本發(fā)明屬于醫(yī)用止血材料，特別涉及一種高效抑制出血和促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的止血材料及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、出血控制是人類歷史上世代研究的問題，未受控制的大量出血是導(dǎo)致病患死亡的主要原因之一。全球范圍內(nèi)每年因創(chuàng)傷造成的死亡人數(shù)約占總死亡人數(shù)的10％，其中有40％的創(chuàng)傷病人的死亡是由大量出血所致；全世界每年有400多萬人在手術(shù)后死亡，術(shù)后并發(fā)癥(如出血和感染)是造成術(shù)后死亡的主要原因；現(xiàn)代戰(zhàn)爭中，75％的傷亡事件由爆炸性碎片和槍傷造成，出血是戰(zhàn)場創(chuàng)傷的主要死因。因此，實(shí)現(xiàn)快速有效的止血是提高創(chuàng)傷、手術(shù)、戰(zhàn)爭中患者生存率的關(guān)鍵因素。除了快速止血，創(chuàng)面愈合是一個(gè)緩慢而復(fù)雜的過程，通常需要通過額外的干預(yù)措施，從而達(dá)到更好的治療效果，減少創(chuàng)面感染的發(fā)生。由此可見，在日常生活中意外創(chuàng)傷的緊急救治、醫(yī)院外科手術(shù)過程中的止血以及戰(zhàn)爭中受傷戰(zhàn)士的救護(hù)中，傷口局部快速有效的止血和愈合非常重要。

2、用于院前治療或外科出血控制的止血材料主要通過三類止血機(jī)制發(fā)揮作用：(1)物理機(jī)制通過膨脹壓迫、密封封堵和吸收液體富集凝血相關(guān)蛋白等手段，達(dá)到止血目的；(2)化學(xué)機(jī)制通過使用陽離子聚合物等具有特定結(jié)構(gòu)或性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)，觸發(fā)和加速止血過程；(3)生物機(jī)制通過模仿血小板或凝血因子的結(jié)構(gòu)或功能，并對觸發(fā)天然止血過程以控制出血。止血材料的形式多樣，使用最廣泛的止血材料形式包括海綿、水凝膠、納米纖維和顆?；蚍勰?。

3、混合材料或復(fù)合材料越來越受到關(guān)注，它們結(jié)合不同成分的有用特性，避免單一材料的某些缺點(diǎn)，涉及多種止血策略，通過協(xié)同作用，同時(shí)激活一期和二期止血達(dá)到減少出血的目的。但大多數(shù)局部止血?jiǎng)┰谘耗虣C(jī)制受損的情況下可能無法起作用。例如，浸有高嶺土的無紡布紗布combat?gauze在血液凝固機(jī)制受損時(shí)，無法作為促凝劑，通過啟動(dòng)凝血級聯(lián)反應(yīng)，有效控制出血。因此，作用于凝血級聯(lián)反應(yīng)下游的凝血酶、纖維蛋白原等凝血因子常被單獨(dú)用作止血材料，或與其他材料結(jié)合形成復(fù)合止血材料。

4、凝血酶具有多種功能，在促進(jìn)凝血和創(chuàng)口愈合中發(fā)揮重要作用。(1)凝血酶通過作用于多種底物以促進(jìn)止血：水解纖維蛋白原，促進(jìn)纖維蛋白單體自發(fā)非共價(jià)結(jié)合；激活凝血因子xiii，使相鄰纖維蛋白分子共價(jià)交聯(lián)，增強(qiáng)纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)完整性；激活凝血酶激活纖溶抑制物，間接增強(qiáng)凝塊穩(wěn)定性；水解凝血因子?、ⅷ和ⅴ，正反饋促進(jìn)自身生成。(2)凝血酶通過激活血小板上的蛋白酶激活受體，促進(jìn)血小板活化，導(dǎo)致血小板聚集、脫顆粒和促凝磷脂(如磷脂酰絲氨酸)的表面表達(dá)。(3)凝血酶還能刺激內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等，促進(jìn)細(xì)胞表面表達(dá)和分泌細(xì)胞粘附分子和生長因子，促進(jìn)細(xì)胞因子(如αvβ3、vegf、ang2等)產(chǎn)生。

5、但對于止血材料而言，凝血酶是一把雙刃劍。凝血酶也參與抗凝過程，與血栓調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，通過激活蛋白c抗凝途徑，選擇性滅活活化的凝血因子ⅴ和ⅷ，抑制凝血反應(yīng)。在臨床工作中，研究者曾在一位急性腸系膜靜脈血栓形成和靜脈血栓家族史陽性的患者中發(fā)現(xiàn)凝血酶原突變體arg541trp。經(jīng)研究，突變型凝血酶激活蛋白c抗凝途徑的能力下降，在凝血酶生成試驗(yàn)中，突變型凝血酶原突變體arg541trp在相同條件下促進(jìn)更多凝血酶生成，與野生型相比，表現(xiàn)出偏向凝血的活性。這提示對于止血材料的開發(fā)，突變型凝血酶也許能達(dá)到更好的止血效果，成為比野生型凝血酶更好的選擇。

