本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種胞內(nèi)細(xì)胞器級聯(lián)損傷調(diào)控腫瘤代謝并誘導(dǎo)泛凋亡的方法應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在動(dòng)態(tài)的細(xì)胞質(zhì)環(huán)境中，真核細(xì)胞具有許多細(xì)胞內(nèi)區(qū)室，如膜結(jié)合細(xì)胞器、非膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架。首先，細(xì)胞骨架成分通過肌動(dòng)球蛋白收縮直接對細(xì)胞器施加力，細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)或基于馬達(dá)蛋白的運(yùn)輸。其次，細(xì)胞器在有限的細(xì)胞質(zhì)空間中的交織運(yùn)輸促進(jìn)了細(xì)胞器之間的物理接觸。同時(shí)，大多數(shù)細(xì)胞器都是高度動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，其快速重塑，如融合、分裂和管狀化，能夠與細(xì)胞骨架共同維持細(xì)胞的正常功能。細(xì)胞器穩(wěn)態(tài)對于維持細(xì)胞的正常生理活動(dòng)十分重要。

2、真核細(xì)胞中最常見的細(xì)胞器包括溶酶體，線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。其中溶酶體是控制許多細(xì)胞過程的分解代謝細(xì)胞器，可補(bǔ)充氨基酸、脂質(zhì)、糖、離子和核苷酸的細(xì)胞儲(chǔ)存，為細(xì)胞合成代謝途徑提供燃料。此外溶酶體豐度的異常變化與眾多疾病高度有關(guān)。線粒體是重要的雙膜結(jié)合細(xì)胞器，細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和atp產(chǎn)生的主要場所，在機(jī)體正常生理功能下，線粒體生命周期處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，線粒體表達(dá)量以及活性的變化與細(xì)胞生長分化、信息傳遞、代謝需求和細(xì)胞凋亡等過程高度相關(guān)。作為細(xì)胞死亡途徑的匯聚點(diǎn)，線粒體在凋亡和非凋亡程序性細(xì)胞死亡中起著關(guān)鍵作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)是最大的內(nèi)膜細(xì)胞器，控制著許多細(xì)胞功能，包括蛋白質(zhì)折疊/錯(cuò)誤折疊/解折疊、細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)分泌等；盡管這一過程受到精準(zhǔn)調(diào)節(jié)，但各種外部和細(xì)胞內(nèi)因素可以破壞蛋白質(zhì)折疊能力并引發(fā)er應(yīng)激。在腫瘤中，各種遺傳和轉(zhuǎn)錄異常、代謝改變和微環(huán)境擾動(dòng)(如氧化應(yīng)激、氧限制、營養(yǎng)剝奪和高代謝需求)，使癌細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)免疫逃逸和增強(qiáng)抗凋亡等促生存機(jī)制，從而加速腫瘤進(jìn)程。

3、長期以來，現(xiàn)有的程序性細(xì)胞死亡(pcd)形式中，細(xì)胞焦亡、細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡一直被認(rèn)為是并行運(yùn)作的，幾乎沒有重疊，其各自復(fù)雜的分子機(jī)制負(fù)責(zé)細(xì)胞死亡的啟動(dòng)、轉(zhuǎn)導(dǎo)和執(zhí)行，但實(shí)際上這三種途徑之間存在復(fù)雜的串?dāng)_，并且可以相互交叉調(diào)節(jié)。其中具有凋亡、焦亡和壞死性凋亡特征的新型死亡方式可以被概括為泛凋亡，泛凋亡成為殺死腫瘤細(xì)胞的一種途徑，但引起泛凋亡的方式仍然需要探索。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于提供一種多羥基富勒烯材料。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供該多羥基富勒烯材料在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

3、本發(fā)明的另一目的在于提供一種誘導(dǎo)腫瘤泛凋亡的方法。

4、為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的一方面，提供了一種多羥基富勒烯材料，所述多羥基富勒烯材料的結(jié)構(gòu)為式(i)所示：

5、

6、其中，

7、f為富勒烯；

8、t為末端帶有羥基的化合物分子，t與富勒烯共價(jià)結(jié)合；

9、n為30-44。

10、在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述f和t通過加成反應(yīng)以共價(jià)鍵的形式相結(jié)合。

11、在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述共價(jià)鍵選自碳氧單鍵、碳碳單鍵或碳氮單鍵的一種。

12、在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述富勒烯選自空心富勒烯、金屬富勒烯中的一種或多種。

13、在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述空心富勒烯選自c2n中的一種或多種，其中2n為碳原子數(shù)，30≤n≤60。

