本發(fā)明涉及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)輔助ad分析分類的方法。

背景技術(shù)：

1、目前用于阿爾茨海默癥(ad)分析分類的方法在不斷發(fā)展，旨在通過不同的數(shù)據(jù)源和分析技術(shù)提高疾病的早期診斷和分類準(zhǔn)確性。然而，現(xiàn)有的方法，如中國發(fā)明專利cn118196538a所述的基于多示例學(xué)習(xí)和多尺度特征融合的ad分類方法，盡管在一定程度上提高了分類的準(zhǔn)確性和泛化能力，但仍存在一些顯著的不足。

2、首先，中國專利cn118196538a主要基于結(jié)構(gòu)磁共振成像(smri)數(shù)據(jù)，這種影像學(xué)方法在ad分類中的應(yīng)用雖然成熟，但存在一些固有的局限性。smri提供的主要是腦部結(jié)構(gòu)信息，盡管可以通過斑塊分割和多尺度特征提取來捕捉腦部某些區(qū)域的變化，但smri數(shù)據(jù)無法直接反映分子層面的病理變化。這意味著，smri只能捕捉到相對晚期的腦結(jié)構(gòu)變化，而無法揭示疾病早期的生物學(xué)標(biāo)志物。因此，該方法雖然可以識別出對分類結(jié)果有重大貢獻(xiàn)度的大腦區(qū)域，但這些區(qū)域的變化往往已經(jīng)是病變的結(jié)果，而非病變的起始。因此，這種方法在疾病早期診斷的敏感性上存在不足，無法有效識別出ad發(fā)展的早期分子信號。

3、其次，基于smri的分析方法高度依賴于圖像處理和特征提取技術(shù)，這在處理過程中可能會引入額外的噪聲和誤差。例如，在中國專利cn118196538a的方法中，smri影像需要經(jīng)過多次斑塊分割和特征融合，這些步驟依賴于算法的準(zhǔn)確性以及數(shù)據(jù)的質(zhì)量。在實(shí)際操作中，smri圖像分辨率的限制、圖像采集過程中的變異性、以及患者個體差異，都可能導(dǎo)致特征提取的不準(zhǔn)確性。這種依賴多步驟處理的方法，容易引入累積誤差，從而影響最終的分類結(jié)果。此外，斑塊分割過程中涉及到的大小斑塊模型的選擇和特征融合策略，也存在主觀性和復(fù)雜性，可能導(dǎo)致在不同數(shù)據(jù)集或不同人群中表現(xiàn)不一致，降低了方法的泛化能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)輔助ad分析分類的方法，從而解決背景技術(shù)中所指出的部分弊端和不足。

2、本發(fā)明解決其上述的技術(shù)問題所采用以下的技術(shù)方案：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)輔助ad分析分類的方法，包括：

3、s1、樣本采集與準(zhǔn)備：

4、s1.1、從ad患者和年齡匹配的健康對照中獲取腦組織樣本；使用腦組織生物庫，或通過腦組織捐贈項(xiàng)目獲取樣本；

5、s1.2、使用包括流式細(xì)胞術(shù)，facs的細(xì)胞分離技術(shù)對腦組織進(jìn)行處理，獲得單個細(xì)胞懸液；通過機(jī)械和酶解的方法分離出包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、微膠質(zhì)細(xì)胞的不同類型的腦細(xì)胞；

6、s2、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序：

7、s2.1、采用10xgenomicschromium的高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序平臺對分離出的單細(xì)胞進(jìn)行測序，獲取每個細(xì)胞的基因表達(dá)譜；

8、s2.2、進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量細(xì)胞和低表達(dá)基因；利用cellranger的數(shù)據(jù)分析工具對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，生成基因表達(dá)矩陣；

9、s3、數(shù)據(jù)預(yù)處理：

10、s3.1、對基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，包括使用log2轉(zhuǎn)換和z-score標(biāo)準(zhǔn)化，以消除不同樣本間的技術(shù)偏差；

