本發(fā)明涉及兒童青少年精神疾病診斷標志物以及診斷方法，具體涉及兒童青少年抑郁癥的血漿代謝診斷標志物以及診斷系統(tǒng)。

背景技術：

1、據世界衛(wèi)生組織報道(who)，全球約有3.2億人罹患抑郁癥，中國有約9500萬抑郁癥患者，抑郁癥已成為全球第二大疾病負擔。值得注意的是，兒童青少年已成為抑郁癥的高發(fā)人群，2021年中國首個兒童青少年精神障礙流行病學報告顯示，我國兒童青少年精神障礙患病率高達17.5％，其中兒童青少年抑郁癥患病率約為3％。據此估計，我國約有1500萬未成年人正在遭受抑郁癥的折磨。兒童青少年抑郁患者與成年抑郁相比，具有診斷困難、治療效果差(僅22％的穩(wěn)定緩解率)的疾病特點，由此導致62％的兒童青少年抑郁癥患者伴有強烈的自殺觀念和/或自殺行為。不僅嚴重影響未成年人的生長發(fā)育和身心健康，而且對患者家庭和全社會造成嚴重的負擔。此外與成年抑郁癥患者相比，兒童青少年抑郁癥在臨床表現(xiàn)、治療效果、疾病預后等多個方面均存在顯著不同。

2、為了應對以上困境，目前已經大量研究聚焦于兒童青少年抑郁癥的診斷、治療和生物學機制。在這些方面中，提高診斷效果是最迫切的臨床需求，也是更高效進行其他方面研究的基礎。為了提高兒童和青少年抑郁癥的診斷有效性，一些研究嘗試了多種方法來確定生物標志物，包括基因組學、蛋白質組學、代謝組學和微生物組。在多種組學技術中，代謝組學可用于確定生命活動的代謝譜，是鑒定特定疾病生物標志物和分子機制的最佳工具之一。

3、根據一項包含46篇文章的抑郁癥患者外周血代謝組的薈萃分析提示抑郁癥患者外周血中的代謝組存在紊亂，但是納入的大多數(shù)文章關注成年人，只有3篇關注兒童和青少年。其中有兩篇關于青少年抑郁癥的文章只包括14例抑郁癥/7例健康對照和11例抑郁癥/13例健康對照。另一篇包含84例抑郁癥/50例健康對照的非靶向代謝組學研究，是發(fā)明人團隊2018年發(fā)表的工作。但是我們的研究樣本量相對較小，只包括84例抑郁癥和50例健康對照在內的134名受試者，揭示的生物標志物的準確性有待進一步研究，這限制了研究結果的臨床推廣。

4、因此，亟需進一步提高兒童青少年抑郁癥血漿代謝生物標志物的可信度和推廣潛力，發(fā)現(xiàn)新的準確性更好的生物標志物或者生物標志物組合，更好地實現(xiàn)對于兒童青少年抑郁癥的有效診斷。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明意在提供血漿代謝診斷標志物在構建兒童青少年抑郁癥診斷系統(tǒng)中的應用，以解決現(xiàn)有技術中的兒童青少年抑郁癥血漿代謝生物標志物的可信度和推廣潛力不理想的技術問題。

2、為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

3、血漿代謝診斷標志物在構建兒童青少年抑郁癥診斷系統(tǒng)中的應用，所述血漿代謝診斷標志物包括環(huán)磷酸腺苷、甲基吡啶、不飽和十一烯酰肉堿、組氨醇、脯氨酰羥脯氨酸、色氨酸和葡萄糖醛酸中的至少一種；所述不飽和十一烯酰肉堿的結構式為：

