本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及pus1在提高恩扎盧胺對前列腺癌治療敏感性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤，發(fā)病率在西方國家中排名第一，致死率位居第二。盡管我國前列腺癌的發(fā)病率相對較低，但近年來由于環(huán)境和生活方式的改變，發(fā)病率呈現(xiàn)快速增長的趨勢，對男性健康構(gòu)成威脅。前列腺癌早中期主要通過手術(shù)和放療治療，但多數(shù)患者在首診時即為晚期，主要依靠內(nèi)分泌治療。恩扎盧胺是美國fda于2012年批準(zhǔn)的第二代非甾體類雄激素受體拮抗劑(androgen?recept?or?signaling?inhibitor，arsi)，用于治療去勢抵抗性前列腺癌(metastatic?castration?resistant?prostate?cancer，crpc)。然而，腫瘤細胞對藥物的耐藥性成為治療的主要障礙。國外已有恩扎盧胺耐藥的報道，由于多數(shù)患者年齡較大無法耐受化療，面臨無藥可用的局面。

2、恩扎盧胺耐藥的機制主要包括以下幾方面：(1)ar基因突變：長期arsi治療患者會出現(xiàn)ar蛋白配體結(jié)合域lbd區(qū)f876l突變，導(dǎo)致恩扎盧胺由拮抗劑變?yōu)榧觿?，使前列腺癌產(chǎn)生耐藥性；(2)ar剪接變異體(arvs)形成：ar-v7表達陽性前列腺癌對阿比特龍和恩扎盧胺均無反應(yīng)；(3)神經(jīng)內(nèi)分泌化：約30-40％的mcrpc患者在內(nèi)分泌治療后出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌表型，對arsi治療產(chǎn)生抵抗；(4)其他信號通路激活：糖皮質(zhì)激素受體表達增加可以繞過ar信號通路促進前列腺癌進展?，F(xiàn)有技術(shù)中揭示了非突變表觀遺傳重編程在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，并將其納入新型腫瘤表型標(biāo)志。本研究首次解釋了假尿嘧啶(pseudouridine，ψ)修飾在前列腺癌表觀遺傳調(diào)控中的重要作用，并進行了深入探討。

3、ψ是尿苷的c5-糖苷異構(gòu)體，是rna中最早發(fā)現(xiàn)且最豐富的修飾核苷，被稱為rna中的“第五核苷”。ψ最初在非編碼rna如rrna、trna和snrna中發(fā)現(xiàn)，隨著檢測方法和技術(shù)的進步，幾乎在所有類型的rna，包括mrna中都發(fā)現(xiàn)了ψ修飾位點。在真核生物中，ψ主要通過兩種機制修飾，一種是rna非依賴性機制，假尿苷合酶直接識別和催化底物；另一種是rna依賴性機制，假尿苷合酶需要依靠向?qū)na和h/aca核糖核蛋白復(fù)合體催化，該修飾機制主要發(fā)生在結(jié)構(gòu)性非編碼rna中。ψ結(jié)構(gòu)中，由于核糖和堿基之間的典型n-c鍵被c-c鍵取代，產(chǎn)生額外的氫鍵供體，使rna在空間構(gòu)象上更穩(wěn)定。此外，ψ參與trna密碼子-反密碼子堿基配對、rrna折疊、snrnp生物發(fā)生、pre-mrna剪接、mrna編碼等調(diào)控過程。1983年，salvatore等人指出，血清中的ψ可作為腫瘤標(biāo)志物。dck1是最早被發(fā)現(xiàn)具有促癌作用的ψ修飾酶，其通過結(jié)合并催化核糖體蛋白rps3?mrna，增加其穩(wěn)定性，促進結(jié)直腸癌(colorectalcarcinoma，crc)的生長，并直接激活hif-1α轉(zhuǎn)錄增強crc的血管生成和細胞轉(zhuǎn)移。此外，pus7的ψ修飾活性也被證明與多種腫瘤的進展密切相關(guān)。shi等人通過小rnaψ-seq檢測發(fā)現(xiàn)，pus7靶向修飾的trna對于腦膠質(zhì)瘤干細胞關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的密碼子特異性翻譯控制至關(guān)重要，選擇性抑制pus7酶活性后可以顯著抑制腦膠質(zhì)瘤的生長。由于接受恩扎盧胺治療的晚期前列腺癌患者逐漸增多，耐藥問題不可忽視。因此，深入探討前列腺癌恩扎盧胺耐藥的分子機制，為藥物治療提供新思路和分子靶標(biāo)具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中前列腺癌在接受恩扎盧胺治療過程易產(chǎn)生耐藥性的問題，從而對其耐藥機制進行了深入研究，明確了pus1是與前列腺癌恩扎盧胺耐藥性相關(guān)的重要靶點，通過抑制pus1的表達或?qū)us1進行特定位點的突變，可以有效降低前列腺癌對恩扎盧胺耐藥性的產(chǎn)生，提高恩扎盧胺的治療活性。同時可以通過檢測患者體內(nèi)pus1表達和/或突變情況，對其接受恩扎盧胺的治療預(yù)后作合理評估，為前列腺癌的治療提供新的策略。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的。