6、目前，許多基于凝血酶的藥物/治療方法正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，其中一些已獲得fda批準(zhǔn)，但它們在止血效果、生物安全性、生產(chǎn)方式等方面仍存在問題。(1)牛血漿來源的凝血酶是美國使用的最常見和最便宜的活性止血制劑，通常被認(rèn)為是凝血酶產(chǎn)品的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。但是作為一種異源血漿凝血酶，患者在使用后存在過敏反應(yīng)問題，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫介導(dǎo)的出凝血紊亂。(2)人血漿來源的凝血酶在制造過程中經(jīng)歷了一系列凈化程序，但仍然存在潛在的病毒感染傳播的風(fēng)險(xiǎn)，且人源性血液制品供應(yīng)有限，可能無法滿足潛在需求。(3)基因工程重組表達(dá)人凝血酶生物安全性較高。生產(chǎn)方面，重組人凝血酶目前主要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞工程株如cho中進(jìn)行，但是該方法成本高，產(chǎn)量低，限制了在制藥企業(yè)的應(yīng)用；原核細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)蛋白成本低廉，產(chǎn)量大，但是存在蛋白復(fù)性折疊和純化的困難，因此目前尚無大規(guī)模應(yīng)用。(4)纖維蛋白膠由單獨(dú)包裝的人凝血酶和人纖維蛋白原組成，作為一種支持性的治療方法，改善手術(shù)中的止血效果。但它進(jìn)入血管后，可能導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血、血栓栓塞或嚴(yán)重的過敏反應(yīng)；(5)tachosil是包載人凝血酶和人纖維蛋白原的膠原海綿，用于在手術(shù)過程中停止內(nèi)臟器官的局部出血。它與血液、生理鹽水或其他類型的體液接觸后發(fā)生反應(yīng)，形成凝塊，粘附在組織表面，可在幾分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)止血，然而在某些情況下，患者在治療時(shí)會(huì)出現(xiàn)過敏反應(yīng)或超敏反應(yīng)。

7、專利cn?116271195a公開了一種負(fù)載凝血酶的酸化氧化再生纖維素與氧化納米纖維素混合的止血材料，是由氧化再生纖維素經(jīng)稀鹽酸酸化得到的酸化氧化納米纖維素和負(fù)載cu2+的氧化納米纖維素，與凝血酶溶液混合，經(jīng)洗滌干燥后制得，可以在較短時(shí)間內(nèi)抑制動(dòng)物模型的體內(nèi)出血。但是該專利提供的混合止血材料存在抑制止血的效果有待提高的問題，其用于兔肝臟創(chuàng)面出血模型的止血效果顯示，考察完全止血的時(shí)間達(dá)到2.8min。同時(shí)其生物安全性和可降解性未得到證實(shí)，不具備促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的作用。

8、專利cn116549742a公開了一種由有機(jī)高分子制成的防粘連超細(xì)纖維膜和附著于該防粘連超細(xì)纖維膜表面的止血材料，由tempo-氧化纖維素納米纖維、殼聚糖、凝血酶和脫細(xì)胞化肝細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合制得。該復(fù)合止血材料具有止血抗炎、良好生物相容性、降解產(chǎn)物對人體無毒害、可防粘連的優(yōu)點(diǎn)。但該專利提供的復(fù)合止血材料促進(jìn)凝血的效果不理想，用于體外凝血指數(shù)測定的試驗(yàn)顯示，考察3min時(shí)的體外凝血指數(shù)為10％。因此，該凝血酶材料在實(shí)現(xiàn)止血及抗炎的前提下，仍然存在出血時(shí)間較長的問題。

9、可見，目前基于凝血酶制成的止血材料普遍采用動(dòng)物/人源血漿來源的野生型凝血酶，存在止血效果不理想、生物安全性存在隱患等問題。因此，如何規(guī)避動(dòng)物/人源血漿制品帶來的安全隱患，在發(fā)揮凝血酶促進(jìn)止血和修復(fù)作用的同時(shí)，減少其抗凝作用，提高止血效率，減少患者出血量，縮短患者出血時(shí)間，成為當(dāng)前亟待解決的技術(shù)難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決以上技術(shù)難題，本發(fā)明提供一種高效抑制出血和促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的止血材料及其制備方法與應(yīng)用，一方面解決基于凝血酶的止血材料主要采用動(dòng)物/人源血漿制品的問題，規(guī)避其生物安全方面的隱患；另一方面解決凝血酶止血材料止血效果不足的問題，在發(fā)揮凝血酶促進(jìn)止血和修復(fù)作用的同時(shí)，減少其抗凝作用，提高止血效率。

2、本發(fā)明提供了一種高效抑制出血和促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的止血材料，由突變型人凝血酶與氧化細(xì)菌纖維素納米短纖維制備而得。

3、優(yōu)選的，所述止血材料為粉末狀、海綿狀、凝膠狀或乳液狀。

4、本發(fā)明還提供了一種高效抑制出血和促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的止血材料的制備方法，包括如下步驟：

