本發(fā)明屬于生物復(fù)合材料領(lǐng)域，具體涉及基于納米抗體的脂質(zhì)體類t細(xì)胞激動(dòng)劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、

2、基于t細(xì)胞的免疫療法通過(guò)調(diào)動(dòng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)中最重要且數(shù)量最多的“腫瘤細(xì)胞殺手”—?dú)詔淋巴細(xì)胞產(chǎn)生高效抗腫瘤效應(yīng)，是腫瘤免疫治療研究的前沿?zé)狳c(diǎn)和重要課題。

3、然而，體內(nèi)能夠精準(zhǔn)靶向并浸潤(rùn)到腫瘤內(nèi)部的殺傷性t淋巴細(xì)胞數(shù)量有限。如何提高殺傷性t淋巴細(xì)胞的靶向性，靶向募集足量高活性的殺傷性淋巴t細(xì)胞到達(dá)腫瘤部位，以及增強(qiáng)其在腫瘤內(nèi)部殺傷效應(yīng)是提高抗腫瘤效應(yīng)的關(guān)鍵，也是腫瘤免疫治療研究面臨的核心難題。

4、基于cd3的t細(xì)胞激動(dòng)劑通過(guò)結(jié)合t細(xì)胞受體(t?cell?receptor，tcr)復(fù)合物上的cd3抗原分子和腫瘤的特異性抗原，定向募集t細(xì)胞到腫瘤局灶從而激活t細(xì)胞發(fā)揮殺傷腫瘤效應(yīng)。

5、目前，已開(kāi)發(fā)出多種基于cd3的t細(xì)胞激動(dòng)劑應(yīng)用于臨床研究中，并顯示出有前景的抗腫瘤療效。

6、其中，雙特異性t細(xì)胞激動(dòng)劑(bispecific?t?cell?engager，bite)是最為常見(jiàn)的一類治療性重組融合蛋白t細(xì)胞激動(dòng)劑。但是，bite類分子存在成本高、體內(nèi)半衰期短和藥代動(dòng)力學(xué)特征不佳等缺陷，限制了其廣泛的推廣應(yīng)用。

7、隨著抗體工程的發(fā)展，抗體小型化成為了新型抗體研究的新趨勢(shì)。其中，納米抗體(nanobody，nb)是存在于駱駝、羊駝和鯊魚(yú)體內(nèi)的單域抗體(single-domain?antibody，sdab)，含抗體重鏈的可變區(qū)，大小為5nm×4nm左右，是迄今發(fā)現(xiàn)的較穩(wěn)定的、具有完整抗原結(jié)合能力的最小多肽單位。

8、納米抗體以較小的分子量和體積等特征在腫瘤診治應(yīng)用上帶來(lái)諸多的優(yōu)勢(shì)。但是，從另一方面來(lái)看，這些分子特征會(huì)導(dǎo)致納米抗體血漿半衰期極短，在體內(nèi)循環(huán)的生理過(guò)程中很容易被快速代謝、清除，反而成為了制約納米抗體在臨床治療應(yīng)用的劣勢(shì)。如何通過(guò)選擇合適的載體作為納米抗體在體內(nèi)運(yùn)輸?shù)墓ぞ?，以有助于趨利避害，充分發(fā)揮納米抗體的優(yōu)勢(shì)，是深化納米抗體應(yīng)用所面臨的一個(gè)重大難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明在第一方面提供了一種制備基于納米抗體的脂質(zhì)體類t細(xì)胞激動(dòng)劑的方法，其中，所述方法包括如下步驟：

2、(1)將二硬脂?；字Ｄ憠A、膽固醇琥珀酸單酯、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇溶于有機(jī)溶劑，制得預(yù)處理產(chǎn)物；

3、(2)使用微孔濾膜通過(guò)擠推器推擠所述預(yù)處理產(chǎn)物，獲得納米脂質(zhì)體(liposome,lipo)；

4、(3)使納米抗體和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-琥珀酰亞胺酯發(fā)生加成反應(yīng)，制得納米抗體膠束；

