本發(fā)明涉及一種基于高通量測(cè)序的蟹類攻擊性基因篩選方法，屬于動(dòng)物行為學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、攻擊性是動(dòng)物界中普遍存在的重要個(gè)性特征，對(duì)個(gè)體的資源獲取、成長、生活史以及適應(yīng)性具有深遠(yuǎn)的影響。不同攻擊性的個(gè)體通常表現(xiàn)出與其競爭能力相匹配的行為如，強(qiáng)攻擊性個(gè)體表現(xiàn)出競爭和資源壟斷行為，弱攻擊性個(gè)體則避免直接競爭資源和代價(jià)高昂的社會(huì)互動(dòng)。

2、攻擊性作為一種復(fù)雜的數(shù)量性狀，受許多基因表達(dá)的影響。如，與斑馬魚(daniorerio)攻擊持續(xù)時(shí)間顯著相關(guān)的基因模塊有12個(gè)；細(xì)胞色素p450基因家族以及與電子傳遞、電壓門控鉀通道、分解代謝、g蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)傳導(dǎo)以及基本細(xì)胞和代謝過程相關(guān)的基因均與攻擊行為有關(guān)。大量的基因表達(dá)模式可以被看作是控制攻擊性的神經(jīng)基因組狀態(tài)的肖像，不同的攻擊性表型與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中不同的基因表達(dá)模式相對(duì)應(yīng)。了解這些機(jī)制不僅有助于深入揭示甲殼動(dòng)物的行為學(xué)特點(diǎn)，也為甲殼動(dòng)物選育及資源管理提供了理論基礎(chǔ)。

3、傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖條件下，蟹類經(jīng)常面臨有限的空間、食物和群體組成的反復(fù)變化等問題，它們比在自然環(huán)境下更容易發(fā)生種內(nèi)殘食，導(dǎo)致附肢殘缺甚至死亡。殘缺的個(gè)體攝食更加困難，因此它們的生長速度往往會(huì)受到影響，從而導(dǎo)致養(yǎng)殖品質(zhì)下降，養(yǎng)殖產(chǎn)量減少，因此，基于經(jīng)濟(jì)蟹類攻擊性性狀的新品種選育十分必要。本發(fā)明將行為學(xué)與分子生物學(xué)研究相結(jié)合，建立了蟹類攻擊性基因篩選方法，通過層級(jí)篩選機(jī)制識(shí)別出關(guān)鍵的調(diào)控基因，為今后蟹類種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育提供新思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是應(yīng)用行為學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)，提供一種蟹類攻擊性基因篩選的方法，為蟹類優(yōu)良品種的選育提供分子技術(shù)支持。

2、為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一種基于高通量測(cè)序的蟹類攻擊性基因篩選的方法，包括：

4、步驟1，通過鏡像實(shí)驗(yàn)與攻擊性評(píng)測(cè)模型評(píng)估蟹的攻擊性，選取不同攻擊性表型的蟹；

5、其特征還包括以下步驟：

6、步驟2，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，識(shí)別不同攻擊性表型蟹胸神經(jīng)節(jié)的差異基因，每組生物學(xué)重復(fù)不少于3；

7、步驟3，對(duì)差異基因進(jìn)行kegg富集分析，篩選前n條差異信號(hào)通路，以得到攻擊性差異基因子集；

8、1.采用r語言對(duì)步驟2獲取的差異基因進(jìn)行kegg通路富集分析；

9、2.對(duì)上述分析結(jié)果采用fisher精確檢驗(yàn)，當(dāng)p<0.05時(shí)，說明該kegg通路功能存在顯著富集情況，顯著富集的kegg通路數(shù)量記為q1；

10、3.將顯著富集的kegg通路按p值從小到大進(jìn)行排序，最終得到的差異基因子集中的基因數(shù)量記為q2：

11、情況1：q1≥20

12、若n＝20時(shí)，q2≤500，則篩選前20條差異信號(hào)通路中富集的基因作為差異基因子集；

13、若n＝20時(shí)，q2>500，則計(jì)算前n-1條差異信號(hào)通路中富集的基因，直到q2≤500；情況2：q1<20

14、若n＝q1時(shí)，q2≤500，則篩選前q1條差異信號(hào)通路中富集的基因作為差異基因子集；

15、若n＝q1時(shí)，q2>500，則計(jì)算前n-1條差異信號(hào)通路中富集的基因，直到q2≤500。

16、步驟4，通過基因集富集分析(gsea)，篩選差異基因子集中對(duì)富集得分貢獻(xiàn)大的基因，作為目標(biāo)基因集：

17、1.若q2≤50，則差異基因子集中的基因全部作為目標(biāo)基因集，直接進(jìn)行步驟5；

18、若q2>50，則通過r語言對(duì)差異基因子集進(jìn)行g(shù)sea分析；

19、2.gsea的篩選標(biāo)準(zhǔn)為|nes|>1，fdr<0.25，其中nes為標(biāo)準(zhǔn)化富集得分，fdr為多重假設(shè)檢驗(yàn)矯正后的p值；|nes|越大，fdr值越小，富集越顯著；

