本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及hpcal1蛋白在增強心功能中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：1、心力衰竭是指由于心臟的收縮功能和舒張功能發(fā)生障礙，不能將靜脈回心血量充分排出心臟，導(dǎo)致靜脈系統(tǒng)血液淤積，動脈系統(tǒng)血液灌注不足，從而引起心臟循環(huán)障礙癥候群，此種障礙癥候群集中表現(xiàn)為肺淤血、腔靜脈淤血。心力衰竭并不是一個獨立的疾病，而是心臟疾病發(fā)展的終末階段。幾乎所有的心血管疾病最終都會導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生，心肌梗死、心肌病、血流動力學(xué)負荷過重、炎癥等任何原因引起的心肌損傷，均可造成心肌結(jié)構(gòu)和功能的變化，最后導(dǎo)致心室泵血和(或)充盈功能低下。2、心血管健康影響因素包括吸煙、膳食營養(yǎng)、身體活動、超重和肥胖以及心理因素等。而心血管病的危險因素包括高血壓、血脂異常、糖尿病、慢性腎臟病、代謝綜合癥和空氣污染。其中多種心血管疾病都和心功能衰退有關(guān)，如冠心病，心力衰竭，肺原性心臟病，心房顫動，風(fēng)濕性心臟病，先天性心臟病等。這些相關(guān)疾病的治療都需要用到強心劑，目前市場上的強心劑主要包括強心甙和非強心甙類正性肌力藥兩大類：前者是一種強心性配糖體，臨床上常用的有洋地黃甙，地高辛，去乙酰毛花甙丙和毒毛旋花子甙k等，后者包括β腎上腺素能受體激動劑，如常用的多巴酚丁胺、多巴胺異丁酯、磷酸二酯酶抑制劑如氨吡酮等。近年來人們發(fā)現(xiàn)β3腎上腺素能受體在多種心血管疾病中在心臟部位表達升高，且β3腎上腺素能受體阻斷劑可能在心功能衰退類心血管疾病中有一定作用。因此，針對β3腎上腺素能受體的特異性阻斷劑或拮抗劑的研發(fā)成了近期的心血管疾病治療的新熱點之一。然而化學(xué)小分子藥物一般具有較高的肝腎毒性，其藥毒性不可忽視。技術(shù)實現(xiàn)思路1、本發(fā)明的目的在于hpcal1蛋白或其相關(guān)生物材料在制備強心、治療心力衰竭等心血管疾病的藥物中的用途。2、本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：3、本發(fā)明的第一方面，提供hpcal1蛋白或其相關(guān)生物材料在以下任一項的應(yīng)用；4、(a1)制備β3腎上腺素能受體拮抗劑；5、(a2)非治療目的抑制β3腎上腺素能受體的激活；6、(a3)制備治療心血管疾病的藥物；7、(a4)制備強心劑。8、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的β3腎上腺素能受體拮抗劑能用于制備治療心血管疾病的藥物；優(yōu)選治療心血管疾病的藥物是強心藥物。9、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述心血管疾病包括心功能衰退疾病。10、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述心功能衰退疾病包括心梗、心臟病、心肌缺血再灌注以及心力衰竭中的至少一種。11、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述心臟病包括遺傳性心臟病、藥物引起的心臟病或感染引起的心臟病。12、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述hpcal1蛋白為來源于對蝦、人、小鼠的hpcal1蛋白。13、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述hpcal1蛋白為如下b1-b4任一所示蛋白質(zhì)：14、(b1)氨基酸序列為seq?id?no.1～3任一項的蛋白質(zhì)；15、(b2)將seq?id?no.1～3任一項所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質(zhì)；16、(b3)與(b1)或(b2)中任一所限定的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、95％、90％、85％或者80％同源性且具有相同功能的蛋白質(zhì)；或17、(b4)在(b1)-(b3)中任一所限定的蛋白質(zhì)的n端、c端、氨基酸骨架和/或氨基酸側(cè)鏈基團上進行修飾得到具有相同功能的多肽衍生物。18、優(yōu)選地，將seq?id?no.3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代且具有相同功能的蛋白突變體的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。19、優(yōu)選地，所述(b2)中的添加是在氨基酸序列的n端和/或c端添加一個或幾個氨基酸殘基。20、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述添加還包括在b1～b4任一所限定的蛋白質(zhì)的n端和/或c端連接標(biāo)簽序列。