4、

5、進一步，所述血漿代謝診斷標志物為環(huán)磷酸腺苷。

6、進一步，所述血漿代謝診斷標志物由環(huán)磷酸腺苷和葡萄糖醛酸組成。

7、進一步，所述血漿代謝診斷標志物由環(huán)磷酸腺苷、環(huán)磷酸腺苷、不飽和十一烯酰肉堿、組氨醇、脯氨酰羥脯氨酸、色氨酸和葡萄糖醛酸組成。

8、進一步，所述血漿代謝診斷標志物由環(huán)磷酸腺苷、葡萄糖醛酸和不飽和十一烯酰肉堿組成。

9、進一步，所述血漿代謝診斷標志物由環(huán)磷酸腺苷、環(huán)磷酸腺苷、不飽和十一烯酰肉堿、組氨醇、脯氨酰羥脯氨酸、色氨酸和葡萄糖醛酸組成。

10、本技術方案還提供了一種兒童青少年抑郁癥診斷系統(tǒng)，其特征在于，其包括數(shù)據采集單元和診斷單元；

11、所述數(shù)據采集單元包括含量檢測子單元，或者包括含量檢測子單元和性別信息采集子單元；含量檢測子單元用于檢測血漿代謝診斷標志物在血漿中的含量；所述血漿代謝診斷標志物包括環(huán)磷酸腺苷、甲基吡啶、不飽和十一烯酰肉堿、組氨醇、脯氨酰羥脯氨酸、色氨酸和葡萄糖醛酸中的至少一種；所述不飽和十一烯酰肉堿的結構式為：

12、

13、所述診斷單元用于通過邏輯回歸模型獲得診斷抑郁癥風險的檢驗變量值p：

14、邏輯回歸模型為：logit(p)＝a1×m1+a2×m2+a3×m3+a4×m4+a5×m5+a6×m6+a7×m7+a8×m8+b；

15、其中，m1-m7為自變量，依次用于輸入環(huán)磷酸腺苷、葡萄糖醛酸、不飽和十一烯酰肉堿、甲基吡啶、組氨醇、脯氨酰羥脯氨酸和色氨酸在血漿中的含量的數(shù)值；在m1-m7的自變量中，至少其中一個自變量輸入對應代謝物的含量的數(shù)值，剩余的自變量設定為0；

16、m8為自變量，考慮性別因素時，m8用于輸入性別信息，男性取值為1、女性取值為2；不考慮性別因素時，m8設定為0；

17、a1-a8依次為m1-m8的系數(shù)，b為常數(shù)；

18、0≤p≤1，將p值與臨界值相比較實現(xiàn)診斷。

19、進一步，邏輯回歸模型由如下方法構建：收集若干樣本中的血漿代謝診斷標志物在血漿中的含量信息，或者同時收集若干樣本中的血漿代謝診斷標志物在血漿中的含量信息和性別信息，進而獲得數(shù)據集；使用邏輯回歸算法對數(shù)據集進行模型訓練，獲得邏輯回歸模型；

20、所述臨界值由如下方法獲得：在所述數(shù)據集中，利用邏輯回歸模型擬合roc曲線，roc曲線的約登指數(shù)最大值對應的檢驗變量的值即為用于診斷的臨界值。

21、進一步，血漿代謝診斷標志物由環(huán)磷酸腺苷、葡萄糖醛酸、不飽和十一烯酰肉堿組成：

22、不考慮性別因素，診斷抑郁癥風險的檢驗變量值p由如下公式計算：

23、logit(p)＝-0.2102011×m1+0.0024516×m2-0.0087530×m3+2.5230796。

24、或者，考慮性別因素，診斷抑郁癥風險的檢驗變量值p由如下公式計算：

25、logit(p)＝-0.219851×m1+0.0024516×m2-0.011070×m3-0.671532m8+4.026209。

26、進一步，血漿代謝診斷標志物由環(huán)磷酸腺苷、葡萄糖醛酸、不飽和十一烯酰肉堿、甲基吡啶、組氨醇、脯氨酰羥脯氨酸和色氨酸組成：

27、不考慮性別因素，診斷抑郁癥風險的檢驗變量值p由如下公式計算：

28、logit(p)＝-0.2722×m1+0.002628×m2-0.01476×m3+0.002021×m4+0.0005301×m5+0.000555×m

29、6+0.000008763×m7-0.8001；

30、或者，考慮性別因素，診斷抑郁癥風險的檢驗變量值p由如下公式計算：

31、logit(p)＝-0.2756×m1+0.002628×m2-0.001359×m3+0.001737×m4+0.0006020×m5+0.0007109

32、×m6+0.000009975×m7+0.5543×m8-2.336。

33、進一步，所述含量檢測子單元包括高效液相色譜-質譜聯(lián)用設備。

34、進一步，高效液相色譜-質譜聯(lián)用設備中的高效液相色譜條件為：

35、色譜柱：uplc?beh?amide?column；流動相a：ch3coonh4和nh4oh的水溶液；流動相b：乙腈；流速：0.5ml/min；上樣量：4μl；采用梯度洗脫模式。

