本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及轉(zhuǎn)錄因子elf1在作為椎間盤退變?cè)\斷標(biāo)志物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、腰痛是全球范圍內(nèi)致殘的主要原因，每年用于治療腰痛的醫(yī)保支出高達(dá)上千億美元，造成沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。學(xué)界普遍認(rèn)為，椎間盤退變(intervertebral?discdegeneration,ivdd)相關(guān)性疾病是導(dǎo)致腰痛的主要原因，其發(fā)生率僅次于上呼吸道感染，已成為門診就診的第二大病因。目前，針對(duì)ivdd的保守治療主要側(cè)重于緩解癥狀，而非將已退變椎間盤恢復(fù)至健康狀態(tài)。傳統(tǒng)的外科手術(shù)治療雖能夠在一定程度上實(shí)現(xiàn)神經(jīng)減壓，但不可避免地破壞了脊柱原有的完整性和穩(wěn)定性，常常導(dǎo)致并發(fā)癥的發(fā)生，進(jìn)而降低患者的生活質(zhì)量。因此，當(dāng)前ivdd的診療思路應(yīng)轉(zhuǎn)向基于分子生物學(xué)機(jī)理的精準(zhǔn)治療，以期從根源上延緩ivdd的進(jìn)程。如何深入闡明ivdd的機(jī)制并開發(fā)新治療策略，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)和亟待解決的關(guān)鍵問題。

2、研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，ivdd的患病率急劇增加，50多歲與70多歲人群椎間盤疾病的患病率相差50％。組織學(xué)研究表明，椎間盤細(xì)胞早在生命的第二個(gè)十年就開始衰老。來自臨床和動(dòng)物模型研究的新證據(jù)表明，衰老的椎間盤細(xì)胞，特別是衰老的髓核(nucleuspulposus，np)細(xì)胞，在衰老和退化的ivd中積聚，這被認(rèn)為是ivdd的新標(biāo)志和主要原因。近年來，衰老np細(xì)胞在ivdd中的作用愈發(fā)清晰，其相關(guān)文獻(xiàn)也日益增多。衰老作為ivdd的主要原因，其致病機(jī)制值得探索和研究。ivdd受機(jī)械負(fù)荷、炎癥刺激、免疫損傷、老齡等多種因素的影響，上述因素均可引起髓核細(xì)胞衰老。因此，干預(yù)np細(xì)胞衰老是治療ivdd理想的策略。

3、elf1(e74-like?factor?1)是屬于ets(erythroblast?transformation-specific)家族的一種轉(zhuǎn)錄因子。近年來研究表明，elf1通過調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫應(yīng)答等生物學(xué)進(jìn)程參與多種疾病發(fā)展。已發(fā)現(xiàn)elf1在神經(jīng)、腦、腎臟、心血管、胃腸道等多種器官和組織中發(fā)揮功能；elf1在鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中發(fā)揮抗增殖作用；在乳腺癌中，elf1可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；elf1的異常表達(dá)也與結(jié)直腸癌、前列腺癌、肺癌等其他多種腫瘤的發(fā)生和預(yù)后相關(guān)。但是elf1在椎間盤退變領(lǐng)域的作用以及是否參與髓核細(xì)胞衰老進(jìn)程目前尚未報(bào)道。

4、目前，治療椎間盤的方法主要有保守治療和手術(shù)治療。保守治療包括臥硬板床休息、推拿按摩、牽引、針灸等，屬于對(duì)癥治療；手術(shù)治療包括髓核摘除術(shù)、脊柱融合術(shù)等，也為對(duì)癥治療，而且是以犧牲部分或整個(gè)椎間盤的結(jié)構(gòu)與功能為代價(jià)；而異體椎間盤移植術(shù)、人工椎間盤置換術(shù)及椎體融合術(shù)等都存在著明確弊端和缺陷，且有報(bào)道此類手術(shù)存在一定的風(fēng)險(xiǎn)以及圍手術(shù)期并發(fā)癥，而二次手術(shù)的失敗率更是達(dá)到50％。疾病的早期診斷能夠使更多患者在早期對(duì)疾病進(jìn)行關(guān)注，因此尋找椎間盤退行性病變?cè)缙谠\斷及預(yù)后相關(guān)的特異性分子標(biāo)志物對(duì)實(shí)現(xiàn)椎間盤退行性病變的早期診斷及個(gè)體化治療具有深遠(yuǎn)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的在于根據(jù)對(duì)elf1在椎間盤退變中的功能和機(jī)制研究，提供基于elf1在椎間盤退變的診斷與治療方面的用途。具體提供了elf1作為椎間盤退變標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)在椎間盤退變治療藥物中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：