5、(4)向所述納米抗體膠束加入lipo并孵育，制得基于納米抗體的脂質(zhì)體類t細(xì)胞激動(dòng)劑。

6、本發(fā)明在第二方面提供了一種基于納米抗體的脂質(zhì)體類t細(xì)胞激動(dòng)劑，其中，所述激動(dòng)劑通過(guò)本發(fā)明第一方面所述的方法制得。

7、本發(fā)明在第三方面提供了本發(fā)明第二方面所述的基于納米抗體的脂質(zhì)體類t細(xì)胞激動(dòng)劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于如下方面：(1)特異性結(jié)合靶向t細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和/或腫瘤微環(huán)境細(xì)胞的表面特異性標(biāo)志物；(2)激活t細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。

8、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

9、本發(fā)明基于納米抗體的脂質(zhì)體類t細(xì)胞激動(dòng)劑(在同時(shí)包含cd105nb和cd3nb的情況下，下文有時(shí)稱為cd105/cd3nb-lipo)的粒徑較小(如約100nm)，在1×pbs溶液中分布均勻、分散性好、穩(wěn)定性高。

10、本發(fā)明基于納米抗體的脂質(zhì)體類t細(xì)胞激動(dòng)劑如cd105/cd3nb-lipo與t細(xì)胞以及高表達(dá)cd105的靶細(xì)胞(例如bel7404等)具有較高的結(jié)合特異性和結(jié)合效率。

11、本發(fā)明基于納米抗體的脂質(zhì)體類t細(xì)胞激動(dòng)劑如cd105/cd3nb-lipo在體外刺激t細(xì)胞顯著增殖、上調(diào)t細(xì)胞的表面活化分子標(biāo)志物cd25和cd69的表達(dá)，促進(jìn)t細(xì)胞的ifn-γ、tnf-α、il-2分泌。

12、本發(fā)明cd105/cd3nb-lipo能夠介導(dǎo)t細(xì)胞在體內(nèi)外特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，延長(zhǎng)生物體(例如小鼠)生存期。

13、總之，本發(fā)明的基于納米抗體的脂質(zhì)體類t細(xì)胞激動(dòng)劑為細(xì)胞免疫治療在抗腫瘤治療上的應(yīng)用提供新策略。

技術(shù)特征：

1.一種制備基于納米抗體的脂質(zhì)體類t細(xì)胞激動(dòng)劑的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：

5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：

7.一種基于納米抗體的脂質(zhì)體類t細(xì)胞激動(dòng)劑，其特征在于，所述激動(dòng)劑通過(guò)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法制得。

8.根據(jù)權(quán)利要求8所述的激動(dòng)劑，其特征在于：

9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的基于納米抗體的脂質(zhì)體類t細(xì)胞激動(dòng)劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于如下方面：

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種基于納米抗體的脂質(zhì)體類T細(xì)胞激動(dòng)劑及其制備方法和應(yīng)用。所述制備方法包括：將二硬脂?；字Ｄ憠A、膽固醇琥珀酸單酯、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000溶于有機(jī)溶劑；使用聚碳酸酯膜通過(guò)擠推器推擠所述預(yù)處理產(chǎn)物，得到納米脂質(zhì)體；使納米抗體和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺?聚乙二醇?琥珀酰亞胺酯發(fā)生加成反應(yīng)；加入納米脂質(zhì)體并孵育，得到所述激動(dòng)劑。本發(fā)明還涉及由上述方法制得的激動(dòng)劑及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明激動(dòng)劑具有良好的穩(wěn)定性、靶向結(jié)合特異性和抗腫瘤活性，并且對(duì)人正常細(xì)胞無(wú)毒性作用，本發(fā)明在抗腫瘤治療上的應(yīng)用提供新技術(shù)手段和新平臺(tái)，具有積極的臨床應(yīng)用意義。

技術(shù)研發(fā)人員：謝深霞,楊曉梅,黃夏寧,劉恒,盧小玲
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣西醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2