本發(fā)明涉及醫(yī)用美容填充材料，特別涉及一種可控的注射用細胞外骨架凝膠材料及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、組織的再生的多種方式多種多樣，如細胞內(nèi)/外聚合，通過在活細胞上原位合成功能聚合物，或在體外制備支架并接種細胞培養(yǎng)后植入體內(nèi)進行再生。但這些方法都有較大的局限性，細胞內(nèi)/外聚合是暫不成熟的新興領域，細胞原位合成的功能聚合物需要復雜的手段才能實現(xiàn)；而體外組織工程又需要復雜的細胞培養(yǎng)條件來獲得體外功能組織，自分泌和旁分泌信號效應在體外培養(yǎng)中很難重現(xiàn)。

2、原位組織工程，也是使用組織原本再生的能力與工程生物材料相結(jié)合進行的一種有效的組織工程再生手段。在這個過程中，生物材料提供結(jié)構(gòu)框架，以促進宿主干細胞和祖細胞的附著和遷移，并推動這些細胞分化成特異性細胞類型，以達到修復或再生的目的。

3、組織再生的最終目的是使用一定的手段實現(xiàn)細胞的遷移及增殖，重塑細胞外基質(zhì)（ecm），用以影響細胞功能，如重組細胞骨架、激活整合素和基因的正常表達。ecm具有獨特的空間組織，在定向組織如肌肉、神經(jīng)中，均能觀察到細胞和ecm獨特的排列方式。原位組織工程通過對支架進行近ecm結(jié)構(gòu)設計以實現(xiàn)引導細胞再生，從而創(chuàng)造人造ecm形態(tài)，從而實現(xiàn)引導分化、細胞封裝、原位再生和保護、ecm重塑以及組織修復。

4、在原位組織再生的過程中，生物材料提供的支架在植入后應利于細胞和組織的滲透，隨后，支架應被分解并完全重新吸收。在此過程中的關鍵點是支架應需要受控降解以指導原位組織再生，這個過程需要平衡支架的降解速度以及組織的再生速度，以完成結(jié)構(gòu)和功能的再生。

5、原位組織工程生物材料的原料來源廣泛，材料需要生物信號能夠做出反應，并與免疫系統(tǒng)和內(nèi)源性細胞相互作用以刺激再生。同時，在設計過程需精確控制結(jié)構(gòu)以及生物特性，用以將內(nèi)源性細胞引導到損傷部位。這項技術(shù)為定制生物大分子特性、實現(xiàn)精確的空間控制和將材料生物實體無縫整合開辟了前所未有的途徑。

6、再生絲素蛋白因其卓越的機械性能、優(yōu)良的生物相容性、生物降解性及多功能結(jié)構(gòu)而備受青睞，被廣泛應用于生物醫(yī)藥和組織工程領域。其具有獨特的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，再生絲素蛋白中一定的β-折疊結(jié)構(gòu)的形成可形成納米級微纖，相互交疊聚集，形成絮狀網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。在組織再生的過程中，可利用該特性制備支架以模擬ecm的結(jié)構(gòu)，以達到細胞的增殖再生和重塑ecm的目的。

7、在注射組織填充中，植入組織工程支架促進原位組織再生是有效的修復方式。市面上少見以該種方式進行修復的產(chǎn)品，常見產(chǎn)品以透明質(zhì)酸為代表的純物理填充劑，無再生功效且容易吸水腫脹；另一類則是以聚左旋乳酸和聚己內(nèi)酯為代表的微球類產(chǎn)品，但其結(jié)構(gòu)松散，容易被組織環(huán)境和蛋白酶快速分解，難以維持長期填充效果。這些產(chǎn)品與人體皮膚本身的微結(jié)構(gòu)存在極大的不同，相比之下，再生絲素蛋白微纖由于其較為致密和穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)，具有合適的降解周期，是良好的組織再生填充材料，若以該材料為基底制備支架，對支架進行一定的結(jié)構(gòu)設計模擬ecm，能更有效地刺激組織再生。

8、在現(xiàn)今已有的發(fā)明中，有絲素蛋白與透明質(zhì)酸鹽使用bdde等化學交聯(lián)劑的進行交聯(lián)，形成絲素蛋白透明質(zhì)酸三維互穿網(wǎng)絡的復合凝膠材料，但交聯(lián)度不可控，化學交聯(lián)劑的使用有一定的細胞毒性，在體內(nèi)殘留堆積后，易引發(fā)紅腫、過敏、致癌等風險。

