本發(fā)明涉及高分子材料領域及生物醫(yī)用材料領域，具體而言，涉及一種納米多層級天然酶水凝膠及其制備方法。

背景技術：

1、水凝膠一般是由親水高分子在共價或非共價作用下形成的三維交聯(lián)網(wǎng)絡材料，具有優(yōu)異的性能，包括與生物組織相容的機械性能和出色的保水能力，可保持傷口濕潤并持續(xù)吸收滲出液，除了密封傷口以防止液體流失和膿性物質(zhì)積聚外，還可防止結(jié)痂生物促進細菌生長和感染。此外，它們適時的生物降解避免了敷料更換過程中的二次損傷，使其成為理想的傷口敷料材料。更重要的是，通過在結(jié)構和理化性質(zhì)上進行設計和功能整合，可賦予水凝膠廣泛的生物學功能，如抗炎、抗氧化、抗菌和調(diào)控細胞行為等，同時可以改善慢性創(chuàng)面微環(huán)境并促進組織再生。目前大量親水性(包括天然)聚合物可以通過物理或化學交聯(lián)用于構建多種功能的水凝膠材料。

2、酶是一種具有生物催化活性的蛋白質(zhì)大分子，具有優(yōu)異的生物相容性，造成的排異反應與副作用遠低于常規(guī)藥物。目前，如葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶等多種酶類大分子都表現(xiàn)出的較好的促進傷口愈合的功效，如溶菌酶可以破壞細胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細菌溶解。葡萄糖氧化酶可以利用葡萄糖產(chǎn)生活性氧(ros)，達到對細菌感染傷口的抗菌功效，同時也可以與過氧化氫酶級聯(lián)催化，可以進一步將過量的ros分解成水和氧氣，降低傷口炎癥的風險。

3、然而，天然酶在生物醫(yī)用領域中的應用也存在一定問題，如天然酶易于分解，穩(wěn)定性較差，不利于長時間溶液儲存和發(fā)揮功效。此外，多種酶之間的相互協(xié)同增強、級聯(lián)催化難以在低濃度下實現(xiàn)，這限制了天然酶基材料的轉(zhuǎn)化。目前，一系列方法如聚乙烯醇修飾等策略被用于天然酶的修飾以克服其穩(wěn)定性的限制，然而化學偶聯(lián)對酶功能具有潛在的影響，同時修飾過程工藝復雜，以及級聯(lián)反應的空間距離也存在限制，因此如何保證天然酶功能性的同時簡化酶的修飾和保護策略，可以為實現(xiàn)天然酶級聯(lián)反應用于各種生物醫(yī)用領域提供良好的策略。

4、生物體內(nèi)具有天然的納米多層級結(jié)構，如皮膚結(jié)構主要分為三層：表皮、真皮、皮下組織，依此仿生開發(fā)出具有納米多層級的納米結(jié)構水凝膠可以實現(xiàn)更好的生物相容性并發(fā)揮不同維度材料的功效。構筑具有納米結(jié)構的聚合物水凝膠的策略常用兩步法，即構建負載的納米粒子和構建凝膠載體。然而這種方式構建的水凝膠會受到納米粒子濃度的限制，并且消耗的時間相對較長，流程相對復雜。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種納米多層級天然酶水凝膠的制備方法。聚合誘導自組裝(polymerization-induced?self-assembly,pisa)是一種前沿的聚合物自組裝技術，可以通過單體在聚合進程中的自發(fā)組裝行為一步構筑多種聚合物微納米組裝材料，該方法具有高效、便捷的優(yōu)勢，尤其易于達到高濃度納米組裝體。本發(fā)明利用聚合誘導組裝體系，將穩(wěn)定性較差的生物酶類催化劑通過原位自組裝的方式進行聚合物保護和進一步組裝，實現(xiàn)納米到微米到宏觀的逐步組裝過程，一步合成具有尺寸選擇滲透能力的治療性酶載微納米組裝體凝膠。

2、本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種納米多層級天然酶水凝膠，是由有機單體、聚乙烯大分子鏈轉(zhuǎn)移劑(peg?macro-cta)、天然酶通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移自由基聚合(reversibleaddition-fragmentation?chain?transfer?polymerization，raft)的方法以及聚合誘導自組裝(pisa)的方法制備得到。

4、在所述納米多層級天然酶水凝膠的制備過程中，形成包裹天然酶的微納米組裝體，該包裹天然酶的微納米組裝體之間通過纏結(jié)和相互作用而形成多層級物理凝膠，即得到物理凝膠的納米多層級天然酶水凝膠，該納米多層級天然酶水凝膠內(nèi)部具有高濃度的包裹天然酶的微納米組裝體。

