本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種增強(qiáng)重組蛋白抗原免疫原性的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、截止2023年初，全球共有966種疫苗處于臨床階段，技術(shù)手段主要為重組蛋白疫苗、核酸疫苗、結(jié)合疫苗、病毒載體疫苗、滅活疫苗和減毒疫苗，其中重組蛋白疫苗占比最高(22％)。重組蛋白疫苗因其安全高效、技術(shù)平臺(tái)成熟和易規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)在眾多疫苗技術(shù)中展現(xiàn)出了極好的應(yīng)用前景。

2、重組蛋白疫苗又稱基因工程重組亞單位疫苗，是利用基因工程技術(shù)將病原微生物中具有免疫活性的重要組成部分制作而成的疫苗。具備免疫活性的部分通常為病原微生物表面抗原、具備宿主細(xì)胞殺傷作用的毒素抗原和與受體細(xì)胞結(jié)合的抗原等，這些蛋白抗原通常分子量通常為10～100kda。對(duì)于分子量較小或抗原表位較少的蛋白抗原，往往會(huì)有免疫原性弱，無(wú)法誘導(dǎo)出高水平的免疫應(yīng)答的現(xiàn)象，從而無(wú)法提供有效的免疫保護(hù)。

3、多糖結(jié)合疫苗是利用具有t細(xì)胞表位的蛋白抗原與多糖抗原進(jìn)行偶聯(lián)，克服了單獨(dú)的多糖抗原無(wú)法誘導(dǎo)t細(xì)胞免疫應(yīng)答的缺陷，激發(fā)了t細(xì)胞和b細(xì)胞的免疫應(yīng)答，將抗體親和力低的igm轉(zhuǎn)變?yōu)橛H和力高的igg，并產(chǎn)生記憶b細(xì)胞和漿細(xì)胞。受此原理啟發(fā)，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)利用9v型別肺炎球菌莢膜多糖偶聯(lián)新冠病毒(sars-cov-2)的截短型s蛋白(rbd蛋白)，可明顯增強(qiáng)其免疫原性(cn113150084a)；cn116113644a也發(fā)現(xiàn)14型、7f型肺炎球菌莢膜多糖和葡聚糖對(duì)rbd蛋白的免疫原性具有免疫增強(qiáng)效果。

4、發(fā)明人推測(cè)多糖抗原增強(qiáng)重組蛋白免疫原性的主要原理是增大了蛋白抗原的分子尺寸和提高了抗原遞呈效率，從而提高了免疫系統(tǒng)的應(yīng)答水平。但以肺炎球菌莢膜多糖、腦膜炎球菌莢膜多糖、流感嗜血桿菌莢膜多糖等外源性多糖抗原作為重組蛋白疫苗的免疫增強(qiáng)基質(zhì)時(shí)，存在以下幾點(diǎn)不足：(1)會(huì)與蛋白抗原發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫調(diào)節(jié)。莢膜多糖作為一種外源性物質(zhì)，本身具備一定免疫原性，與蛋白偶聯(lián)后同時(shí)免疫至機(jī)體會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫調(diào)節(jié)現(xiàn)象，尤其在多組分疫苗中表現(xiàn)明顯，無(wú)法發(fā)揮出理想的免疫增強(qiáng)效果。(2)無(wú)法與含該多糖抗原的已上市疫苗共享接種人群。若與已上市的多糖疫苗或多糖結(jié)合疫苗接種至同一年齡段人群，則會(huì)出現(xiàn)多糖抗原反復(fù)接種、免疫劑量過(guò)高、干擾免疫程序等現(xiàn)象，對(duì)已上市的多糖疫苗或多糖結(jié)合疫苗的免疫效果產(chǎn)生極大的影響，同時(shí)也會(huì)對(duì)接種人群帶來(lái)極大的安全隱患。

5、因此，基于上述技術(shù)的不足，開發(fā)一種既可以顯著增強(qiáng)重組蛋白抗原免疫原性，又不對(duì)已上市疫苗的安全性和有效性產(chǎn)生影響的免疫增強(qiáng)方法是目前亟需解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開了一種增強(qiáng)重組蛋白抗原免疫原性的方法及應(yīng)用。