20、3.對(duì)差異基因子集中的基因，根據(jù)nes得分采用signal2noise排序算法，先驗(yàn)基因集的大小(根據(jù)差異基因子集的基因數(shù)量設(shè)置)為15～q2；

21、4.將對(duì)富集得分貢獻(xiàn)最大的基因成員組合，作為目標(biāo)基因集。

22、步驟5，采用表達(dá)量相關(guān)性分析，獲取攻擊性表型調(diào)控的關(guān)鍵基因集；

23、步驟6，以關(guān)鍵基因集中的受體蛋白為核心調(diào)控蛋白。

24、所述步驟1中，進(jìn)行攻擊性評(píng)測(cè)采用如下方式：

25、1.將蟹于水族缸中隔離暫養(yǎng)兩周；

26、2.選取健康、附肢完整和處于蛻殼間期的蟹進(jìn)行鏡像實(shí)驗(yàn)，重復(fù)拍攝3次，每次間隔不少于24h；

27、3.通過行為分析軟件記錄并量化蟹的攻擊性行為，包括靜止累計(jì)持續(xù)時(shí)間和相對(duì)移動(dòng)距離(移動(dòng)距離與甲寬的比值)；

28、4.基于蟹的攻擊性評(píng)測(cè)模型，計(jì)算攻擊性得分，以得到不同攻擊性表型的蟹；

29、所述步驟1中，進(jìn)行鏡像實(shí)驗(yàn)采用如下方式：

30、選取內(nèi)壁呈不透明白色的觀察缸，攝像機(jī)固定于觀察缸正上方，取寬度與觀察缸內(nèi)徑相等的兩面鏡子，將兩面鏡子背面貼合垂直放置于觀察缸中部，以使兩側(cè)區(qū)域可同時(shí)進(jìn)行鏡像實(shí)驗(yàn)(圖2，3)；將觀察缸中鏡子兩側(cè)區(qū)域各插入一隔板，將兩只蟹分別放入隔板一側(cè)區(qū)域，使蟹與鏡子之間被隔板隔開，適應(yīng)10min后輕輕地取出隔板，使蟹暴露于鏡子前，拍攝20min后結(jié)束；每組拍攝結(jié)束后，更換觀察缸中的海水并清洗觀察缸。拍攝時(shí)統(tǒng)一在無光的環(huán)境條件下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)期間控制海水溫度和鹽度與暫養(yǎng)條件一致。

31、所述步驟1中，以行為分析軟件記錄并量化蟹的攻擊性行為如下：

32、設(shè)置檢測(cè)的采樣率為8幀/秒，檢測(cè)方法為動(dòng)態(tài)剪影法或灰度梯度法，開啟丟失幀數(shù)校正和平滑軌跡設(shè)置；軌跡平滑配置為：

33、a.基于每個(gè)采樣點(diǎn)前后10個(gè)樣本進(jìn)行平滑處理；

34、b.若移動(dòng)距離小于3cm時(shí)，將采樣點(diǎn)仍舊設(shè)為前一個(gè)位置；

35、c.若移動(dòng)的最大距離大于20cm時(shí)，將采樣點(diǎn)設(shè)為缺失。

36、所述步驟1中，攻擊性評(píng)測(cè)模型為，

37、y＝0.023x1-0.001x2-0.002

38、其中，y為攻擊性得分，x1為相對(duì)移動(dòng)距離，x2為靜止累計(jì)持續(xù)時(shí)間。

39、所述步驟1中，進(jìn)行攻擊性評(píng)測(cè)之后，

40、將蟹進(jìn)行冰凍麻醉5分鐘后，于冰上迅速解剖并取出胸神經(jīng)節(jié)置于2ml凍存管中，立即放入液氮中短暫速凍，隨后放入-80℃冰箱中保存待測(cè)。

41、所述步驟2中，包括采集原始測(cè)序數(shù)據(jù)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析：