3、本發(fā)明第一方面提供了pus1突變體在制備提高恩扎盧胺對前列腺癌治療敏感性的藥物中的應(yīng)用；所述pus1突變體的突變位點選自r116、d118、r171、y173、r267中的一種或多種。

4、作為優(yōu)選地，所述pus1突變體的突變位點為r116、d118、r171、y173、r267。

5、作為優(yōu)選地，所述pus1突變體的序列如seq?id?no：1所示。

6、作為優(yōu)選地，所述前列腺癌選自去勢抵抗性前列腺癌。

7、本發(fā)明第二方面提供了pus1抑制劑在制備提高恩扎盧胺對前列腺癌治療敏感性的藥物中的應(yīng)用。

8、作為優(yōu)選地，所述pus1抑制劑選自基于pus1基因設(shè)計的sirna、shrna、sgrna中的一種或多種。

9、作為優(yōu)選地，所述pus1抑制劑選自基于pus1基因設(shè)計的sirna、shrna中的一種或多種。

10、作為優(yōu)選地，所述基于pus1基因設(shè)計的sirna的序列選自seq?id?no：2(5’-gctgattgacgacattctatt-3’)、seq?id?no：3(5’-ggccattgtgaagggttattt-3’)中的一種或多種；基于pus1基因設(shè)計的shrna的序列選自seq?id?no：4(5’-ccgggagcttcatgatgcatc?agatctcgagatctgatgcatcatgaagctctttttg-3’)、seq?id?no：5(5’-ccggtgtcgggtcctcacaattcaactcgagttgaattgtgaggacccgacatttttg-3’)中的一種或多種。

11、作為優(yōu)選地，所述前列腺癌選自去勢抵抗性前列腺癌。

12、本發(fā)明第三方面提供了檢測pus1表達水平的試劑在制備用于評估恩扎盧胺對前列腺癌治療敏感性的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

13、作為優(yōu)選地，所述檢測pus1表達水平的試劑包括檢測pus1基因表達水平的引物和/或檢測pus1蛋白含量的試劑。

14、作為優(yōu)選地，所述檢測pus1基因表達水平的引物選自下列引物對，所述引物對上游序列如seq?id?no：6(5’-gggcgggtttaactcca?aga-3’)所示，下游序列如seq?id?no：7(5’-attgtggaagttgtgc?gtgc-3’)所示。

15、作為優(yōu)選地，所述檢測pus1蛋白含量的試劑選自anti-pus1抗體(ab203010，abcam)。

16、作為優(yōu)選地，所述前列腺癌選自去勢抵抗性前列腺癌。

17、本發(fā)明第四方面提供了一種用于治療前列腺癌的藥物組合物，包括恩扎盧胺，以及恩扎盧胺活性劑；所述恩扎盧胺活性劑選自pus1突變體、pus1抑制劑中的一種或多種；所述pus1突變體的突變位點選自r116、d118、r171、y173、r267中的一種或多種。

18、作為優(yōu)選地，所述pus1突變體的突變位點為r116、d118、r171、y173、r267。

19、作為優(yōu)選地，所述pus1突變體的序列如seq?id?no：1所示。

20、所述pus1抑制劑選自基于pus1基因設(shè)計的sirna、shrna、sgr?na中的一種或多種。

21、作為優(yōu)選地，所述pus1抑制劑選自基于pus1基因設(shè)計的sirna、shrna中的一種或多種。

22、作為優(yōu)選地，所述基于pus1基因設(shè)計的sirna的序列選自seq?id?no：2、seq?idno：3中的一種或多種；基于pus1基因設(shè)計的shrna的序列選自seq?id?no：4、seq?id?no：5中的一種或多種。

23、作為優(yōu)選地，所述前列腺癌選自去勢抵抗性前列腺癌。

24、作為優(yōu)選地，所述藥物組合物中任選地可包含藥學(xué)上可接受的載體。

25、作為優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的載體包括填充劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、矯味劑、防腐劑、抗氧劑、著色劑中的一種或多種。

