根據(jù)以下公式計(jì)算：

13、

14、式中：qe為吸附量，mg/g；c0為中間層水相ⅱ中初始多酚濃度，mg/ml；ce為吸附平衡時(shí)多酚濃度，mg/ml；vi為中間層水相ⅱ的體積，ml；w為大孔吸附樹脂的濕重量，g。

15、一種優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述多酚濃度的測(cè)定采用福林酚法，具體操作過(guò)程按照以下步驟：

16、(1)樣品處理：取0.5ml待測(cè)樣品，加入2ml無(wú)水乙醇，在3500rpm下離心5min，得到上清液；

17、(2)樣品中多酚含量的測(cè)定：吸取1ml上清液，加入0.5ml福林-酚試劑，混合均勻，加入2ml?7.5％的na2co3溶液，并用超純水補(bǔ)齊至總體積為10ml，渦旋振蕩1min，于70℃水浴反應(yīng)30min，自然冷卻至室溫，以蒸餾水作空白，以沒食子酸為參照物建立標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)價(jià)多酚含量，在765nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，經(jīng)計(jì)算得到多酚濃度(mg?gae/ml)。

18、一種優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述步驟s2中動(dòng)態(tài)吸附的具體過(guò)程為：將完成預(yù)處理的大孔樹脂濕法裝入層析柱中，用蒸餾水平衡后，將中間層水相ⅱ以1.5bv/h的流速通過(guò)層析柱并收集流出液；所述步驟s3中動(dòng)態(tài)解吸的具體過(guò)程為：首先使用3～5bv的蒸餾水，以3.0bv/h的流速流經(jīng)樹脂填料，以除去蛋白和色素，待流出液在od280nm為0時(shí)，將5～10bv的80％的乙醇溶液洗脫液以3.0bv/h的流速流經(jīng)樹脂填料。

19、一種優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述步驟s3中靜態(tài)解吸附的具體過(guò)程為：將過(guò)濾或離心獲得的大孔樹脂材料，用蒸餾水沖洗除去表面蛋白和色素后，用濾紙吸干水分，按照固液比1：(5-10)(w/v)加入80％的乙醇溶液作為洗脫劑，密封置于150r/min的恒溫?fù)u床中，室溫下振蕩解吸1～2h，進(jìn)行解吸附，隨后靜置沉降。

20、一種優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述步驟s3中解吸量根據(jù)以下公式計(jì)算：

21、

22、式中：qd為解吸量，mg/g；cd為解吸液中多酚的濃度，mg/ml；vd為解吸液體積，ml；w為大孔吸附樹脂的濕重量，g。

23、本發(fā)明第二方面提供一種樟樹籽仁中植物活性成分提取物，是根據(jù)任一項(xiàng)上述的一種樟樹籽仁中植物活性成分的分離純化方法獲得。

24、本發(fā)明第三方面提供一種樟樹籽仁中蛋白質(zhì)，根據(jù)任一項(xiàng)上述的一種樟樹籽仁中植物活性成分的分離純化方法中獲得大孔樹脂靜態(tài)吸附后的水相或者動(dòng)態(tài)流經(jīng)大孔樹脂后的水相，經(jīng)干燥后制備而得。

25、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果：

26、本發(fā)明的方法充分利用水乳化萃取樟樹籽仁油過(guò)程中產(chǎn)生的中間層水相，在有效地富集中間層水相中的植物活性成分的同時(shí)，提高了水相蛋白的品質(zhì)，這有利于樟樹籽資源的充分利用。本提取方法條件溫和，操作簡(jiǎn)便快速，富集效率高，在得到高品質(zhì)樟樹籽仁油的同時(shí)，有效的富集了中間層水相中的活性物質(zhì)，提高了中間層水相中蛋白的品質(zhì)。此外，本發(fā)明中的大孔樹脂材料經(jīng)再生后可重復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本。本方法純化過(guò)程中僅使用低濃度的naoh和hcl溶液，不使用其他有機(jī)溶劑，同時(shí)樹脂解吸過(guò)程中只使用乙醇，提取試劑無(wú)毒無(wú)害無(wú)污染，是一種安全環(huán)保的從水乳化萃取樟樹籽仁油過(guò)程的中間層水相中富集純化植物活性成分的方法。