本發(fā)明涉及氮氧同位素溯源，特別是涉及一種地表水硝態(tài)氮微生物指紋溯源方法。

背景技術(shù)：

1、氮化合物過量的進(jìn)入環(huán)境水生生態(tài)系統(tǒng)中，流域內(nèi)地表水的硝態(tài)氮濃度可能會快速升高，從而對地表水產(chǎn)生硝酸鹽污染。它會導(dǎo)致有毒藻類的迅速增加，稱為藻華(或赤潮)，這會耗盡水中的氧氣，并可能造成影響水下生物的死亡區(qū)域，開展氮污染來源解析工作為重中之重。

2、地表水氮的來源很多，其中最受關(guān)注的是硝酸鹽污染的溯源，由于不同硝酸鹽來源的氮同位素比值有重疊現(xiàn)象，近年來人們開始采用氮氧雙同位素方法和端元混合模型，以更準(zhǔn)確地判斷硝酸鹽的來源并研究其生物地球化學(xué)過程，隨著科技發(fā)展和精準(zhǔn)治污提出，定性分析水體中氮的來源已經(jīng)不能滿足環(huán)境管理的需求，學(xué)者選擇利用同位素技術(shù)結(jié)合模型定量技術(shù)獲得各類污染源的貢獻(xiàn)率，常用的有isosource，siar(穩(wěn)定同位素源解析模型)等。但其適合應(yīng)用于大尺度流域，溯源精度相對較小。

3、污染源具有獨(dú)特的生物條形碼特征，目前使用較多的sourcetracker微生物來源分析河流污染物的來源、周圍工廠、農(nóng)田、養(yǎng)殖廠對河流污染的貢獻(xiàn)。利用微生物條形碼不能將生物特征與氮污染來源進(jìn)行耦合分析，且污染源水體輸入地表水后微生物特征發(fā)生生物地球化學(xué)過程，因此需要篩選出可以指示不同氮污染源的地表水指示微生物指紋圖譜，為地表水硝態(tài)氮污染溯源提供新的方法與思路。

4、現(xiàn)有技術(shù)氮氧同位素溯源技術(shù)測定繁瑣、溯源精度小，面對小流域或平原河網(wǎng)地區(qū)時(shí)甚至無法區(qū)分來源；微生物指紋溯源僅能表示污染源與監(jiān)測地表水樣本之間微生物之間的關(guān)系，未與氮污染相關(guān)聯(lián)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種地表水硝態(tài)氮微生物指紋溯源方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、一種地表水硝態(tài)氮微生物指紋溯源方法，包括：

4、對目標(biāo)流域的地表水樣品進(jìn)行樣品收集，得到水體樣品；

5、測定所述水體樣品的氮同位素比值和氧同位素比值；

6、測序所述水體樣品的微生物條形碼；

7、基于所述氮同位素比值和所述氧同位素比值，采用貝葉斯同位素混合模型計(jì)算出不同氮污染來源組的貢獻(xiàn)率，并將不同氮污染來源的貢獻(xiàn)率進(jìn)行分組；

8、通過r語言運(yùn)算indicspecies程序包計(jì)算各組不同的指示物種指數(shù)，以篩選出指示物種，并根據(jù)所述微生物條形碼構(gòu)建氮污染來源微生物圖譜；

9、根據(jù)所述氮污染來源微生物圖譜獲得指示地表水中氮污染來源的微生物。

10、優(yōu)選地，測定所述水體樣品的氮同位素比值和氧同位素比值，包括：

11、取20ml所述水體樣品于40ml頂空瓶中，加入0.1mlcdcl2溶液，然后加入0.8mlnh4cl溶液，最后加入3×10cm?4n潔凈鋅片，在搖床上以220r/min轉(zhuǎn)速振蕩15min；

12、取出鋅片，密閉頂空瓶，完成no2-還原步驟；

13、向經(jīng)no2-還原后的頂空瓶中加入1ml的nan3溶液和ch3cooh的1:1混合液，劇烈震蕩使樣品和試劑混勻。之后以220r/min轉(zhuǎn)速振蕩30min，最后加入0.6ml的naoh溶液作為終止劑，結(jié)束疊氮化反應(yīng)；

14、用gas-bench-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀聯(lián)機(jī)測試n2o氣體的氮同位素比值和氧同位素比值。

15、優(yōu)選地，測序所述水體樣品的微生物條形碼，包括：

16、采用ctab/sds方法提取水體樣品中的總基因組dna；

17、不同區(qū)域的16s?rrna/18srrna/its基因用特定引物和條形碼擴(kuò)增；

18、將等體積的1x加載緩沖液與pcr產(chǎn)物混合，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，進(jìn)行dna檢測；