14、在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述金屬富勒烯選自m@c2n、m2@c2n和ma@c2n中的一種或多種，其中m和a均代表金屬元素且m、a均獨(dú)立的選自sc、y和鑭系金屬元素中的任意一種；可選地，所述鑭系金屬元素包括鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿、镥，30≤n≤60。

15、在一個(gè)實(shí)施例中，所述富勒烯選自c60、c70、c76、c78、c80的一種或多種。

16、在一個(gè)實(shí)施例中，所述富勒烯選自c60、c70的一種或兩種。

17、在一個(gè)實(shí)施例中，所述金屬富勒烯為gd@c82。

18、在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述t選自羥基、末端羥基化修飾的糖類衍生物、末端羥基化修飾的氨基酸衍生物、末端羥基化修飾的核苷酸衍生物中的一種或多種。

19、在一個(gè)實(shí)施例中，所述t為羥基。

20、在一個(gè)實(shí)施例中，所述富勒烯選自c60、c70的一種或兩種；所述t可為純羥基和/或末端羥基化修飾的糖類衍生物。

21、在一個(gè)實(shí)施例中，所述富勒烯選自c60、c70的一種或兩種；所述t可為純羥基和/或末端羥基化修飾的氨基酸衍生物。

22、在一個(gè)實(shí)施例中，所述富勒烯選自c60、c70的一種或兩種；所述t可為純羥基和/或末端羥基化修飾的核苷酸衍生物。

23、在一些實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料中末端羥基的平均數(shù)量為30-44。可以理解，末端羥基的數(shù)量在30-44之間，不要求所述富勒烯材料中每個(gè)富勒烯分子攜帶的羥基數(shù)量或末端羥基數(shù)量均在30-44范圍內(nèi)，例如實(shí)際上富勒烯攜帶的末端羥基數(shù)量可以為在21-41之間。

24、在一些實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料中末端羥基的平均數(shù)量為38，幫助提高富勒烯材料的磷脂雙分子層穿膜效果。

25、在一些實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料中羥基的平均數(shù)量為30-44。

26、在一些實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料中羥基的平均數(shù)量為38。

27、在一些實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料為c60(oh)30-44；優(yōu)選地，所述多羥基富勒烯材料為c60(oh)38。

28、在一些實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料的平均水合粒徑在140-150nm之間，優(yōu)選為143.6nm。

29、本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種前述任一種多羥基富勒烯材料的制備方法。

30、可以理解，所述多羥基富勒烯可以通過直接將羥基加成到富勒烯的碳籠上得到或者先在富勒烯的碳籠上修飾便于和其他分子共價(jià)連接的基團(tuán)(例如氨基)得到富勒烯前體，再通過碳籠上修飾的便于和其他分子共價(jià)連接的基團(tuán)與末端帶有羥基的化合物分子連接得到。

31、其中，在富勒烯的碳籠上修飾便于和其他分子共價(jià)連接的基團(tuán)可以通過本領(lǐng)域常用方法，例如普拉托反應(yīng)(prato反應(yīng))和賓格爾反應(yīng)(bingel)反應(yīng)。

32、在一個(gè)實(shí)施例中，所述富勒烯可為帶有prato單取代基團(tuán)的富勒烯前體材料；所述t可為純羥基和/或末端羥基化修飾的糖類衍生物。

33、在一個(gè)實(shí)施例中，所述富勒烯可為帶有prato單取代基團(tuán)的富勒烯前體材料；所述t可為純羥基和/或末端羥基化修飾的氨基酸衍生物。

34、在一個(gè)實(shí)施例中，所述富勒烯可為帶有prato單取代基團(tuán)的富勒烯前體材料；所述t可為純羥基和/或末端羥基化修飾的核苷酸衍生物。

35、在一個(gè)實(shí)施例中，所述富勒烯可為帶有bingel單取代基團(tuán)的富勒烯前體材料；所述t可為純羥基和/或末端羥基化修飾的糖類衍生物。

36、在一個(gè)實(shí)施例中，所述富勒烯可為帶有bingel單取代基團(tuán)的富勒烯前體材料；所述t可為純羥基和/或末端羥基化修飾的氨基酸衍生物。

37、在一個(gè)實(shí)施例中，所述富勒烯可為帶有bingel單取代基團(tuán)的富勒烯前體材料；所述t可為純羥基和/或末端羥基化修飾的核苷酸衍生物。

38、在一個(gè)實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料的制備方法包括將過氧化氫中的羥基加成到富勒烯的碳籠上的步驟。

39、在一個(gè)實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料的制備方法包括將待修飾的富勒烯溶于有機(jī)溶劑和以相轉(zhuǎn)移催化劑為媒介將過氧化氫中的羥基加成到富勒烯的碳籠上的步驟。