11、s3.2、使用包括主成分分析pca、t-sne、umap的降維算法對高維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理；

12、s4、特征提取：

13、s4.1、利用包括deseq2、edger的差異表達(dá)分析識別出ad患者和健康對照間顯著差異的基因；

14、s4.2、采用gsea進(jìn)行基因集富集分析和采用包括kegg、go進(jìn)行通路分析，確定與ad相關(guān)的關(guān)鍵基因通路和生物過程；

15、s5、ad的分類與診斷：

16、s5.1、將新樣本的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)輸入訓(xùn)練好的分類模型，進(jìn)行ad分類預(yù)測；

17、s5.2、輸出分類結(jié)果，并結(jié)合患者的臨床數(shù)據(jù)和其他包括aβ和tau蛋白水平的生物標(biāo)志物，提供綜合的輔助診斷建議。

18、進(jìn)一步地，所述數(shù)據(jù)質(zhì)量控制方法包括：

19、s1、低質(zhì)量細(xì)胞的去除：

20、計(jì)算每個細(xì)胞的總umi，uniquemolecularidentifier計(jì)數(shù)u和檢測到的基因數(shù)目g；利用公式：

21、

22、計(jì)算細(xì)胞質(zhì)量評分qc，低于預(yù)設(shè)閾值的細(xì)胞被認(rèn)為是低質(zhì)量細(xì)胞；

23、去除線粒體基因表達(dá)比例mgr過高的細(xì)胞；利用公式：

24、

25、其中，mmito為線粒體基因表達(dá)的總umi數(shù)，mtotal為該細(xì)胞中所有基因表達(dá)的總umi數(shù)；設(shè)定閾值θ，當(dāng)mgr>θ時去除該細(xì)胞；

26、利用包括umi計(jì)數(shù)、基因數(shù)目、線粒體基因比例的細(xì)胞過濾標(biāo)準(zhǔn)去除不符合標(biāo)準(zhǔn)的低質(zhì)量細(xì)胞；綜合評分s計(jì)算公式為：

27、

28、其中，α和β為權(quán)重參數(shù)；低于設(shè)定閾值的細(xì)胞被去除；

29、s2、低表達(dá)基因的去除：

30、計(jì)算每個基因在所有細(xì)胞中的表達(dá)頻率f；利用公式：

31、

32、其中，fg為基因g的表達(dá)頻率，egi為基因g在第i個細(xì)胞中的表達(dá)量，n為總細(xì)胞數(shù)；設(shè)定基因表達(dá)閾值δ，去除在少于百分比δ細(xì)胞中表達(dá)的基因；去除條件為：若fg<δ，則去除基因g。

33、進(jìn)一步地，所述使用cellranger軟件對原始測序數(shù)據(jù)fastq文件進(jìn)行處理，生成基因表達(dá)矩陣；

34、具體步驟如下：

35、s1、讀入原始測序數(shù)據(jù)，進(jìn)行基因序列對齊；cellranger使用拼接對齊方式對齊reads到參考基因組，利用公式：

36、

37、其中，ai為第i個read的對齊評分，si為成功對齊的基因片段數(shù)，ri為總reads數(shù)；

38、s2、然后根據(jù)umi標(biāo)簽去重，生成去冗余的基因表達(dá)計(jì)數(shù)；umi去重公式為：

39、

40、其中，uunique為去冗余后的umi計(jì)數(shù)，m為所有umi標(biāo)簽數(shù)，nj為第j個umi標(biāo)簽的重復(fù)計(jì)數(shù)；

41、s3、生成初始的基因表達(dá)矩陣，記錄每個細(xì)胞中每個基因的表達(dá)水平；

42、表達(dá)矩陣生成公式為：

43、

44、其中，egi為第i個細(xì)胞中第g個基因的表達(dá)量，cgi為第i個細(xì)胞中第g個基因的umi計(jì)數(shù)，utotal為第i個細(xì)胞中的總umi計(jì)數(shù)。