36、進一步，梯度洗脫的程序為：0-0.5min，95％流動相b；0.5-7min，95％-65％流動相b；7-8min，65％-40％流動相b；8-9min，40％流動相b；9-9.1min，40％-95％流動相b；9.1-12min，95％流動相b。

37、進一步，高效液相色譜-質譜聯(lián)用設備中的質譜條件為：esi正離子和負離子模式；esi源條件設置如下：鞘氣溫度350℃；鞘氣流速12l/min；毛細管電壓：+3000v、-2500v。

38、進一步，針對camp，母離子330.06da，子離子136.00da、119.00da；針對不飽和十一烯酰肉堿，母離子328.25da，子離子85.00da、57.10da；針對葡萄糖醛酸，母離子193.03da，子離子113.10da、131.10da；針對組氨醇，母離子124.09da，子離子81.10da、95.00da；針對色氨酸，母離子205.10da，子離子146.00da、188.00da；針對脯氨酰羥脯氨酸，母離子229.12da，子離子70.10da、131.90da；針對甲基吡啶，母離子94.07da，子離子50.10da、52.10da。

39、綜上所述，本技術方案的原理以及有益效果在于：

40、本技術方案通過結合非靶向和靶向代謝組學來探究兒童和青少年抑郁癥的血漿代謝物變化，確定了可以用于兒童青少年抑郁癥診斷的血漿生物標志物并在非靶和靶向隊列中都進行了驗證。其中非靶隊列包括非靶訓練集(untargeted?training?set)，非靶驗證集(untargeted?validation?set)和非靶測試集(untargeted?test?set)三個集，靶向隊列包括靶向訓練集(targeted?training?set)和靶向預測集(targeted?predication?set)兩個集。

41、在研究中，首先對非靶訓練集、非靶驗證集、非靶測試集共三批共1073例樣本的非靶代謝組學數(shù)據進行批次校正，然后在非靶訓練集和非靶驗證集中進行了聯(lián)合單因素代謝組學分析。確定了100個差異代謝物，隨后我們基于在非靶訓練集中劃分出的非靶發(fā)現(xiàn)集(非靶訓練集的70％)和非靶內部驗證集(非靶訓練集的30％)，通過遺傳算法和交叉驗證，同時考慮共線性和可替代性進行特征篩選，在共同差異代謝物中通過進一步特征篩選確定了環(huán)磷酸腺苷(camp),甲基吡啶(picoline),不飽和十一烯酰肉堿(car(11:1),undecenoylcarnitine),組氨醇(histidinol),脯氨酰羥脯氨酸(prolylhydroxyproline),色氨酸(tryptophan)和葡萄糖醛酸(glucuronic?acid)共7種兒童青少年抑郁癥的血漿代謝候選診斷標志物。然后通過靶向代謝組學在包含400例多中心樣本的新靶向隊列中檢測這7種代謝物，最后有環(huán)磷酸腺苷(camp),不飽和十一烯酰肉堿(car(11:1),undecenoylcarnitine)和葡萄糖醛酸(glucuronic?acid)共3種代謝物通過了靶向驗證，被作為最終的診斷標志物。

42、基于3個最終生物標志物構建診斷模型方程，并在靶向隊列和非靶隊列中評估了診斷效力，發(fā)現(xiàn)3個診斷標志物構建的聯(lián)合診斷模型具有良好的診斷效力。接著利用youdenindex計算的最佳cut-off值，該cut-off值具有良好的診斷性能。隨后，評估了3個最終診斷標志物和臨床指標的相關性，最終發(fā)現(xiàn)性別和不飽和十一烯酰肉堿(car(11:1))，存在穩(wěn)定的相關性。并在亞組分析中發(fā)現(xiàn)入組人群也可能影響抑郁患者的肉堿濃度。因此，我們對不同的性別亞組和入組人群亞組擬合特異的cut-off值，發(fā)現(xiàn)基于同一診斷模型的亞組特異性cut-off值相較全局cut-off值能更好的適應不同人群的診斷需求。需要說明的是，我們的亞組特異性cut-off值研究結果應該被正確理解為：我們的結果提示各自地區(qū)和實驗室應該在基于各自的檢測對象分別擬合各自的男女性正常參考水平(特異性cut-off值)，而不能理解為應該簡單照搬我們基于有限樣本亞組擬合的特異性cut-off值。如確實需要，可在項目開展初期短暫使用我們的cut-off值，待本地檢測數(shù)據庫建立后擬合本地區(qū)的正常參考值。