21、優(yōu)選地，所述蛋白還包括在b1～b4任一所限定的蛋白質(zhì)的n端和/或c端連接標(biāo)簽序列后得到的融合蛋白。22、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述標(biāo)簽序列包括信號肽、靶向肽、標(biāo)簽肽、熒光蛋白、穿膜肽中的至少一種。23、本文中的“同源性”是指兩個氨基酸序列之間的相關(guān)性，由參數(shù)“同一性(identity)”來描述；所述至少95％的同源性可為至少96％、97％、98％、99％的同一性。所述至少90％的同源性可為至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述至少85％的同源性可為至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述至少80％的同源性可為至少81％、82％、83％、84％的同一性。并且所述序列基本保留了其所源自的氨基酸序列的至少一種生物學(xué)活性(例如，與人hpcal1蛋白具有同一性的蛋白能結(jié)合β3腎上腺素能受體，并下調(diào)β3腎上腺素能受體激活的能力)。24、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述hpcal1蛋白為：seq?id?no.1～3任一項所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質(zhì)；優(yōu)選地，所述的取代為保守取代。更優(yōu)選地，所述的氨基酸殘基的缺失、插入和/或取代是在seq?id?no.1～3任一項所示的氨基酸序列上進行的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個氨基酸殘基的變化。25、在本發(fā)明的一些實施方式中，(b4)中的所述修飾包含糖基化、磷酸化、n-甲基化、豆蔻?；⒆貦磅；?、生物素化、熒光標(biāo)記、聚乙二醇(peg)修飾、多聚抗原肽(map)、異戊二烯化環(huán)化、乙?；?、酰胺化、脂肪酸、環(huán)化或多肽領(lǐng)域可接受的其他修飾中的一種或多種的組合。26、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述相關(guān)生物材料為下述任一種：27、(c1)編碼所述hpcal1蛋白的核酸分子；28、(c2)含有(c1)所述核酸分子的表達盒；29、(c3)含有(c1)所述核酸分子的重組載體、或含有(c2)所述表達盒的重組載體；30、(c4)含有(c1)所述核酸分子的重組細胞、或含有(c2)所述表達盒的重組細胞、或含有b3)所述重組載體的重組細胞；31、(c5)含有(c1)所述核酸分子的重組組織、或含有(c2)所述表達盒的重組組織、或含有(c3)所述重組載體的重組組織；32、(c6)含有(c1)所述核酸分子的重組器官、或含有(c2)所述表達盒的重組器官、或含有(c3)所述重組載體的重組器官；33、(c7)含有(c1)所述核酸分子的重組微生物、或含有(c2)所述表達盒的重組微生物、或含有(c3)所述重組載體的重組微生物。34、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于：質(zhì)粒、噬菌體、黏粒、ti質(zhì)?；虿《据d體。35、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的表達盒是指能夠在宿主細胞中表達所述基因的dna，該dna不但可包括啟動基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。36、上述生物材料中，所述的重組細胞包括原核細胞或真核細胞。所述細胞不涉及植物或動物新品種。37、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述原核細胞包括大腸桿菌、鏈霉菌、枯草芽孢桿菌等本領(lǐng)域熟知的能夠用于表達目的蛋白的原核細胞。38、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述真核細胞包括酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞和昆蟲細胞中的至少一種。39、所述的重組組織可為重組昆蟲組織和/或重組植物組織和/或重組動物組織。40、所述的重組器官可為重組昆蟲器官和/或重組植物器官和/或重組動物器官。41、本發(fā)明的第二方面，提供一種藥物，其包含本發(fā)明第一方面中的hpcal1蛋白或其或其相關(guān)生物材料。42、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述藥物還包括增強心功能和/或治療心血管疾病的活性成分。43、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述藥物含有有效劑量的hpcal1蛋白或其藥學(xué)上可接受的鹽。44、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述藥物還包括藥學(xué)上可接受的輔料。