26、應(yīng)理解的是，在沒有特別說明的情況下，在本發(fā)明上下文中，所述pus1抑制劑是指能夠特異性下調(diào)pus1表達水平和/或其成熟mrna的轉(zhuǎn)錄水平和/或pus1蛋白表達水平或活性的物質(zhì)，例如采用反義寡核苷酸、sirna、shrna、sgrna、antagomirs、mirna海綿、mirnaerasers、target?masking和/或多靶點等方法以下調(diào)pus1表達水平和/活性，只要是能夠?qū)崿F(xiàn)pus1的水平和/或活性降低均可。所述引物和/或引物對是指用于在pcr中合成pus1基因cdna鏈的pcr引物，從而用于檢測pus1基因mrna的表達水平。除本發(fā)明所列出的引物和/或引物對外，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全有能力根據(jù)pus1的基因序列采用包括但不限于分子生物學(xué)等本領(lǐng)域的常規(guī)方法手段進行相應(yīng)引物、引物對、抗體的設(shè)計，并通過常規(guī)實驗手段對所設(shè)計的引物和/或引物對進行篩選，亦或是市售獲得，只要能夠?qū)崿F(xiàn)特異性檢測pus1表達水平即可；亦可以采用本領(lǐng)域的其他常規(guī)試劑和方法對pus1蛋白表達水平進行檢測。

27、本發(fā)明通過大量研究發(fā)現(xiàn)，pus1表達與前列腺癌gleason評分呈正相關(guān)；且在mcrpc中表達更高。km曲線分析顯示高表達pus1患者的arsi治療相關(guān)總生存期顯著縮短。此外，在lncap和c4-2b的非耐藥及耐藥細胞系中檢測發(fā)現(xiàn)，pus1在耐藥細胞系中表達較高。臨床樣本及pdx模型免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，相比于雄激素依賴性前列腺癌，pus1在crpc樣本中呈高表達，且在恩扎盧胺耐藥組織中表達更高。以上結(jié)果表明pus1表達與前列腺癌惡性程度及不良預(yù)后相關(guān)。體內(nèi)和體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，在c4-2b_enzr及l(fā)ncap_eznr細胞系中敲低pus1表達，cck-8及平板克隆驗證發(fā)現(xiàn)兩者對恩扎盧胺的抵抗性顯著下降。皮下移植瘤模型結(jié)果顯示：在恩扎盧胺處理組中，敲低pus1的表達后，皮下瘤生長顯著變慢，瘤體終重量更小。以上結(jié)果表明，pus1是介導(dǎo)前列腺癌恩扎盧胺耐藥的重要分子。

28、由于pus1與腫瘤的相關(guān)研究較少，最新研究揭示pus1的ψ修飾活性與多種原癌基因(irs1、myc等)的翻譯效率有關(guān)，但具體機制未詳。既往研究發(fā)現(xiàn)pus1與pre-mrna的3′端可變剪切有關(guān)，通過體外驗證發(fā)現(xiàn)pum2等基因的外顯子或側(cè)翼內(nèi)含子中具有明顯的ψ修飾位點，敲除pus1的細胞中出現(xiàn)明顯剪接差異。此外，還有研究顯示pus1可通過修飾靶mrna的終止子，造成基因通讀效應(yīng)，改變蛋白全長氨基酸序列。為了明確pus1是否通過ψ活性調(diào)控前列腺癌恩扎盧胺耐藥，針對這5個位點進行突變(r116l、d118k、r171t、y173e、r267l)，構(gòu)建了過表達質(zhì)粒。cck-8及平板克隆檢測發(fā)現(xiàn)，過表達突變型pus1_mut細胞有助于降低前列腺癌細胞對恩扎盧胺的耐藥性，表明pus1促進前列腺癌恩扎盧胺耐藥依賴其ψ修飾活性。

29、總的來說，本發(fā)明通過生物信息學(xué)分析及一系列體內(nèi)外實驗，首次發(fā)現(xiàn)并明確了pus1表達水平對于恩扎盧胺治療前列腺癌中敏感性降低中的關(guān)鍵作用，并深入研究了其作用機制，即pus1促進前列腺癌恩扎盧胺耐藥依賴其ψ修飾活性。本發(fā)明豐富了恩扎盧胺治療前列腺癌過程中耐藥性產(chǎn)生以及調(diào)控的相關(guān)機制，對于探尋新的前列腺癌癌診斷、預(yù)后判定及治療分子靶標(biāo)、開發(fā)新的靶向藥物提供了充分的科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，具有重要的社會價值和科學(xué)意義。