3、本發(fā)明提供了elf1基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑在制備治療椎間盤退行性病變的藥物中的應(yīng)用。

4、本發(fā)明利用elf1的沉默小干擾rna在髓核細(xì)胞中進(jìn)行敲減以及構(gòu)建elf1基因敲除鼠。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)了elf1沉默會(huì)抑制髓核細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)破壞并且抑制細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)從而緩解衰老表型。敲減elf1能在一定程度上挽救由il-1β誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞外基質(zhì)破壞，以及能夠通過抑制衰老相關(guān)蛋白p16和p21抑制髓核細(xì)胞衰老表型延緩椎間盤退變。因此，elf1能夠作為椎間盤退變的分子治療靶點(diǎn)。

5、進(jìn)一步地，所述抑制劑包括抑制elf1基因表達(dá)的試劑、和/或抑制elf1基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑。

6、本發(fā)明通過構(gòu)建針刺elf1-/-基因敲除小鼠驗(yàn)證了敲低elf1能夠在動(dòng)物體內(nèi)抑制椎間盤退變并起到治療作用。

7、本發(fā)明通過構(gòu)建elf1過表達(dá)腺相關(guān)病毒后進(jìn)行小鼠椎間盤體內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)elf1表達(dá)水平升高會(huì)加速髓核細(xì)胞衰老并導(dǎo)致椎間盤退變。

8、本發(fā)明還提供了一種篩選治療椎間盤退行性病變的候選藥物的方法，以elf1基因作為藥物靶點(diǎn)，尋找能夠降低elf1基因表達(dá)、和/或抑制elf1基因表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)的物質(zhì)作為候選藥物。

9、本發(fā)明還提供了檢測elf1基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷椎間盤退行性病變的工具中的應(yīng)用。

10、進(jìn)一步地，所述產(chǎn)品包括：通過rt-pcr、實(shí)時(shí)定量pcr、免疫檢測、原位雜交、芯片或高通量測序平臺(tái)檢測elf1基因表達(dá)以診斷椎間盤退行性病變的產(chǎn)品。

11、進(jìn)一步地，所述用rt-pcr診斷椎間盤退行性病變的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增elf1基因的引物；

12、其中，用實(shí)時(shí)定量pcr診斷椎間盤退行性病變的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增elf1基因的引物；

13、用免疫檢測診斷椎間盤退行性病變的產(chǎn)品包括：與elf1蛋白特異性結(jié)合的抗體；

14、用原位雜交診斷椎間盤退行性病變的產(chǎn)品包括：與elf1基因的核酸序列雜交的探針；

15、用芯片診斷椎間盤退行性病變的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與elf1蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與elf1基因的核酸序列雜交的探針。

16、所述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷椎間盤退行性病變的產(chǎn)品至少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增elf1基因(genbank號(hào)：nm?006521.6)的引物如seq?id?no.1和seq?id?n0.2所示。

17、本發(fā)明設(shè)計(jì)的能夠擴(kuò)增elf1的引物，利用該引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后得到的elf1片段。該片段可以被一代測序證明是elf1編碼區(qū)的一段序列。

18、本發(fā)明通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)檢測不同退變程度的椎間盤髓核細(xì)胞內(nèi)的elf1表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)elf1表達(dá)會(huì)隨著退變程度的提高而上升，表示elf1能夠用于椎間盤退變程度的輔助診斷。

19、本發(fā)明還提供了一種診斷椎間盤退行性病變的工具，所述工具包括檢測elf1基因表達(dá)的試劑：所述試劑包括檢測elf1基因mrna的引物和/或探針、和/或檢測elf1蛋白的抗體。

20、在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述檢測elf1基因mrna的引物包括seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的引物對(duì)。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

22、1、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了elf1基因表達(dá)與椎間盤退行性病變相關(guān)，通過檢測受試者elf1的表達(dá)，可以判斷受試者是否患有椎間盤退行性病變、或者判斷受試者是否存在患有椎間盤退行性病變的風(fēng)險(xiǎn)，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。

23、2、本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標(biāo)記物elf1基因，相比傳統(tǒng)的檢測手段，基因診斷更及時(shí)、更特異、更靈敏,能夠?qū)崿F(xiàn)椎間盤退行性病變的早期診斷，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)椎間盤退變的早期防治。