45、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述藥學(xué)上可接受的輔料包括：稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、潤滑劑、崩解劑、溶劑、乳化劑、助溶劑、防腐劑、ph調(diào)節(jié)劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、包衣材料、抗氧劑或緩沖劑中的至少一種。46、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述藥物的劑型包括注射劑、氣霧劑或滴劑中的至少一種。47、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述藥物的給藥途徑包括靜脈注射、靜脈滴注、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔給藥或霧化給藥中的至少一種。48、本發(fā)明的第三方面，提供一種預(yù)防或治療心血管疾病的方法，包括向所需要的對象給予有效量的hpcal1蛋白或其藥學(xué)上可接受的鹽，或者給予包含前述hpcal1蛋白以及藥學(xué)上可接受輔料的藥物組合物。49、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述心血管疾病包括心功能衰退疾病。優(yōu)選地，所述心功能衰退疾病包括心梗、心臟病、心力衰竭或心肌缺血再灌注中的至少一種。50、在本發(fā)明的一些實施方式中，，所述心臟病包括遺傳性心臟病、藥物引起的心臟病或感染引起的心臟病。51、在本發(fā)明的一些實施方式中，，所述藥物中的hpcal1蛋白或其藥學(xué)上可接受的鹽可以通過各種方式與其他可用于預(yù)防和/或治療心血管疾病的成分進行組合。優(yōu)選地，所述hpcal1蛋白或其藥學(xué)上可接受的鹽和其他可用于預(yù)防和/或治療心血管疾病的成分可以分別存在于不同藥品中，以組合包裝或聯(lián)合用藥的方式給予。優(yōu)選地，所述hpcal1蛋白或其藥學(xué)上可接受的鹽和其他可用于預(yù)防和/或治療心血管疾病的成分可以共同存在于同一藥品中，以復(fù)方藥物的方式進行給予。52、在本發(fā)明中，hpcal1蛋白或其藥學(xué)上可接受的鹽的每天的合適劑量范圍為0.1μg-1g/kg體重；上述劑量可以一個劑量單位或分成幾個劑量單位給藥，這取決于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗以及包括運用其它治療手段的給藥方案。53、在本發(fā)明中，在對動物用藥時，所述重組hpcal1蛋白或其藥學(xué)上可接受的鹽的每日給藥劑量為0.5μg-1mg/kg小鼠；和/或，給藥次數(shù)為1～3次。54、在本發(fā)明中，所述有效劑量可以根據(jù)實際情況以及臨床醫(yī)師的判斷進行合理的調(diào)整，在對于不同的物種時，可以基于本領(lǐng)域中對于不同物種間的藥物劑量換算公式或比值進行合理的調(diào)整。55、術(shù)語的定義：56、本發(fā)明涉及到的術(shù)語“hpcal1蛋白”是指海馬鈣結(jié)合蛋白樣蛋白1，該蛋白是視網(wǎng)膜和大腦中發(fā)現(xiàn)的recoverin家族的神經(jīng)元特異性鈣結(jié)合成員。hpcal1在人體中的功能機制已經(jīng)有了初步的研究，其參與視紫紅質(zhì)磷酸化的鈣依賴性調(diào)節(jié)，也可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元信號有關(guān)。尤其是與癌癥等相關(guān)疾病的機制探索，它被證明對肝癌的發(fā)展有明顯的抑制作用，對膠質(zhì)母細胞瘤有促進增殖的效果。57、術(shù)語“β3腎上腺素能受體”是介導(dǎo)兒茶酚胺作用的一種組織受體，為g-蛋白耦聯(lián)型。β3腎上腺素能受體主要分布在肌肉細胞上，并在心肌受損后表達上調(diào)，β3受體激動后可產(chǎn)生負性肌力作用。β3受體通過抑制性g蛋白引起負性變力效應(yīng)，也可能是通過一氧化氮途徑介導(dǎo)。58、術(shù)語“β3腎上腺素能受體拮抗劑”是指能與β3腎上腺素能受體結(jié)合的分子，且阻斷該受體激動劑如腎上腺素及章魚胺介導(dǎo)的作用。術(shù)語“章魚胺受體”是指g蛋白偶聯(lián)受體超家族在無脊椎動物中的特有蛋白質(zhì)受體。59、術(shù)語“心功能衰退疾病”是指心臟無法滿足身體對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的需求,導(dǎo)致身體功能受損的一類疾病，晚期的心功能衰退也稱為心力衰竭，心功能衰退疾病包括心梗、遺傳性心臟病、藥物引起的心臟病、感染引起的心臟病、心肌缺血再灌注以及心力衰竭等。60、術(shù)語“同一性”用于指兩個多肽之間或兩個核酸之間序列的匹配情況。