45、進(jìn)一步地，所述消除不同樣本間的技術(shù)偏差采用的方法包括：

46、s1、首先根據(jù)單細(xì)胞數(shù)據(jù)的umi計(jì)數(shù)具有泊松分布的特性，對每個細(xì)胞中的umi計(jì)數(shù)進(jìn)行改進(jìn)的log變換，使用方程式：

47、

48、其中，lgi為第i個細(xì)胞中第g個基因的改進(jìn)log變換后的表達(dá)值，cgi為原始umi計(jì)數(shù)；通過平滑小的umi計(jì)數(shù)值，降低噪聲的影響；

49、s2、然后在進(jìn)行z-score標(biāo)準(zhǔn)化之前，引入權(quán)重因子，所述權(quán)重因子基于每個基因在所有細(xì)胞中的出現(xiàn)頻率，使用方程式：

50、

51、其中，wg為基因g的權(quán)重，fg是基因g在所有細(xì)胞中的出現(xiàn)頻率，k和τ是調(diào)整曲線形狀的參數(shù)；

52、s2.1、使用加權(quán)的z-score標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化：

53、

54、其中，zgi是第i個細(xì)胞中第g個基因的標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)值；μg是所有細(xì)胞中基因g的加權(quán)平均log2表達(dá)值；σg是基于權(quán)重的標(biāo)準(zhǔn)差；n是細(xì)胞的總數(shù)；

55、其中，μg和σg分別是加權(quán)后的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算方法如下：

56、

57、以至通過加權(quán)的標(biāo)準(zhǔn)化基因的表達(dá)頻率來調(diào)整每個基因的貢獻(xiàn)。

58、進(jìn)一步地，所述識別出ad患者和健康對照間顯著差異的基因方法構(gòu)建：

59、s1、使用基于gamma分布調(diào)整的偽計(jì)數(shù)方法；根據(jù)基因表達(dá)的潛在分布特性來調(diào)整每個計(jì)數(shù)，改進(jìn)的偽計(jì)數(shù)公式：

60、

61、其中：γ是gamma函數(shù)，用于生成調(diào)整系數(shù)；λ和k是根據(jù)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的全局特性動態(tài)計(jì)算的形狀和尺度參數(shù)；

62、s2、在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中出于批次效應(yīng)和細(xì)胞大小的差異，采用基于多變量回歸模型的復(fù)合歸一化方法；同時調(diào)整多種源自實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣本處理的偏差；采用復(fù)合歸一化公式：

63、

64、其中：β0,β1,β2是通過回歸分析估計(jì)的系數(shù)，別代表基線校正、細(xì)胞特異性因子和批次效應(yīng)的影響；

65、s3、在使用edger進(jìn)行差異表達(dá)分析時，對分散參數(shù)的估計(jì)通過引入動態(tài)局部回歸技術(shù)來優(yōu)化，動態(tài)局部回歸分散估計(jì)公式：

66、φadjusted＝loess(φg,{xi},{yi},θ)

67、其中：loess表示局部加權(quán)散點(diǎn)平滑函數(shù)；{xi},{yi}分別代表基因表達(dá)量和觀察到的分散度數(shù)據(jù)點(diǎn)；θ是動態(tài)選擇的平滑參數(shù)，根據(jù)數(shù)據(jù)的局部密度和變異性調(diào)整。

68、進(jìn)一步地，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)輔助ad分析分類的模型構(gòu)建，包括以下步驟：

69、s1、選擇包括隨機(jī)森林、支持向量機(jī)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建分類模型；

70、s2、將提取的差異基因表達(dá)數(shù)據(jù)作為特征輸入，進(jìn)行模型訓(xùn)練；使用k折交叉驗(yàn)證來優(yōu)化模型參數(shù)；

71、s3、通過獨(dú)立的測試集驗(yàn)證模型性能，評估模型的準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性和穩(wěn)定性；使用指標(biāo)包括auc-roc曲線、混淆矩陣評估模型。