9、因此，尋找一種交聯(lián)度可控、分子量可控，降解過程與原位組織再生過程相匹配的，且與人體皮膚微結(jié)構(gòu)相似的絲素蛋白細胞外骨架凝膠材料，并兼具良好的生物相容性、吸水性、良好的力學性能和可注射性，是絲素蛋白組織工程材料的重點研發(fā)方向。而不同皮膚組織對應的張力不同，所需填充材料的流變學性能也不同，本發(fā)明所述的注射用絲素蛋白細胞外骨架凝膠材料通過不同的工藝調(diào)整，使得其與不同的皮膚微結(jié)構(gòu)相匹配，且與不同皮膚位置再生過程相匹配，實現(xiàn)可控的原位組織再生。

10、本發(fā)明所述的注射用絲素蛋白細胞外骨架凝膠材料，在注射入皮膚的初期，通過物理占位實現(xiàn)除皺提升的效果，無吸水體積脹大的現(xiàn)象；后期在凝膠的細胞外骨架狀結(jié)構(gòu)下，凝膠材料可以促進組織的原位再生，以膠原蛋白在病理切片中面積占比上升為表現(xiàn)，且通過調(diào)節(jié)組分的分子量和配比，使得凝膠材料在體內(nèi)的降解速度可控，表現(xiàn)在凝膠在體內(nèi)的留存率。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述問題，本發(fā)明擬提供一種交聯(lián)度可控、分子量可控，降解過程與原位組織再生過程相匹配的，且與人體皮膚微結(jié)構(gòu)相似的絲素蛋白細胞外骨架凝膠材料，并兼具良好的生物相容性、吸水性、良好的力學性能和可注射性，并且要求不使用化學交聯(lián)劑以減少相應殘留。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案為：

3、一種注射用絲素蛋白細胞外骨架凝膠，該凝膠交聯(lián)度可控、分子量可控，降解過程與原位組織再生過程相匹配，其可以是一種可控的注射用細胞外骨架凝膠材料。

4、所述凝膠包括絲素蛋白5~50份，纖維素0.01~5份，透明質(zhì)酸鹽0.7~10份，所述凝膠按如下步驟制備：

5、(1)?絲素蛋白微纖凝膠的制備：絲素蛋白水溶液加入纖維素制備凝膠，破碎，過篩得到絲素蛋白微纖凝膠；

6、（2）細胞外骨架凝膠材料制備：透明質(zhì)酸鹽與絲素蛋白微纖凝膠混合，使其物理交聯(lián)，形成絲素蛋白細胞外骨架凝膠材料。

7、凝膠材料中不包括任何化學交聯(lián)劑。

8、所述纖維素為羥丙甲纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素中的一種或兩種以上，優(yōu)選為羥丙甲纖維素。所述透明質(zhì)酸鹽為透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸鎂中的一種或兩種以上任意比例的混合，優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉。

9、進一步，本發(fā)明所述絲素蛋白復合填充劑的制備方法為：(1)?絲素蛋白微纖凝膠：將桑蠶蠶絲放入煮沸的質(zhì)量分數(shù)為0.1-5%碳酸鈉水溶液或碳酸鈉和碳酸氫鈉的混合溶液中，加熱煮沸10-120分鐘，在25-100℃烘干，溶于9.3mol/l的溴化鋰水溶液中，25-100℃水浴10-120分鐘至絲蛋白充分溶解，用50-200目過濾袋過濾掉不溶性顆粒雜質(zhì)，脫鹽濃縮后，得到特定分子量的絲素蛋白水溶液。將質(zhì)量濃度20%的絲素蛋白溶液，加入纖維素溶液后，經(jīng)超聲波破碎儀超聲處理。成凝膠后,在1500-24000rpm/min條件下均質(zhì)5min，過篩，收集過200~325目篩的絲素蛋白微纖凝膠；(2)?細胞外骨架凝膠的制備：透明質(zhì)酸顆粒與絲素蛋白微纖混合，25~60℃條件下靜置2~8h，使其物理交聯(lián)，透析液透析，灌裝，滅菌，形成絲素蛋白細胞外骨架凝膠材料。

10、進一步，通過靜置過程+溫度控制，可控制β-折疊程度以及氫鍵數(shù)量，以控制凝膠的交聯(lián)度。烷氧基基團促進了分子間疏水相互作用，同時羥丙甲纖維素中的羥丙基和水分子之間的氫鍵會延遲凝膠形成。在纖維素的疏水相互作用下，β-折疊結(jié)構(gòu)分布均勻，交聯(lián)密度更高，其交聯(lián)形式類似于細胞外骨架構(gòu)成。

11、進一步，所述細胞外骨架凝膠由如下質(zhì)量配比的原料組成：絲素蛋白5~50份，纖維素0.01-5份，透明質(zhì)酸鹽0.7~10份。優(yōu)選絲素蛋白10~50份，纖維素0.01-5份，透明質(zhì)酸鹽0.7~5份。