2、具體而言，本發(fā)明的第一方面提供了一種增強(qiáng)重組蛋白抗原免疫原性的方法，所述方法包括通過(guò)將多糖與重組蛋白抗原進(jìn)行偶聯(lián)，形成納米化蛋白抗原。

3、在一些實(shí)施方案中，所述多糖選自透明質(zhì)酸鈉(sodium?hyaluronate,ha)、殼聚糖(chitosan)、葡聚糖(dextran)、巖藻多糖(fucose)和海藻酸鈉(sodium?alginate)。

4、在一些具體的實(shí)施方案中，所述多糖為透明質(zhì)酸鈉。

5、在一些實(shí)施方案中，所述重組蛋白抗原為細(xì)菌蛋白抗原，所述細(xì)菌屬于葡萄球菌屬(staphylococcus)、奈瑟氏球菌屬(neisseria)、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、埃希氏菌屬(escherichia)、芽孢梭菌屬(clostridium)、類梭菌屬(clostridioides)、沙門氏菌屬(salmonella)、志賀氏菌屬(shigella)、假單胞菌屬(pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(acinetobacter)、鮑特氏菌屬(bordetella)、腸球菌屬(enterococccus)、嗜血桿菌屬(haemophilus)、分枝桿菌屬(mycobacterium)、棒狀桿菌屬(corynebacterium)或鏈球菌屬(streptococcus)。

6、在一些具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌選自以下一種或多種：金黃色葡萄球菌(s.aureus)、表皮葡萄球菌(s.epidermidis)、腐生葡萄球菌(s.saprophyticus)、腦膜炎奈瑟氏菌(n.meningitidis)、淋病奈瑟氏菌(n.gonorrhoeae)、肺炎克雷伯氏菌(k.pneumoniae)、大腸埃希氏菌(e.coli)、破傷風(fēng)梭菌(c.tetani)、肉毒梭菌(c.botulinum)、艱難梭菌(c.difficile)和產(chǎn)氣莢膜梭菌(c.perfringens)、傷寒沙門氏菌(s.typhi)、副傷寒沙門氏菌(s.paratyphi)、福氏志賀氏菌(s.flexneri)、宋內(nèi)飾志賀氏菌(s.sonnei)、銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)、鮑曼不動(dòng)桿菌(a.baumanii)、百日咳鮑特菌(b.pertussis)、屎腸球菌(e.faecium)、糞腸球菌(e.faecalis)、流感嗜血桿菌(h.influenzae)、結(jié)核分枝桿菌(m.tuberculosis)、牛分枝桿菌(m.bovis)、白喉棒狀桿菌(c.diphtheriae)、a群鏈球菌(group?a?streptococcus)、b群鏈球菌(group?bstreptococcus)和肺炎鏈球菌(s.pneumoniae)。

7、在一些具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌選自以下一種或多種：金黃色葡萄球菌(s.aureus)、b群腦膜炎奈瑟氏菌(group?b?meningococcal)、白喉棒狀桿菌(c.diphtheriae)、肺炎鏈球菌(s.pneumoniae)和流感嗜血桿菌(h.influenzae)。

8、在一些具體的實(shí)施方案中，所述金黃色葡萄球菌(s.aureus)抗原包括重組金黃色葡萄球菌腸毒素a(recombinant?enterotoxin?a,rsea)、腸毒素b(recombinantenterotoxin?b,rseb)、腸毒素c2(recombinant?enterotoxin?c2,rsec2)、毒性休克毒素綜合征毒素1(recombinant?toxic?shock?syndrom?toxin-1,rtsst1)、α溶血素(recombinantα-hemolysin,rhlα)和殺白細(xì)胞毒素s(recombinant?panton-valentine?leucocidin?ssubunit,rluks)中的一種或多種。

9、在一些具體的實(shí)施方案中，所述b群腦膜炎奈瑟氏菌(group?b?meningococcal)抗原包括重組v1型h因子結(jié)合蛋白(recombinant?factor?h?binding?protein?variant1,rfhbpv1)。

10、在一些具體的實(shí)施方案中，所述白喉棒狀桿菌(c.diphtheriae)抗原包括重組白喉毒素b片段(recombinant?diphtheria?toxin?fragment?b,rdtb)。

11、在一些具體的實(shí)施方案中，所述肺炎球菌(s.pneumoniae)抗原包括重組肺炎球菌溶血素(recombinant?pneumolysin,rply)和/或肺炎球菌表面蛋白a(recombinantpneumococcal?surface?protein?a,rpspa)。