19、用ultratmiidna文庫制備試劑盒生成測序文庫；

20、根據(jù)條形碼將成對的讀數(shù)分配給水體樣品，并通過切斷條形碼和引物序列來截?cái)嗲袛鄺l形碼和引物序列；

21、使用fastp軟件對原始標(biāo)簽進(jìn)行質(zhì)量過濾，以獲得高質(zhì)量的清潔標(biāo)簽；

22、使用vsearch將清潔標(biāo)簽與參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。以檢測嵌合體序列，并將嵌合體序列去除，得到有效標(biāo)簽；

23、對于獲得的有效標(biāo)簽，用qiime2軟件中的dada2或deblur模塊進(jìn)行去噪處理；

24、使用qiime2軟件進(jìn)行物種注釋和多序列比對；。

25、數(shù)據(jù)歸一化

26、擴(kuò)增子序列變異的絕對豐度用序列號的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化處理，以序列號為標(biāo)準(zhǔn)，對應(yīng)于序列最少的樣品。

27、優(yōu)選地，基于所述氮同位素比值和所述氧同位素比值，采用貝葉斯同位素混合模型計(jì)算出不同氮污染來源組的貢獻(xiàn)率，并將不同氮污染來源的貢獻(xiàn)率進(jìn)行分組，包括：

28、用δ表示硝酸鹽的δ15n-no3-和δ18o-no3-同位素，并按下列公式計(jì)算：

29、δ(‰)＝(r樣品/r標(biāo)準(zhǔn)-1)×1000；

30、其中，r樣品和r標(biāo)準(zhǔn)分別表示樣品/標(biāo)準(zhǔn)樣品的n/n或o/o比值，即δ1514181615n-no3-和δ18o-no3-；n同位素以大氣氮(n2)為參考標(biāo)準(zhǔn)；o同位素采用維也納標(biāo)準(zhǔn)平均海水；

31、通過r語言運(yùn)算貝葉斯同位素混合模型，量化潛在no3--n源對地表水的比例貢獻(xiàn)；

32、按照比例貢獻(xiàn)最大值分為多組。

33、優(yōu)選地，貝葉斯同位素混合模型的公式為：其中，xij表示混合物i的同位素j的值，其中i＝1,2,3…n和j＝1,2,3…j；pk表示源k的貢獻(xiàn)比例，由siar模型計(jì)算得到；sjk表示源k中同位素j的值，k＝1,2,3，…，k，符合平均值為μjk；標(biāo)準(zhǔn)偏差為的正態(tài)分布；cjk表示源k上同位素j的分餾因子，其正態(tài)分布為平均值λjk和標(biāo)準(zhǔn)偏差τjk；εjk代表剩余誤差，是單個(gè)混合物之間未能確定的變量，服從平均值為0、標(biāo)準(zhǔn)偏差為σj的正態(tài)分布。

34、優(yōu)選地，indicspecies程序包具有兩個(gè)值提及的特征，包括通過自助法獲得指示值的置信區(qū)間和通過不斷嘗試所有分類組組合情況依次選擇合適的指示物種。

35、優(yōu)選地，所述目標(biāo)流域包括江、河、湖和海。

36、優(yōu)選地，按照比例貢獻(xiàn)最大值分為的多組具體包括：肥料來源組、土壤氮來源組和生活污水及糞便來源組。

37、根據(jù)本發(fā)明提供的具體實(shí)施例，本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

38、本發(fā)明提供了一種地表水硝態(tài)氮微生物指紋溯源方法，包括：對目標(biāo)流域的地表水樣品進(jìn)行樣品收集，得到水體樣品；測定所述水體樣品的氮同位素比值和氧同位素比值；測序所述水體樣品的微生物條形碼；基于所述氮同位素比值和所述氧同位素比值，采用貝葉斯同位素混合模型計(jì)算出不同氮污染來源組的貢獻(xiàn)率，并將不同氮污染來源的貢獻(xiàn)率進(jìn)行分組；通過r語言運(yùn)算indicspecies程序包計(jì)算各組不同的指示物種指數(shù)，以篩選出指示物種，并根據(jù)所述微生物條形碼構(gòu)建氮污染來源微生物圖譜；根據(jù)所述氮污染來源微生物圖譜獲得指示地表水中氮污染來源的微生物。本發(fā)明在提高溯源的精度同時(shí)，能夠降低成本。