12、進一步優(yōu)選絲素蛋白：透明質(zhì)酸鹽大于等于2:1，3:1或者4:1以上。

13、另外，優(yōu)選絲素蛋白：透明質(zhì)酸鹽大于等于1.5:1，或者小于等于1.618:1，或者1.5≤絲素蛋白/透明質(zhì)酸鹽≤1.618。

14、進一步，步驟(1)中絲素蛋白的分子量在50kda至350kda。

15、進一步，步驟(2)中已交聯(lián)的透明質(zhì)酸顆粒分子量在500kda至2400kda，優(yōu)選為1500kda至2400kda。

16、進一步，步驟(2)絲素蛋白微纖凝膠和透明質(zhì)酸顆?；靹蚝?優(yōu)選在40-55℃條件下靜置。

17、進一步，步驟(2)?絲素蛋白微纖凝膠和透明質(zhì)酸顆?；靹蚝?優(yōu)選在4~6h?條件下靜置。

18、本發(fā)明提供所述的絲素蛋白細胞外骨架凝膠材料，它具有/尺寸可控、分子量高、交聯(lián)度可控、易于填充、對皮膚親和度高等優(yōu)點，相比于常規(guī)的絲素蛋白填充劑更適合作為軟組織填充材料。不同皮膚部位張力和強度不同，對應材料的不同流變學性能，即彈性模量和黏性模量。烷氧基基團促進了分子間疏水相互作用，誘導共混體系(混合溶液)發(fā)生經(jīng)成核-長機制進行的相分離。相分離導致了sf富集相的產(chǎn)生，提高了sf的局部濃度，促使sf?分子發(fā)生由無規(guī)線團/螺旋結(jié)構(gòu)向β-折疊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。這一過程有點類似蛋白質(zhì)折疊中的“大分子擁擠效應(macromolecular?crowding?effect)”，?sf分子間所形成的β-折疊結(jié)構(gòu)在凝膠網(wǎng)絡中充當了物理交聯(lián)點的作用，隨著相分離的進行，相結(jié)構(gòu)發(fā)生粗大化。與此同時，由sf分子鏈間形成的?β-折疊結(jié)構(gòu)逐漸增加，直到貫穿體系的凝膠網(wǎng)絡形成。sf分子鏈間形成的?β-折疊結(jié)構(gòu)進一步增加和完善，提供更多的交聯(lián)點，使凝膠網(wǎng)絡得以發(fā)展，而處于分散相中的分子鏈運動受限，部分分子鏈甚至嚴重受限，已形成的相結(jié)構(gòu)被“凍結(jié)”下來，則凝膠形成。

19、另外，當纖維素，如羥丙甲纖維素中的羥丙基和水分子之間的氫鍵會延遲凝膠形成，使得凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)形成過程緩慢均一。因此該凝膠的宏觀力學性能會更強。通過在不同溫度下調(diào)控絲素蛋白的β折疊速度及比例，調(diào)節(jié)本發(fā)明所述凝膠材料的物理交聯(lián)程度。

20、所述軟組織填充材料是指面部除皺等微整形填充材料。

21、本發(fā)明的有益效果

22、（1）?本發(fā)明所述水凝膠的原料為成本低廉并且經(jīng)過美國食品藥品監(jiān)督管理局(food?and?drug?administration,?fda)認證的絲素蛋白，因而所獲得的水凝膠具有良好的生物相容性和生物降解性。

23、（2）?本發(fā)明所述水凝膠的力學強度可控，通過彈性模量和黏性模量表現(xiàn)可知，僅需通過改變分子量和配比即可制備得到一系列不同力學強度的水凝膠，進而滿足不同面部皮膚的使用要求。

24、（3）?本發(fā)明所述水凝膠在結(jié)構(gòu)組成、規(guī)格尺寸和功能上與細胞外骨架相似；組成成分均為纖維狀蛋白，直徑在5-30nm，對維持細胞正常的形態(tài)，承受一定的外力，同時維持細胞各種功能正常的運行方面發(fā)揮著重要作用，可以自然面部皮膚組織的力學性能相媲美；在物質(zhì)的運輸以及物質(zhì)的轉(zhuǎn)運等方面，細胞外骨架也發(fā)揮著重要的作用，本發(fā)明所述水凝膠亦可促進周圍成纖維細胞轉(zhuǎn)移、分化（見圖3），實現(xiàn)組織再生。

25、（4）?本發(fā)明所述水凝膠的制備方法綠色環(huán)保、成本低廉、易于實現(xiàn)，有望用于商業(yè)大規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明的絲蛋白納米微纖水凝膠可廣泛用于生物醫(yī)學材料、納米功能材料中。