40、在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述多羥基富勒烯材料的制備方法包括將待修飾的富勒烯固體粉末溶于有機(jī)溶劑，將相轉(zhuǎn)移催化劑和過氧化氫水溶液加入富勒烯有機(jī)溶劑中，經(jīng)恒溫?cái)嚢?，重結(jié)晶，洗滌，干燥得到所述多羥基富勒烯材料。

41、在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述相轉(zhuǎn)移催化劑選自季銨鹽類、冠醚類、鏈狀聚乙二醇類、環(huán)狀聚醚類、胺類、以及堿溶液中的一種或多種。

42、在一個(gè)實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料的制備方法包括以下步驟：

43、(1)將富勒烯固體粉末溶于有機(jī)溶液，加入過氧化氫水溶液和tbah，充分反應(yīng)；

44、(2)冷卻，分離水溶液，加入不良溶劑重結(jié)晶，得到乳白色沉淀；

45、(3)將沉淀溶解在去離子水中并添加所述不良溶劑重新沉淀，洗滌；

46、(4)在室溫下真空干燥步驟(3)的沉淀得到多羥基富勒烯粉末。

47、在一個(gè)實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料的制備方法中，所述富勒烯為c60。

48、在一個(gè)實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料的制備方法中，所述有機(jī)溶液為1,2,4-三甲苯溶液。

49、在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述多羥基富勒烯材料的制備方法中，所述充分反應(yīng)為置于空氣中60-90℃攪拌12-20小時(shí)；優(yōu)選65-85℃攪拌15-18小時(shí)；更優(yōu)選70℃攪拌16小時(shí)。

50、在一個(gè)實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料的制備方法中，所述洗滌為使用醇溶劑洗滌，優(yōu)選甲醇。

51、在一個(gè)實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料的制備方法中，所述相轉(zhuǎn)移催化劑為四丁基氫氧化銨(tbah)。

52、在一個(gè)實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料的制備方法中，所述過氧化氫水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％。

53、在一個(gè)實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料的制備方法中，所述不良溶劑為2-丙醇、乙酸乙酯和己烷中的一種或幾種；

54、在一個(gè)實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料的制備方法中，所述洗滌的次數(shù)為2-4次，優(yōu)選2次。

55、在一個(gè)實(shí)施例中，所述多羥基富勒烯材料的制備方法為：將c60固體粉末溶于1,2,4-三甲苯溶液，再向混合液體中加入30％過氧化氫水溶液和tbah，將混合物在空氣中于70℃攪拌16小時(shí)，直至紫色1,2,4-三甲苯層變成無色透明溶液；冷卻混合物后，分離出淡黃色水溶液，加入2-丙醇、乙酸乙酯和己烷的混合溶劑(5:4:5)，得到乳白色沉淀；將沉淀物溶解在去離子水中并如上所述通過添加不良溶劑重新沉淀，然后用甲醇洗滌；在室溫下真空干燥固體得到多羥基富勒烯材料(mf)白色至黃色粉末。

56、在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供前述少羥基富勒烯材料(ff)的制備方法，包括將待修飾的富勒烯溶于有機(jī)溶劑，以相轉(zhuǎn)移催化劑為媒介將過氧化氫中的羥基加成到富勒烯的碳籠上的步驟，其中，所述相轉(zhuǎn)移劑為堿溶液；所述有機(jī)溶劑選自下述至少一種：甲苯、二甲苯、鄰二甲苯、1,2,4-三甲苯；優(yōu)選地，所述溶劑為甲苯。

57、在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供前述少羥基富勒烯材料(ff)的制備方法為稱取c60固體粉末50mg，于圓底燒瓶中，緩慢滴加5ml雙氧水(30％)(緩慢滴加，避免濺到瓶壁)，緩慢攪拌，均勻分散，滴加15ml?15％的naoh溶液，加完后劇烈攪拌(～1000)，70℃加熱，大約6h(吸出溶液，溶液變色，沉淀較少)，大量乙醇重結(jié)晶，析出沉淀并洗滌，透析袋透析(分子量3500)，凍干。

58、本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供前述任一種多羥基富勒烯材料在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

59、本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供式(i)所述多羥基富勒烯材料在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

60、本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供前述任一種多羥基富勒烯材料在饑餓條件下治療腫瘤的應(yīng)用。

