本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域，尤其涉及一種載細(xì)菌全抗原的plga微球疫苗及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、據(jù)估計，到2050年耐藥細(xì)菌可能導(dǎo)致約每年1000萬人死亡，使得抗生素耐藥(antimicrobial?resistance，amr)成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域最嚴(yán)重的威脅之一。其中超級細(xì)菌感染是引發(fā)抗生素耐藥重要原因。臨床實(shí)踐顯示，限制抗生素的應(yīng)用可以恢復(fù)細(xì)菌的敏感性(front?antibiot.2023；2)。

2、當(dāng)前已經(jīng)開發(fā)并應(yīng)用的對抗超級細(xì)菌的干預(yù)策略，包括新型抗生素、疫苗、診斷工具、單克隆抗體以及微生物群干預(yù)等。其中細(xì)菌疫苗不受細(xì)菌耐藥性的影響，可通過主動激活免疫防御系統(tǒng)，為機(jī)體提供長期保護(hù)，是對抗超級細(xì)菌感染的最具潛力的方法。此外，疫苗還能夠輔助抗生素治療，是減少抗生素使用、緩解amr的有利武器。但目前全球的超級耐藥細(xì)菌疫苗大多處于臨床前階段，尚未有產(chǎn)品上市。且當(dāng)前處于臨床階段的疫苗多為單一的抗原組分，不足以阻斷超級細(xì)菌多途徑的致病通路。而滅活的細(xì)菌全疫苗雖含有細(xì)菌的全抗原組分，但其注射后迅速擴(kuò)散的細(xì)菌毒素抗原，對機(jī)體存在較大的安全性隱患。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種載細(xì)菌全抗原的plga(poly(lactic-co-glycolic?acid)聚乳酸-羥基乙酸共聚物)微球疫苗及其制備方法與應(yīng)用，該疫苗生物安全性較高、免疫誘導(dǎo)較全面。

2、為了解決技術(shù)問題，本發(fā)明一方面提供了一種載細(xì)菌全抗原的plga微球疫苗的制備方法，其包括如下步驟：

3、1)采用細(xì)菌細(xì)胞蛋白裂解液對目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行裂解獲得全細(xì)菌抗原，以探頭超聲、高壓共擠出的方式制備得到具有納米粒形式的全細(xì)菌抗原粒子；

4、2)將plga溶解于有機(jī)溶劑作為油相，將細(xì)菌全抗原粒子混懸于水中作為內(nèi)水相，兩者混合得到初乳；以pva溶液為外水相，將初乳置于外水相中，高速剪切后得到復(fù)乳；以pva水溶液為固化液，復(fù)乳加入固化液中固化，隨后經(jīng)揮發(fā)有機(jī)溶劑、洗滌、離心富集，獲得粒徑均勻的plga微球，即為所述載細(xì)菌全抗原的plga微球疫苗。

5、作為本發(fā)明的可選方案，所述目標(biāo)細(xì)菌包括但不限于金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸桿菌或銅綠假單胞菌。

6、進(jìn)一步的，所述的步驟1)具體為：將目標(biāo)細(xì)菌培養(yǎng)至生長對數(shù)期，離心收集活細(xì)菌沉淀；細(xì)菌經(jīng)液氮/室溫反復(fù)凍融后，加入細(xì)菌細(xì)胞蛋白裂解液，在冰上裂解細(xì)菌細(xì)胞獲得細(xì)菌裂解液；用純水稀釋細(xì)菌裂解液后，對其進(jìn)行探頭超聲破碎處理，隨后以高壓共擠出的方式將親、疏水的抗原組分進(jìn)行重排，得到納米尺寸的全細(xì)菌抗原粒子。

7、進(jìn)一步的，步驟1)中，所述全細(xì)菌抗原粒子的粒徑為20-200nm。

8、進(jìn)一步的，步驟2)所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷；所述初乳為油包水型乳液；復(fù)乳為w/o/w水包油包水乳液。

9、進(jìn)一步的，外水相中pva的質(zhì)量百分比濃度為2％，固化液中pva的質(zhì)量百分比濃度為0.2％。

10、進(jìn)一步的，所述plga微球疫苗的粒徑為1-10μm，plga微球疫苗上細(xì)菌抗原載量為4wt％-10wt％。

11、第二方面，本發(fā)明提供了所述方法制備得到的載細(xì)菌全抗原的plga微球疫苗。進(jìn)一步的，所述微球疫苗中的微球?qū){米級抗原粒子進(jìn)行表面吸附和內(nèi)部裝載，制劑表面吸附的抗原粒子能夠?qū)崿F(xiàn)突釋，內(nèi)部裝載的抗原粒子能夠?qū)崿F(xiàn)長效釋放。

12、第三方面，本發(fā)明提供了所述的載細(xì)菌全抗原的plga微球疫苗在制備疫苗產(chǎn)品中的應(yīng)用。

13、本發(fā)明所提供的plga微球疫苗及其疫苗產(chǎn)品裝載抗原穩(wěn)定性強(qiáng)，生物安全性高，能誘導(dǎo)全面的免疫響應(yīng)。

