本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物，具體涉及一種具有免疫抑制功能的毛棉杜鵑提取物及其制備方法及應用。

背景技術：

1、自身免疫性疾病是一種慢性疾病，包括類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，全球患病人群約占總人口數(shù)的9.4％?；颊咄ǔ霈F(xiàn)異常的免疫反應和炎癥，表現(xiàn)為免疫細胞群紊亂、免疫細胞活化、炎癥介質上調和組織損傷。由于發(fā)病根源尚不清楚，多數(shù)患者無法得到徹底治愈。目前臨床上使用的免疫抑制劑主要包括五大類：細胞因子抑制劑，如環(huán)孢菌素a(cyclosporin?a,csa)、他克莫司(fk506)和雷帕霉素；dna合成抑制劑，如霉酚酸酯；腎上腺皮質激素類，如潑尼松；抗淋巴細胞抗體，如抗淋巴細胞球蛋白；和其它免疫抑制劑，如sotrastaurin(aeb071)、fingolimod(fty720)、環(huán)磷酰胺等。其中，大多數(shù)的免疫抑制劑是基于t細胞相關的免疫反應信號通路發(fā)揮作用的。例如：csa和fk506進入人體后分別與親環(huán)素和fk506結合蛋白12(fkbp12)形成復合物，這兩種復合物均可抑制細胞內鈣調神經(jīng)磷酸酶，干擾t細胞核因子通路，從而抑制t細胞的活化。而雷帕霉素在細胞中與fkbp12形成的復合物是通過抑制mtor的磷酸化從而阻斷增殖信號的傳遞。托法替尼可通過抑制jak3的磷酸化，進而發(fā)揮免疫抑制作用。

2、毛棉杜鵑(rhododendron?radendum?fang)為杜鵑花科(ericaceae)杜鵑花屬(rhododendron)植物，常綠小灌木，多生于海拔3000米-4100米的山地灌叢中或華山松、高山櫟林下。主要分布于中國四川西部和西南部。該物種因花朵美麗，具有較高的園藝觀賞價值。毛棉杜鵑根、葉、花和果實均可入藥，具有收斂止血、消腫止痛、活血化瘀、祛風除濕、淡斑美白等功效，主用于治療跌打損傷所致外傷出血、淤血腫痛，風濕痹癥所致骨痛、關節(jié)疼痛、肢體麻木以及氣血不足引起的面色無華、黯淡無光等。然而，前對毛棉杜鵑的活性成分及提取物藥理活性的相關報道較少，僅有一篇文獻對毛棉杜鵑的花色素提取液進行了初步鑒定和含量測定。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對毛棉杜鵑花活性成分的研究不足，提供一種具有免疫抑制功能的毛棉杜鵑提取物及其制備方法和應用。

2、本發(fā)明的第一個目的是提供具有免疫抑制功能的毛棉杜鵑提取物的制備方法，包括以下步驟：

3、將新鮮毛棉杜鵑花用乙醇或乙醇水溶液浸提，提取液經(jīng)濃縮后得到毛棉杜鵑花提取浸膏，即為毛棉杜鵑提取物。

4、進一步優(yōu)選，是將毛棉杜鵑花提取浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，隨后將萃取液減壓濃縮，得到毛棉杜鵑的四個不同極性部位，分別為：石油醚部位，乙酸乙酯部位，正丁醇部位，水部位，乙酸乙酯部位即為毛棉杜鵑提取物。

5、進一步優(yōu)選，將乙酸乙酯部位用石油醚-乙酸乙酯作為洗脫劑，以體積比20:1，10:1，5:1，3:1，1:1，1:3，0:1進行梯度洗脫，收集流份，流份用tlc薄層層析，以石油醚：乙酸乙酯＝30:1-1:1，v/v作為展開劑，收集石油醚：乙酸乙酯＝2：1，rf＝0.5-0.6，硫酸乙醇顯暗紅色斑點的成分，即為毛棉杜鵑提取物。

6、優(yōu)選，所述的將新鮮毛棉杜鵑花用乙醇或乙醇水溶液浸提，提取液經(jīng)濃縮后得到毛棉杜鵑花提取浸膏是將新鮮毛棉杜鵑花進行冷凍干燥，粉碎，采用95％的乙醇在溫度60℃，料液比1:10g/ml的條件下，進行冷凝回流提取，過濾收集提取液，提取液進行真空、減壓濃縮，得到毛棉杜鵑花提取浸膏。