當(dāng)兩個進行比較的序列中的某個位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)時(例如，兩個dna分子的每一個中的某個位置都被腺嘌呤占據(jù)，或兩個多肽的每一個中的某個位置都被賴氨酸占據(jù))，那么各分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分數(shù)同一性”是由這兩個序列共有的匹配位置數(shù)目除以進行比較的位置數(shù)目×100的函數(shù)。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(總共6個位置中有3個位置匹配)。通常，在將兩個序列比對以產(chǎn)生最大同一性時進行比較。這樣的比對可通過使用，例如，可通過計算機程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地進行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法來實現(xiàn)。還可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.appl?biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120權(quán)重殘基表(weight?residue?table)、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來測定兩個氨基酸序列之間的百分數(shù)同一性。此外，可使用已整合入gcg軟件包(可在www.gcg.com上獲得)的gap程序中的needleman和wunsch(j?moi?biol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩陣或pam250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4的缺口權(quán)重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重來測定兩個氨基酸序列之間的百分數(shù)同一性。61、術(shù)語“保守取代”指不會不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白/多肽的預(yù)期性質(zhì)的氨基酸取代。例如，可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如定點誘變和pcr介導(dǎo)的誘變引入保守取代。保守氨基酸取代包括用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的取代，例如用在物理學(xué)上或功能上與相應(yīng)的氨基酸殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學(xué)性質(zhì)，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)的殘基進行的取代。已在本領(lǐng)域內(nèi)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，優(yōu)選用來自相同側(cè)鏈家族的另一個氨基酸殘基替代相應(yīng)的氨基酸殘基。鑒定氨基酸保守取代的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。62、本發(fā)明具有下述至少一種有益效果：63、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了hpcal1蛋白能夠與β3腎上腺素能受體結(jié)合，起到β3腎上腺素能受體拮抗劑的功能；并進一步發(fā)現(xiàn)hpcal1蛋白具有治療心功能衰退的效果，可以用于制備強心的藥物，或者制備治療心功能衰退的藥物，尤其是制備由于缺血導(dǎo)致的心功能衰退的藥物。64、本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)將蛋白hpcal1注射到對蝦體內(nèi)可以抑制血細胞轉(zhuǎn)錄因子stat磷酸化水平；該蛋白與對蝦章魚胺受體結(jié)合，阻斷對蝦血清中章魚胺的作用；還發(fā)現(xiàn)了人源hpcal1蛋白可以在293t細胞中有效阻斷腎上腺素和章魚胺對過表達的β3-腎上腺素能受體的激活，且蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用體外分析實驗進一步證明了人源hpcal1蛋白可以和重組人源β3-腎上腺素能受體特異性結(jié)合；在動物實驗中發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注小鼠模型中靜脈注射一定濃度的重組小鼠hpcal1可以有效改善小鼠心臟功能，增強其射血分數(shù)。65、本發(fā)明的實驗顯示蛋白hpcal1可以用于增強心功能，具有用于制備治療心功能衰退類心血管疾病的潛在藥用價值。而且hpcal1蛋白是一類生物大分子，毒性低，解決了化學(xué)小分子藥物肝腎毒性高的問題；具有較高的應(yīng)用價值。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12