43、其中，car(11:1)是一種不飽和的?；鈮A，是不飽和脂肪酸β-氧化代謝的中間產物。本研究結果提示肉堿(car(11:1))受到性別的影響，兒童青少年正常女性血漿肉堿(car(11:1))濃度低于正常男性，并且抑郁患者相對于正常人也伴隨著肉堿(car(11:1))濃度的下調。這說明抑郁癥女性高發(fā)的機制可能涉及女性天然較低的血漿肉堿(car(11:1))濃度，這種性別差異導致了女性在抑郁中受到的肉堿保護較少。

44、血漿代謝診斷標志物葡萄糖醛酸(glucuronic?acid)是糖代謝旁路糖醛酸通路的物質，在體內廣泛表達。一方面，其產物udp-葡萄糖醛酸具有解毒作用，還可用于粘多糖合成。另一方面，糖醛酸通路與磷酸戊糖通路相連，是糖代謝網絡的旁路部分。目前關于葡萄糖醛酸在抑郁癥中的研究較少，我們觀測到葡萄糖醛酸在而兒童青少年血漿上調的可能原因是：抑郁癥存在能量的障礙，葡萄糖的有氧氧化出現(xiàn)障礙(通路分析中三羧酸循環(huán)代謝物出現(xiàn)下調)，隨之而來的是糖酵節(jié)和磷酸戊糖等旁路的補償性上調。并且抗抑郁治療也會繼發(fā)性抑制磷酸戊糖相關酶的活性。而與磷酸戊糖通路相關的葡萄糖醛酸也隨之上調。

45、camp以微量存在于細胞中，為細胞內的第二信使，被第一信使激素或其它分子信號刺激激活腺苷酸環(huán)化酶(ac)催化atp環(huán)化形成的。camp最終又被磷酸二酯酶(pde)水解成5'-amp而失活。ac和pde可以從兩個不同方面調節(jié)細胞內camp濃度，從而影響細胞、組織、器官的功能。當ac的活性升高時，camp濃度升高，當pde濃度增高時，camp濃度降低。camp參與神經細胞突觸傳遞，在突觸后膜的受體被遞質激活后，會活化ac，形成camp進而激活pka，使膜蛋白磷酸化調控離子通道和基因表達。

46、另外差異代謝物和通路分析中我們發(fā)現(xiàn)的血漿診斷標志物中氨基酸代謝存在明顯異常。盡管這些差異在多中心研究中不穩(wěn)定，所以氨基酸在作為診斷標志物方面不如肉堿(car(11:1))、葡萄糖醛酸和camp穩(wěn)定，這可能的原因是多中心帶來了更多的異質性。既往文獻中，氨基酸代謝通路在兒童青少年和成人抑郁癥中改變是被廣泛報道的，但既往文獻報道間的一致性較差。

47、綜上所述，本技術方案的優(yōu)勢在于：針對兒童青少年抑郁癥標志物，現(xiàn)有技術一般采用非靶向代謝組學檢測，所以得到的診斷標志物沒有進行批間驗證，更沒有進行絕對定量的靶向驗證。非靶代謝組學存在較強的批間差異，但是本技術方案通過檢測方法的統(tǒng)一和批間算法校正，創(chuàng)造性的解決了這一問題，使三批非靶代謝之間具有可比性。在三批非靶代謝的批間校正基礎上，本技術方案通過遺傳算法進行特征篩選，還結合了共線性和模型性能選擇代謝物。最后還進行了靶向代謝組學的驗證，靶向驗證可以明確代謝物的客觀絕對濃度，使得診斷公式更為可靠，并且能夠直接進行臨床推廣。本技術方案采用的肉堿(car(11:1))、葡萄糖醛酸和camp診斷標志物組合，是進行診斷的最佳標志物，由其構成的診斷模型可以較為準確地實現(xiàn)抑郁癥的診斷。