7、本發(fā)明的第二個目的是提供上述毛棉杜鵑提取物在制備免疫抑制劑中的應用。

8、本發(fā)明的第三個目的是提供一種免疫抑制劑，其包括上述毛棉杜鵑提取物作為活性成分。

9、本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)，毛棉杜鵑粗提物以及所有組分對小鼠正常脾細胞均無明顯細胞毒作用，但對cona誘導的小鼠t淋巴細胞和lps誘導的小鼠b淋巴細胞增殖表現(xiàn)出一定程度抑制作用。根據(jù)免疫抑制活性導向分離策略，成功追蹤到毛棉杜鵑粗提物的強活性流份，eadj-h段，其在終濃度為100μg/ml時對cona誘導的小鼠t淋巴細胞和lps誘導的小鼠b淋巴細胞增殖的抑制率分別為73.87％和56.97％；同時，終濃度為20μm的陽性藥環(huán)孢霉素a(csa)和霉酚酸酯(mmf)對t細胞和b細胞的增值率抑制率分別為91.48％和70.56％。此結果表明：毛棉杜鵑的eadj-h段具有顯著的免疫抑制活性作用。

10、本發(fā)明通過免疫抑制活性導向追蹤分離策略，成功從毛棉杜鵑rhododendronradendum?fang干燥花微粉的95％乙醇提取物中追蹤得到具有顯著免疫抑制活性的流份eadj-h，該部位組合成分顯示出顯著的免疫抑制活性，有望用于免疫抑制劑聯(lián)合應用的研究與開發(fā)，同時也為新型免疫抑制藥物的創(chuàng)制提供了候選活性組分，為開發(fā)利用藥用植物毛棉杜鵑資源的天然活性物質提供了科學依據(jù)。

技術特征：

1.一種具有免疫抑制功能的毛棉杜鵑提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，是將毛棉杜鵑花提取浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，隨后將萃取液減壓濃縮，得到毛棉杜鵑的四個不同極性部位，分別為：石油醚部位，乙酸乙酯部位，正丁醇部位，水部位，乙酸乙酯部位即為毛棉杜鵑提取物。

3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于，將乙酸乙酯部位用石油醚-乙酸乙酯作為洗脫劑，以體積比20:1，10:1，5:1，3:1，1:1，1:3，0:1進行梯度洗脫，收集流份，流份用tlc薄層層析，以石油醚：乙酸乙酯＝30:1-1:1，v/v作為展開劑，收集石油醚：乙酸乙酯＝2：1，rf＝0.5-0.6，硫酸乙醇顯暗紅色斑點的成分，即為毛棉杜鵑提取物。

4.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的將新鮮毛棉杜鵑花用乙醇或乙醇水溶液浸提，提取液經(jīng)濃縮后得到毛棉杜鵑花提取浸膏是將新鮮毛棉杜鵑花進行冷凍干燥，粉碎，采用95％的乙醇在溫度60℃，料液比1:10g/ml的條件下，進行冷凝回流提取，過濾收集提取液，提取液進行真空、減壓濃縮，得到毛棉杜鵑花提取浸膏。

5.一種按照權利要求1、2、3或4所述的制備方法得到的毛棉杜鵑提取物。

6.權利要求5所述的毛棉杜鵑提取物在制備免疫抑制劑中的應用。

7.一種免疫抑制劑，其特征在于，包括權利要求5所述的毛棉杜鵑提取物作為活性成分。

技術總結
本發(fā)明公開了一種具有免疫抑制活性的毛棉杜鵑花提取物及其制備方法和應用。以毛棉杜鵑花的干燥花朵微粉為原料，濃度為95％的乙醇作為提取劑在溫度60℃，料液比1:10的條件下，進行冷凝回流提取2h，過濾收集提取液，合并上述提取液進行真空、減壓濃縮，得毛棉杜鵑花提取浸膏，該浸膏在濃度為100mg/mL時對刀豆蛋白誘導的T淋巴細胞增殖和脂多糖誘導的B淋巴細胞增殖抑制率分別為61.41％和51.54％，且對正常小鼠的脾淋巴細胞無細胞毒性。本發(fā)明為研究與開發(fā)新型的免疫抑制劑提供了候選研究材料，同時也為開發(fā)利用毛棉杜鵑資源提供了科學依據(jù)。

技術研發(fā)人員：易禮江,吳林芳,賴佳瀠,榮道軍,段芳芳,羅勇志,譚海波
受保護的技術使用者：廣東省沙頭角林場（廣東梧桐山國家森林公園管理處）
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/6