12、在一些具體的實(shí)施方案中，所述流感嗜血桿菌(h.influenzae)抗原包括外膜蛋白d(recombinant?haemophilus?influenza?protein?d,rpd)；

13、在一些實(shí)施方案中，所述金黃色葡萄球菌(s.aureus)抗原包括金黃色葡萄球菌腸毒素a(rsea)、腸毒素b(rseb)、腸毒素c2(rsec2)和毒性休克毒素綜合征毒素1(rtsst1)中的一種或多種。

14、在一些具體的實(shí)施方案中，所述金黃色葡萄球菌(s.aureus)抗原為金黃色葡萄球菌腸毒素a(rsea)、腸毒素b(rseb)、腸毒素c2(rsec2)和毒性休克毒素綜合征毒素1(rtsst1)。

15、在一些實(shí)施方案中，所述偶聯(lián)的方法包括以下一種或多種：

16、(1)多糖與重組蛋白直接連接；

17、(2)將1-氰基-4-(二甲氨基)吡啶四氟硼酸鹽(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium?tetrafluoroborate,cdap)活化的多糖用己二酸二酰肼(adipic?dihydrazide,adh)修飾，再使用1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亞胺(edac)與重組蛋白進(jìn)行橋連結(jié)合；

18、(3)將cdap活化的多糖用adh修飾，重組蛋白用琥珀酸酐(succinic?anhydride)修飾，再使用edac進(jìn)行橋連結(jié)合；

19、(4)將cdap活化的多糖與adh修飾的重組蛋白橋連結(jié)合。

20、在一些具體的實(shí)施方案中，所述偶聯(lián)的方法為多糖與重組蛋白直接連接。

21、在一些具體的實(shí)施方案中，所述方法包括以下：

22、(1)多糖與蛋白抗原的質(zhì)量比為1：(1～5)；

23、(2)所述多糖與蛋白抗原偶聯(lián)的反應(yīng)ph為6.5～8.5；

24、(3)所述反應(yīng)的時(shí)長(zhǎng)為1～8h。

25、在一些實(shí)施方案中，(1)中所述多糖為cdap活化的多糖。

26、在一些具體地實(shí)施方案中，(1)中所述多糖與cdap的活化比例為1：(0.05～0.5)。

27、在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括純化得到的納米化蛋白抗原的步驟；

28、在一些具體的實(shí)施方案中，所述純化得到的納米化蛋白抗原的步驟包括用300kda超濾膜包進(jìn)行超濾置換所述納米化蛋白抗原，所述置換緩沖液為0.85％?nacl溶液，收集超濾置換截留液，經(jīng)0.2μm濾器過(guò)濾獲得純化的納米化蛋白抗原。

29、在一些具體的實(shí)施方案中，所述方法包括：注射級(jí)透明質(zhì)酸鈉經(jīng)水解后獲得的水解透明質(zhì)酸鈉，分子量為200kda～400kda。所述水解透明質(zhì)酸鈉的活化反應(yīng)濃度為5mg/ml，活化時(shí)長(zhǎng)為2min，活化ph為8.3。水解透明質(zhì)酸鈉與cdap的投料質(zhì)量比為1:0.1、1:0.2或1:0.3。所述活化后水解透明質(zhì)酸鈉與重組蛋白投料質(zhì)量比為1:1、1:2或1:3，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為2～8h后獲得偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物。所述偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物用300kda超濾膜包進(jìn)行超濾置換，所述置換緩沖液為0.85％?nacl溶液，收集超濾置換截留液。所述截留液經(jīng)0.2μm濾器過(guò)濾獲得納米化抗原。

30、在一些具體的實(shí)施方案中，所述多糖為透明質(zhì)酸鈉。

31、在一些具體的實(shí)施方案中，所述的透明質(zhì)酸鈉分子量為1000kda～4000kda。

32、在一些具體的實(shí)施方案中，所述透明質(zhì)酸鈉分子量為1800kda～2000kda。

33、在一些具體的實(shí)施方案中，所述多糖為水解透明質(zhì)酸鈉。

34、在一些具體的實(shí)施方案中，所述水解透明質(zhì)酸鈉的分子量為200kda-400kda。

35、在一些具體的實(shí)施方案中，所述水解透明質(zhì)酸鈉分子量為300kda。

36、本發(fā)明的第二方面提供了如本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)所述的方法制備獲得的納米化蛋白抗原。