5、所述聚乙烯大分子鏈轉(zhuǎn)移劑為聚乙烯二醇三硫代酯衍生物raft試劑，由聚乙二醇單甲醚和含羧基的raft試劑進行酯化反應得到。

6、具體地，所述含羧基的raft試劑為4-氰基-4-[[(乙基硫代)硫酮基甲基]硫代]戊酸(cepa)；所述有機單體為n-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(hpma)。

7、具體地，所述天然酶包括但不限于葡萄糖氧化酶(gox)、過氧化氫酶(cat)、辣根過氧化物酶(hrp)、超氧化物歧化酶、過氧化物酶等。

8、優(yōu)選地，所述天然酶為兩種以上且之間存在級聯(lián)效應的酶的組合，所述納米多層級天然酶水凝膠具有保護酶的級聯(lián)效果的性能，能保證酶在體系里的級聯(lián)效果，對酶起到保護作用；在一優(yōu)選實施方案中，所述天然酶為葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶的組合。

9、第二方面，本發(fā)明還提供上述納米多層級天然酶水凝膠的制備方法，包括如下步驟：將聚乙烯大分子鏈轉(zhuǎn)移劑(peg?macro-cta)、n-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(hpma)、天然酶溶于水中，得到高分子混合液，將該高分子混合液用惰性氣體脫氣處理，于光反應儀中在波長為405nm的光照下反應，得到納米多層級天然酶水凝膠。

10、具體地，所述聚乙烯大分子鏈轉(zhuǎn)移劑的制備過程為：將聚乙二醇單甲醚、4-二甲氨基吡啶(dmap)、cepa、n,n-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)溶于良溶劑中，攪拌反應，過濾旋蒸，用不良溶劑沉淀得到引發(fā)劑。

11、具體地，所述聚乙烯大分子鏈轉(zhuǎn)移劑的制備過程中，所用的良溶劑為無水二氯甲烷(dcm)，所用的不良溶劑為無水乙醚。

12、進一步地，所述聚乙烯大分子鏈轉(zhuǎn)移劑的制備過程為：將聚乙二醇單甲醚、cepa、和dmap置于密閉燒瓶中，氮氣保護下，加入溶于dcm的dcc，溶解，攪拌48-60小時，期間補加dcc，過濾，旋蒸濃縮過濾，將產(chǎn)物置于乙醚中沉淀，隨后將沉淀置于通風櫥環(huán)境下干燥，最后真空干12-24小時，得到產(chǎn)物聚乙烯大分子鏈轉(zhuǎn)移劑peg-cepa?macro-cta。

13、為優(yōu)化體系的催化性能和成膠性能，經(jīng)過生物正交實驗設計，在所述高分子混合液中，n-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(hpma)和聚乙烯大分子鏈轉(zhuǎn)移劑(peg-cepa?macro-cta)的當量比為300:1至900:1，每一種天然酶與聚乙烯大分子鏈轉(zhuǎn)移劑的質(zhì)量比為1:3000至1:15，n-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺的質(zhì)量濃度比為10％-70％。

14、具體地，所述酶納米多層級天然酶水凝膠的制備方法所使用的惰性氣體為氮氣、氬氣等。

15、在一優(yōu)選實施方案中，所述天然酶為葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶的組合，在所述高分子混合液中，n-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺和聚乙烯大分子鏈轉(zhuǎn)移劑的當量比為400:1，葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶與聚乙烯大分子鏈轉(zhuǎn)移劑的質(zhì)量比均為1:60，n-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺的質(zhì)量濃度比為60％。

16、進一步地，所述酶納米多層級天然酶水凝膠的制備方法為：將peg-cepa?macro-cta和cat、gox于水中完全溶解、混勻，加入hpma，渦旋混勻，密閉，通入惰性氣體排出體系中的空氣，通氣時間約20-30分鐘，后置于光反應儀中反應，設置光波長為405nm，轉(zhuǎn)速800rpm，反應3小時。反應結(jié)束后打開密封橡膠塞，與空氣接觸，渦旋，終止反應。

17、本發(fā)明具有以下有益效果：

18、本發(fā)明提供的納米多層級天然酶水凝膠，是由高分子聚合物與天然酶通過聚合誘導組裝體系原位反應形成負載酶的納米多層級水凝膠，在聚合反應過程中原位自組裝形成微納米組裝體，形成的微納米組裝體通過纏結(jié)和相互作用形成納米多層級物理凝膠。這種物理凝膠具有高濃度的微納米組裝結(jié)構，通過天然酶的加入可以實現(xiàn)高濃度、穩(wěn)定的天然酶負載組裝體并進一步形成水凝膠。這種簡單、原位、溫和的原位天然酶保護方式可以保證多種酶之間的相互串聯(lián)反應，同時可以保護天然酶的穩(wěn)定性。此外，這種納米多層級水凝膠從微觀到宏觀一步制備實現(xiàn)，成分簡單，條件溫和，在生物醫(yī)學領域?qū)⒂休^好的應用前景。