5、(1)發(fā)酵培養(yǎng)菌落，得到水凝膠狀的細(xì)菌纖維素膜，通過剪切、勻漿、冷凍干燥和氧化處理，得到氧化細(xì)菌納米纖維素短纖維；

6、(2)通過轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)細(xì)菌，表達(dá)突變型人前凝血酶-2，通過增溶、復(fù)性、激活和純化處理，得到高止血活性的突變型人凝血酶；

7、(3)將突變型人凝血酶與氧化細(xì)菌纖維素納米短纖維混合，采用edc/nhs接枝反應(yīng)制備得到高效抑制出血和促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的止血材料。

8、優(yōu)選的，所述步驟(1)中的菌落為木葡萄糖酸醋桿菌。

9、優(yōu)選的，所述步驟(2)中的突變型人前凝血酶-2的氨基酸序列如seq?no.1所示。

10、優(yōu)選的，所述步驟(2)中的細(xì)菌為大腸桿菌bl21(de3)。

11、優(yōu)選的，所述步驟(2)中的增溶包括將突變?nèi)饲澳?2包涵體重懸至10mg/ml，使用增溶液的組分為：23mm醋酸銨，6m鹽酸胍，10mm?edta，30mm半胱氨酸，ph?9.5。

12、優(yōu)選的，所述步驟(2)中的復(fù)性包括將可溶性突變型人前凝血酶-2蛋白稀釋至50-100μg/ml，使用復(fù)性液的組分為：50mm?tris-hcl，20mm氯化鈣，500mm氯化鈉，1mm?edta，600mm精氨酸，1mm半胱氨酸，0.1mm胱氨酸，10％(v/v)甘油和0.2％(w/v)聚乙二醇十六烷基，ph?8.5。

13、優(yōu)選的，所述(2)步驟中的純化包括將復(fù)性后的突變型人前凝血酶-2溶液于25℃中透析1-2天，使用透析液的組分為：20mm?mes，100mm氯化鈉，ph?5.5。

14、優(yōu)選的，所述步驟(3)中的突變型人凝血酶與氧化細(xì)菌纖維素納米短纖維的比例為1000iu:1-10mg。

15、優(yōu)選的，所述步驟(3)中的edc/nhs接枝反應(yīng)溫度為4℃，反應(yīng)時(shí)間為10-16h。

16、本發(fā)明還提供了一種高效抑制出血和促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的止血材料在醫(yī)用止血中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明通過木葡萄糖酸醋桿菌合成細(xì)菌纖維素膜，進(jìn)一步制備成納米短纖維，經(jīng)過tempo化學(xué)氧化，將細(xì)菌納米纖維素側(cè)鏈中的伯醇選擇性地氧化為羧基，得到可降解的氧化細(xì)菌納米纖維素短纖維；通過大腸桿菌表達(dá)優(yōu)化后的突變型人前凝血酶-2，經(jīng)過鹽酸胍增溶、稀釋復(fù)性、蛇毒激活和純化，得到高止血活性的突變型人凝血酶。突變型人凝血酶上的氨基與氧化細(xì)菌納米纖維素側(cè)鏈中的羧基形成酰胺鍵，構(gòu)建得到一種能夠高效抑制出血和促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的海綿止血材料。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明提供的氧化納米短纖維可以制備成多種形式，以粉末、海綿、凝膠和懸液等多種形態(tài)，滿足不同出血場景中的止血需求。該突變型凝血酶接枝的氧化納米短纖維止血材料具有優(yōu)異的止血效果，促進(jìn)各類血液成分的黏附，在小鼠肝臟出血模型中，有利于縮短出血時(shí)間、減少出血量；同時(shí)具有優(yōu)異的促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的效果，有利于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，在小鼠全層皮膚創(chuàng)面模型中，具有顯著促進(jìn)創(chuàng)面結(jié)痂和提高愈合率的效果，是一種同時(shí)促進(jìn)止血和創(chuàng)面修復(fù)的高效止血材料。

18、有益效果

19、(1)本發(fā)明提供的氧化細(xì)菌纖維素納米短纖維具有納米級結(jié)構(gòu)，吸水率高，能夠黏附濃集各類血液成分，激活凝血反應(yīng)抑制出血。

20、(2)本發(fā)明提供的高止血活性的突變型人凝血酶，具有較高生物安全性和優(yōu)異的止血效果。發(fā)色底物試驗(yàn)中，激活蛋白c的能力減弱，抗凝能力受損。體外凝血指數(shù)試驗(yàn)中，在不同時(shí)間點(diǎn)達(dá)到的bci指數(shù)最低。大鼠肝臟出血模型中，體現(xiàn)出優(yōu)異的促凝血功能。

21、(3)本發(fā)明提供的止血材料具有促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的效果，促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞及小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的增殖和相關(guān)細(xì)胞因子分泌。在大鼠皮膚全層創(chuàng)傷模型中，在不同時(shí)間點(diǎn)均保持創(chuàng)面干燥，提高創(chuàng)面愈合率，在21d時(shí)完全降解，處理的創(chuàng)面在21d時(shí)完全結(jié)痂。