72、進(jìn)一步地，所述模型訓(xùn)練、優(yōu)化模型參數(shù)方法包括：

73、s1、首先通過改進(jìn)的差異表達(dá)分析方法，使用基于負(fù)二項(xiàng)分布的特征選擇，其中顯著性評估公式為：

74、

75、其中，sgi是第g個基因在第i個細(xì)胞中的顯著性評分，cgi是原始計(jì)數(shù)，k和θ是負(fù)二項(xiàng)分布的參數(shù)；

76、s1.1、同時結(jié)合非線性降維技術(shù)包括自編碼器，捕獲基因表達(dá)數(shù)據(jù)中的復(fù)雜模式，自編碼器的損失函數(shù)為：

77、

78、其中，lae是自編碼器的損失函數(shù)，xi是輸入數(shù)據(jù)，fθ是網(wǎng)絡(luò)函數(shù)，θ(t)是時間相關(guān)的正則化參數(shù)，λ是正則化系數(shù)；

79、s2、采用深度學(xué)習(xí)模型，調(diào)整其結(jié)構(gòu)以適應(yīng)包括稀疏性和細(xì)胞間異質(zhì)性的單細(xì)胞數(shù)據(jù)特性，模型優(yōu)化通過dropout技術(shù)實(shí)現(xiàn)，dropout比率由以下函數(shù)控制：

80、

81、其中，d(x)是dropout后的輸出，α和β是控制參數(shù)；

82、s2.1、采用定制損失函數(shù)以解決類別不平衡問題，損失函數(shù)為：

83、

84、其中，lclass是分類損失函數(shù)，wc是類別權(quán)重，yc和分別是真實(shí)和預(yù)測標(biāo)簽，μ是平滑正則化系數(shù)；

85、s3、最后實(shí)施基于聚類的k折驗(yàn)證策略，確保每個折中的代表性和泛化能力，聚類劃分通過以下公式進(jìn)行：

86、

87、其中，k(xi,xj)是樣本i和j之間的相似性評分，γ和η是調(diào)節(jié)參數(shù)；

88、s3.1、同時結(jié)合多個評價指標(biāo)優(yōu)化模型參數(shù)，綜合評估函數(shù)為：

89、

90、其中，q是綜合評估函數(shù)，ωm是第m個評價指標(biāo)的權(quán)重，φm(t)和ψm(t)分別是第m個評價指標(biāo)的時間相關(guān)函數(shù)。

91、本發(fā)明的有益效果：

92、1.精準(zhǔn)度提升：通過結(jié)合多種先進(jìn)的數(shù)據(jù)處理技術(shù)和深度學(xué)習(xí)模型，本發(fā)明能夠在單細(xì)胞層面上識別ad患者與健康對照之間的顯著差異基因，顯著提高了分類模型的準(zhǔn)確性。這使得模型在預(yù)測和診斷ad時能夠更精確地反映疾病的生物學(xué)特征。

93、2.數(shù)據(jù)噪聲的有效控制：本發(fā)明通過改進(jìn)的偽計(jì)數(shù)調(diào)整、復(fù)合歸一化和動態(tài)局部回歸技術(shù)，有效地消除了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的技術(shù)偏差、批次效應(yīng)和細(xì)胞大小差異，降低了數(shù)據(jù)噪聲的影響，從而提高了分析結(jié)果的可靠性。

94、3.泛化能力強(qiáng)：通過基于聚類的k折驗(yàn)證策略，本發(fā)明能夠確保每個折中的樣本具有代表性，從而增強(qiáng)了模型的泛化能力。即使在不同數(shù)據(jù)集或不同樣本類型下，模型仍能保持穩(wěn)定的分類性能。

95、4.適應(yīng)性強(qiáng)的模型結(jié)構(gòu)：通過定制深度學(xué)習(xí)模型的結(jié)構(gòu)和損失函數(shù)，本發(fā)明能夠處理單細(xì)胞數(shù)據(jù)的稀疏性和異質(zhì)性，同時應(yīng)對類別不平衡的問題，確保模型在各種復(fù)雜數(shù)據(jù)環(huán)境中的表現(xiàn)優(yōu)異。