61、在一些實(shí)施方案中，所述饑餓條件包括：無葡萄糖的培養(yǎng)基孵育、無胎牛血清的培養(yǎng)基、無丙酮酸的培養(yǎng)基、無氨基酸的培養(yǎng)基、無葡萄糖無氨基酸的培養(yǎng)基、加入葡萄糖代謝相關(guān)酶抑制劑、加入mtor抑制劑等干擾細(xì)胞代謝的小分子、敲除腫瘤細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、敲除腫瘤細(xì)胞葡萄糖利用相關(guān)酶等中的一種或多種條件。

62、在一個(gè)實(shí)施例中，所述饑餓條件為無胎牛血清的培養(yǎng)基條件。

63、在一個(gè)實(shí)施例中，所述饑餓條件為采取ebss培養(yǎng)基提供無胎牛血清的饑餓條件。

64、在一個(gè)實(shí)施例中，所述治療腫瘤為誘導(dǎo)腫瘤泛凋亡，所述腫瘤泛凋亡包括誘導(dǎo)腫瘤凋亡、誘導(dǎo)腫瘤焦亡和/或誘導(dǎo)腫瘤壞死。

65、本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供前述任一種多羥基富勒烯材料誘導(dǎo)腫瘤泛凋亡的應(yīng)用。

66、本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供前述任一種多羥基富勒烯材料誘導(dǎo)腫瘤凋亡的應(yīng)用。

67、本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供前述任一種多羥基富勒烯材料誘導(dǎo)腫瘤焦亡的應(yīng)用。

68、本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供前述任一種多羥基富勒烯材料誘導(dǎo)誘導(dǎo)腫瘤壞死的應(yīng)用。

69、在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述腫瘤選自肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、腎癌、食管癌、卵巢癌、口腔癌、喉癌、膽管癌、子宮癌、鼻癌、睪丸癌、腦膜瘤、皮膚癌、宮頸癌、腦膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、白血病或肉瘤中的一種或多種。

70、在一個(gè)實(shí)施例中，所述腫瘤選自肺癌、胰腺癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤中的一種或多種。

71、在一個(gè)實(shí)施例中，所述腫瘤選自肺癌。

72、本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種胞內(nèi)細(xì)胞器級聯(lián)損傷調(diào)控腫瘤代謝并誘導(dǎo)泛凋亡的方法，其通過將上述多羥基富勒烯材料與實(shí)體瘤或腫瘤細(xì)胞共孵育，或給予有需要的受試者上述多羥基富勒烯材料實(shí)現(xiàn)，具體表現(xiàn)為：

73、(1)損傷溶酶體，破壞溶酶體膜通透性，改變?nèi)苊阁w內(nèi)的ph值，溶酶體內(nèi)降解蛋白的釋放，鈣離子等的釋放；

74、(2)損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白增多，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；

75、(3)損傷線粒體，破壞線粒體膜電位，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，破壞呼吸鏈電子傳遞；

76、(4)調(diào)控腫瘤細(xì)胞代謝，抑制癌細(xì)胞的糖酵解過程，導(dǎo)致能量atp和營養(yǎng)物質(zhì)消耗；

77、(5)引起腫瘤細(xì)胞的凋亡、焦亡和壞死。

78、在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多羥基富勒烯材料與實(shí)體瘤或腫瘤細(xì)胞共孵育在饑餓條件下進(jìn)行。

79、所述饑餓條件包括：無葡萄糖的培養(yǎng)基孵育、無胎牛血清的培養(yǎng)基、無丙酮酸的培養(yǎng)基、無氨基酸的培養(yǎng)基、無葡萄糖無氨基酸的培養(yǎng)基、加入葡萄糖代謝相關(guān)酶抑制劑、加入mtor抑制劑等干擾細(xì)胞代謝的小分子、敲除腫瘤細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、敲除腫瘤細(xì)胞葡萄糖利用相關(guān)酶等中的一種或多種條件。

80、在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多羥基富勒烯材料需要與mtor抑制劑和/或葡萄糖代謝相關(guān)酶抑制劑共同給予，以營造饑餓條件。

81、本發(fā)明提供了一種全新的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞泛凋亡的方式，即饑餓條件下多羥基富勒烯材料與溶酶體膜結(jié)合所造成的溶酶體膜通透化，破壞溶酶體，同時(shí)擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體損傷，同時(shí)多細(xì)胞器受累激活凋亡、焦亡、壞死三位一體的泛凋亡過程。通過迫使細(xì)胞器損傷的程度大于細(xì)胞器的可修復(fù)能力，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器間持續(xù)的交互損傷，實(shí)現(xiàn)損傷的正反饋疊加，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，效果好于陽性藥羥基氯喹(cq)，這種高效且低毒的方式，十分有利于開發(fā)新型腫瘤治療方法。