本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種trim21/otud4在清除shbs/hbsag中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、乙型肝炎病毒(hepatitis?b?virus，hbv)感染可引起急性、慢性肝炎，并導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌。hbv感染是全球重大公共衛(wèi)生問題，目前，基于干擾素和核苷類似物的直接抗病毒策略無法完全清除患者體內(nèi)hbv，因此，抗hbv感染藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的目標(biāo)已從完全清除hbv轉(zhuǎn)向?qū)崿F(xiàn)慢性乙型肝炎(chronic?hepatitis?b，chb)的功能性治愈。hbv表面抗原(hepatitis?b?virus?surface?antigen,hbsag)是hbv主要致病因子之一，持續(xù)高水平的hbsag可導(dǎo)致免疫耗竭，并大大增加chb患者患肝癌風(fēng)險(xiǎn)，清除hbsag視為臨床上hbv“功能性治愈”。目前已有多種藥物研發(fā)靶向清除或阻斷hbsag分泌到血清中，包括小干擾rna(ab-729)和反義寡核苷酸(aso)旨在阻礙hbsag的合成或翻譯，以及核酸聚合物(nap)和s-抗原轉(zhuǎn)運(yùn)抑制寡核苷酸聚合物(stops)抑制hbsag分泌。盡管已有多種藥物研發(fā)靶向清除或阻斷hbsag分泌到血清中，但由于持續(xù)時(shí)間、效果和安全性等問題，目前無法實(shí)現(xiàn)完全清除hbsag，仍需研發(fā)更多的藥物用于清除hbsag。shbs是hbsag中性質(zhì)最穩(wěn)定、含量最豐富的部分，占hbsag的70％左右，并且shbs區(qū)是lhbs、mhbs及shbs共有區(qū)段，shbs的e3泛素連接酶和去泛素化酶也可能是lhbs、mhbs的e3泛素連接酶和去泛素化酶，調(diào)控shbs蛋白的e3泛素連接酶和去泛素化酶不僅可調(diào)控shbs蛋白水平，也可作用于lhbs、mhbs的蛋白水平。

2、因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種以trim21蛋白和otud4蛋白為靶點(diǎn)的清除shbs/hbsag蛋白的藥物及其制備方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是開發(fā)一種以trim21蛋白和otud4蛋白為靶點(diǎn)的清除shbs/hbsag蛋白的藥物及其制備方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種清除shbs/hbsag蛋白的藥物，包括trim21基因的重組質(zhì)粒和/或otud4小干擾rna，靶點(diǎn)為trim21蛋白和otud4蛋白。

3、進(jìn)一步地，trim21基因的genbank登錄號:nm_003141.4，其核苷酸序列如序列表seq?id?no：1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如序列表seq?id?no：2所示。

4、進(jìn)一步地，otud4基因的genbank登錄號:nm_001366057.1，其核苷酸序列如序列表seq?id?no：3所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如序列表seq?id?no：4所示。

5、本發(fā)明還提供了一種清除shbs/hbsag蛋白藥物的制備方法，包括以下步驟：

6、步驟1、合成trim21基因并克隆到表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒；

7、步驟2、合成otud4基因的小干擾rna；

8、步驟3、將步驟1構(gòu)建好的重組質(zhì)?；虿襟E2合成的小干擾rna轉(zhuǎn)染至表達(dá)shbs蛋白或表達(dá)hbv的肝癌細(xì)胞中。

9、進(jìn)一步地，步驟1還包括：從肝癌細(xì)胞huh7中提取mrna，反轉(zhuǎn)錄并構(gòu)建cdna文庫。

10、進(jìn)一步地，步驟1還包括：trim21基因的核苷酸序列如seq?id?no：1所示，根據(jù)序列seq?id?no：1設(shè)計(jì)合成引物，從cdna文庫中合成trim21基因。

11、進(jìn)一步地，合成引物為包括引物1和引物2；引物1的核苷酸序列為：cggaattcgccaccatggcttcagcagcacgctt；引物2的核苷酸序列為：cccaagcttttacagatcctcttcagagatgagtttctgctcatagtcagtggatc?cttgtg。

12、進(jìn)一步地，還包括擴(kuò)增trim21基因，擴(kuò)增反應(yīng)的條件為96℃5min，(95℃30s，58℃30s，72℃1min)共25cycles，72℃10min。