37、本發(fā)明的第三方面提供了如本發(fā)明第二方面所述的納米化蛋白抗原在制備細(xì)菌性疫苗中的應(yīng)用。

38、在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)菌屬于葡萄球菌屬(staphylococcus)、奈瑟氏球菌屬(neisseria)、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、埃希氏菌屬(escherichia)、芽孢梭菌屬(clostridium)、類梭菌屬(clostridioides)、沙門氏菌屬(salmonella)、志賀氏菌屬(shigella)、假單胞菌屬(pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(acinetobacter)、鮑特氏菌屬(bordetella)、腸球菌屬(enterococccus)、嗜血桿菌屬(haemophilus)、分枝桿菌屬(mycobacterium)、棒狀桿菌屬(corynebacterium)或鏈球菌屬(streptococcus)。

39、本發(fā)明的第四方面提供了如本發(fā)明第二方面所述的納米化蛋白抗原在治療或預(yù)防細(xì)菌感染中的應(yīng)用。

40、在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)菌屬于葡萄球菌屬(staphylococcus)、奈瑟氏球菌屬(neisseria)、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、埃希氏菌屬(escherichia)、芽孢梭菌屬(clostridium)、類梭菌屬(clostridioides)、沙門氏菌屬(salmonella)、志賀氏菌屬(shigella)、假單胞菌屬(pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(acinetobacter)、鮑特氏菌屬(bordetella)、腸球菌屬(enterococccus)、嗜血桿菌屬(haemophilus)、分枝桿菌屬(mycobacterium)、棒狀桿菌屬(corynebacterium)或鏈球菌屬(streptococcus)。

41、本發(fā)明的第五方面提供了治療或預(yù)防細(xì)菌感染的方法，所述方法包括對(duì)有需要的受試者施用治療有效量的如本發(fā)明第二方面所述的納米化蛋白抗原。

42、對(duì)于本發(fā)明的所述藥物組合物的泊療有效劑量可以最初在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)成功物模型例如嚙齒類動(dòng)物、兔、犬、豬和/或靈長(zhǎng)類動(dòng)物中進(jìn)行估計(jì)。動(dòng)物模型也可以用于測(cè)定合適的施用濃度范圍和途徑。隨后可以用于確定在人中施用的有用劑量和途徑。一般地，施用有效量或劑量的確定和調(diào)整以及何時(shí)和如何進(jìn)行此類調(diào)整的評(píng)估為木領(lǐng)域技術(shù)人員己知。

43、在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)菌屬于葡萄球菌屬(staphylococcus)、奈瑟氏球菌屬(neisseria)、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、埃希氏菌屬(escherichia)、芽孢梭菌屬(clostridium)、類梭菌屬(clostridioides)、沙門氏菌屬(salmonella)、志賀氏菌屬(shigella)、假單胞菌屬(pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(acinetobacter)、鮑特氏菌屬(bordetella)、腸球菌屬(enterococccus)、嗜血桿菌屬(haemophilus)、分枝桿菌屬(mycobacterium)、棒狀桿菌屬(corynebacterium)或鏈球菌屬(streptococcus)。

44、在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

45、本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

46、本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：

47、本發(fā)明通過(guò)對(duì)細(xì)菌性病原來(lái)源的重組蛋白抗原與多糖進(jìn)行偶聯(lián)獲得納米化抗原。經(jīng)多糖偶聯(lián)的重組蛋白抗原免疫原性發(fā)生了大大提高，克服了莢膜多糖與重組蛋白抗原在機(jī)體內(nèi)因競(jìng)爭(zhēng)性免疫調(diào)節(jié)導(dǎo)致的免疫原性增強(qiáng)效果差的不足，同時(shí)還解決了以莢膜多糖抗原為納米化基質(zhì)形成的產(chǎn)品上市后因莢膜多糖抗原重復(fù)接種、過(guò)量接種、干擾免疫程序而導(dǎo)致的安全性和有效性問(wèn)題。此外，本發(fā)明還具有原料獲取簡(jiǎn)單且成本低、工藝穩(wěn)定性好且易放大、安全性高等優(yōu)點(diǎn)。