42、其中，采集原始測(cè)序數(shù)據(jù)包括：

43、1.從步驟1中隨機(jī)選取每種攻擊性表型的蟹不少于2只進(jìn)行混樣，每組至少設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；

44、2.采用trizol法提取總rna，通過1％的瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定rna完整度，用nanodrop?2000核酸蛋白分析儀檢測(cè)總rna的濃度和純度，確保a260/a280在1.8～2.0；

45、3.從樣品中提取1ug總rna后，用帶有oligo的磁珠與mrna3’末端的ploy?a進(jìn)行堿基配對(duì)，純化mrna后加入片段化緩沖液將mrna隨機(jī)斷裂成300bp左右的小片段；

46、4.以mrna為模板反轉(zhuǎn)合成一鏈cdna，隨后合成二鏈。加入末端修復(fù)試劑(endrepair?mix)將其補(bǔ)成平末端，隨后在3’末端加上一個(gè)堿基a，接著對(duì)連接接頭(adapter)后的產(chǎn)物進(jìn)行純化和片段分選，用分選產(chǎn)物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，純化得到最終的文庫；

47、5.構(gòu)建好的文庫用illumina?hiseq?xten/novaseq6000進(jìn)行測(cè)序，得到原始測(cè)序數(shù)據(jù)。

48、轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析包括：

49、1.利用seqprep和sickle軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)(clean?reads)；2.采用hisat2和tophat2軟件將質(zhì)控后的clean?reads與參考基因組比對(duì)，獲得映射數(shù)據(jù)，對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估；

50、3.通過定位到基因組區(qū)域的clean?reads的數(shù)量(read?counts)來計(jì)算基因的表達(dá)水平，采用rsem軟件對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，表達(dá)定量結(jié)果以每千堿基轉(zhuǎn)錄片段數(shù)fpkm為單位；

51、4.采用deseq2軟件對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行差異分析，獲得差異表達(dá)基因，而后篩選顯著差異表達(dá)的基因；篩選標(biāo)準(zhǔn)為：fdr<0.05&|log2fc|≥2，其中fdr為多重假設(shè)檢驗(yàn)矯正后的p值。

52、所述步驟5中，采用表達(dá)量相關(guān)性分析，獲取攻擊性表型調(diào)控的關(guān)鍵基因集包括以下步驟：

53、1.通過r語言對(duì)目標(biāo)基因集進(jìn)行表達(dá)相關(guān)性分析，生成一個(gè)相關(guān)性矩陣，其中矩陣中的每個(gè)元素代表兩個(gè)基因之間的相關(guān)性，構(gòu)建共表達(dá)矩陣；

54、2.對(duì)共表達(dá)矩陣采用斯皮爾曼相關(guān)性分析，對(duì)分析結(jié)果采用benjamini-hochberg進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正，顯著性水平為p<0.05，相關(guān)性的絕對(duì)性閾值為0.8；

55、3.計(jì)算目標(biāo)基因集中每個(gè)基因的連接度，將其絕對(duì)值記為d；連接度是指一個(gè)基因與其他基因的相關(guān)性之和，通過每個(gè)基因的連接度來識(shí)別在網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因；

56、4.計(jì)算所有基因的d均值，計(jì)算公式為：

57、dm＝(d1+d2+…+dq)/q

58、其中，dm為d的均值，d1,…,dq為基因連接度，q為目標(biāo)基因集中具有顯著相關(guān)基因的基因個(gè)數(shù)。

59、5.使用r包(如wgcna、igraph)對(duì)基因共表達(dá)矩陣進(jìn)行可視化；

60、6.以d≥dm作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲取攻擊性表型調(diào)控的關(guān)鍵基因集。

61、所述的基于高通量測(cè)序的蟹類攻擊性基因篩選方法，在蟹類種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育中的應(yīng)用。

62、本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

63、1.首次提出了一種基于高通量測(cè)序的蟹類攻擊性基因篩選方法，通過層級(jí)篩選(圖1)，挖掘與攻擊性相關(guān)的核心基因，定位蟹類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中攻擊性調(diào)控的核心受體蛋白，揭示并驗(yàn)證攻擊性調(diào)控的靶蛋白-配體信號(hào)通路，為分子育種技術(shù)在甲殼動(dòng)物的應(yīng)用提供理論與實(shí)踐支持。

64、2.構(gòu)建了攻擊性表型與核心基因之間的相關(guān)關(guān)系，鑒定與驗(yàn)證了蟹類攻擊性表型判別的分子標(biāo)志物，為今后蟹類種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育提供新思路。