14、所述的誘導(dǎo)全面的免疫響應(yīng)，包括體液免疫和細(xì)胞免疫。免疫指標(biāo)包括血清抗體滴度，免疫因子的種類和豐度，dc活化和b細(xì)胞生發(fā)中心的產(chǎn)生，cd4+和cd8+t細(xì)胞的分化，記憶t細(xì)胞的產(chǎn)生等。

15、本發(fā)明所提供的plga微球疫苗及其疫苗產(chǎn)品可以用于對細(xì)菌感染的預(yù)防和提高機(jī)體對生素治療的敏感性。

16、所述的細(xì)菌感染可以是超級耐藥細(xì)菌如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，感染模型可以是血流感染、肺部感染和皮膚感染等。感染后制備細(xì)菌疫苗，對小鼠進(jìn)行單劑量皮下注射免疫，構(gòu)建同源細(xì)菌感染的小鼠模型。

17、本發(fā)明的創(chuàng)新性在于制備了一種負(fù)載全細(xì)菌抗原表位的plga微球疫苗。與普通滅活疫苗相比，該微球疫苗的抗原以納米顆粒的形式存在，它不僅能促進(jìn)人體內(nèi)專職抗原遞呈能力最強(qiáng)的樹突狀細(xì)胞(dendritic?cells，dc)單個細(xì)胞內(nèi)的抗原豐度，增進(jìn)不同亞群dc之間的抗原轉(zhuǎn)移，而且能夠發(fā)揮天然佐劑的作用，誘導(dǎo)多種細(xì)胞的免疫響應(yīng)。另外，該疫苗通過plga裝載形成plga微球抗原儲庫。一方面該儲庫能夠吸附毒素從而極大地提高細(xì)菌疫苗的安全性，另一方面本發(fā)明采用制劑學(xué)手段對細(xì)菌抗原進(jìn)行裝載和遞送，可有效控制抗原的釋放行為：微球表面的抗原微?？蓪?shí)現(xiàn)突釋，內(nèi)部裝載的抗原可實(shí)現(xiàn)長效釋放。因此該疫苗可通過一次性注射后的程序式分步釋放，達(dá)到初免和加強(qiáng)免疫的雙重效果，從而提高病人的免疫應(yīng)答，對體內(nèi)的耐藥菌進(jìn)行有效抵御。本發(fā)明設(shè)計合理，抗原制備簡單，微球制劑的引入為細(xì)菌滅活疫苗提供了安全可靠的載體平臺。

技術(shù)特征：

1.一種載細(xì)菌全抗原的plga微球疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述目標(biāo)細(xì)菌包括但不限于金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸桿菌或銅綠假單胞菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟1)具體為：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟1)中，所述全細(xì)菌抗原粒子的粒徑為20-200nm。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷；所述初乳為油包水型乳液；復(fù)乳為w/o/w水包油包水乳液。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，外水相中pva的質(zhì)量百分比濃度為2％，固化液中pva的質(zhì)量百分比濃度為0.2％。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述plga微球疫苗的粒徑為1-10μm，plga微球疫苗上細(xì)菌抗原載量為4wt％-10wt％。

8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述方法制備得到的載細(xì)菌全抗原的plga微球疫苗。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的載細(xì)菌全抗原的plga微球疫苗，其特征在于，所述微球疫苗中的微球?qū){米級抗原粒子進(jìn)行表面吸附和內(nèi)部裝載，制劑表面吸附的抗原粒子能夠?qū)崿F(xiàn)突釋，內(nèi)部裝載的抗原粒子能夠?qū)崿F(xiàn)長效釋放。

10.權(quán)利要求8所述的載細(xì)菌全抗原的plga微球疫苗在制備疫苗產(chǎn)品中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種載細(xì)菌全抗原的PLGA微球疫苗及其制備方法與應(yīng)用。采用細(xì)菌細(xì)胞蛋白裂解液對目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行裂解獲得全細(xì)菌抗原，以高壓共擠出的方式制備得到具有納米粒形式的全細(xì)菌抗原粒子；將上述抗原粒子與PLGA微球載體通過復(fù)乳法進(jìn)行混合，可得到載體內(nèi)外均裝載抗原的微球疫苗(MSV)。本發(fā)明MSV表面的抗原以突釋的方式釋放，而內(nèi)部裝載的抗原可達(dá)到長效緩釋的效果，因此實(shí)現(xiàn)了對抗原釋放行為的程序式分步釋放控制，即單劑注射疫苗可達(dá)到初免和加強(qiáng)免疫的雙重效果。除此之外，MSV還能有效避免細(xì)菌毒素對機(jī)體免疫細(xì)胞的損傷，提高細(xì)菌疫苗的生物安全性。本發(fā)明設(shè)計合理，微球制劑的引入為細(xì)菌滅活疫苗提供了安全可靠的載體平臺。

技術(shù)研發(fā)人員：游劍,羅利華,張玉瑋,王麗彤,張一濤
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江大學(xué)金華研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30