13、進(jìn)一步地，步驟2還包括合成小干擾rna的引物對，包括引物otud4?sirna#1和引物otud4?sirna#2，引物otud4?sirna#1的序列為：otud4?sirna#1:5’-ucgagagaacagagagaaatt-3’；引物otud4?sirna#2的序列為:5’-ggguaggacaaguggaaautt-3’。

14、進(jìn)一步地，步驟3還包括：通過蛋白免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)及實(shí)時(shí)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞內(nèi)shbs/hbsag蛋白表達(dá)、分泌到細(xì)胞外的hbsag、hbeag及hbv?dna表達(dá)。

15、進(jìn)一步地，e3泛素連接酶的激動(dòng)劑或去泛素化酶的抑制劑可作為治療疾病相關(guān)藥物，而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)過表達(dá)trim21或敲弱otud4均可降低shbs/hbsag蛋白水平和其他病毒標(biāo)志物hbeag及hbv?dna水平，為清除shbs/hbsag提供了新靶點(diǎn)。

16、在本發(fā)明的較佳實(shí)施方式1中，詳細(xì)說明了cdna文庫的構(gòu)建過程；

17、在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施方式2中，詳細(xì)說明了表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化宿主、陽性克隆鑒定過程；

18、在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施方式3中，詳細(xì)說明了設(shè)計(jì)并合成sirna的過程；

19、在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施方式4中，詳細(xì)說明了轉(zhuǎn)染宿主及蛋白表達(dá)檢測過程；

20、在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施方式5中，詳細(xì)說明了分泌細(xì)胞外的蛋白表達(dá)檢測過程；

21、在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施方式6中，詳細(xì)說明了分泌細(xì)胞外的hbv?dna水平檢測過程。

22、本發(fā)明有益的技術(shù)效果如下：

23、本發(fā)明解析調(diào)控shbs/hbsag蛋白穩(wěn)定性的e3泛素連接酶trim21和去泛素化酶otud4，為開發(fā)清除shbs/hbsag蛋白的藥物或干預(yù)措施提供理論依據(jù)，也為治療hbv臨床功能性治愈提供了潛在的抗病毒新靶點(diǎn)，具體為：

24、構(gòu)建了重組載體pcdnatm3.1/myc-his(-)a-trim21-myc及otud4?sirna；

25、并過表達(dá)trim21或敲弱otud4均可顯著抑制肝癌細(xì)胞內(nèi)shbs/hbsag蛋白表達(dá)及分泌到細(xì)胞外的hbsag、hbeag蛋白表達(dá)及hbv?dna水平。

26、以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

技術(shù)特征：

1.一種清除shbs/hbsag蛋白的藥物，其特征在于，所述藥物包括trim21基因的重組質(zhì)粒和otud4小干擾rna，所述藥物的靶點(diǎn)為trim21蛋白和otud4蛋白。

2.如權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于，所述trim21基因的genbank登錄號:nm_003141.4，其核苷酸序列如序列表seq?id?no：1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如序列表seq?id?no：2所示。

3.如權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于，所述otud4基因的genbank登錄號:nm_001366057.1，其核苷酸序列如序列表seq?id?no：3所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如序列表seq?id?no：4所示。

4.一種如權(quán)利要求1所述的藥物的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟1還包括：從肝癌細(xì)胞huh7中提取mrna，反轉(zhuǎn)錄并構(gòu)建cdna文庫。

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟1還包括：trim21基因的核苷酸序列如seq?id?no：1所示，根據(jù)所述序列seq?id?no：1設(shè)計(jì)合成引物，從所述cdna文庫中合成所述trim21基因。

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述合成引物為包括引物1和引物2；所述引物1的核苷酸序列為：cggaattcgccaccatggcttcagcagcacgctt；所述引物2的核苷酸序列為：cccaagcttttacagatcctcttcagagatgagtttctgctcatagtcagtggatc?cttgtg。

8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，還包括擴(kuò)增trim21基因，擴(kuò)增反應(yīng)的條件為96℃5min，(95℃30s，58℃30s，72℃1min)共25cycles，72℃10min。

9.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟2還包括合成小干擾rna的引物對，所述引物對包括引物otud4?sirna#1和引物otud4?sirna#2，所述引物otud4?sirna#1的序列為：otud4?sirna#1:5’-ucgagagaacagagagaaatt-3’；所述引物otud4?sirna#2的序列為:5’-ggguaggacaaguggaaau?tt-3’。

10.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟3還包括：通過蛋白免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)及實(shí)時(shí)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞內(nèi)shbs/hbsag蛋白表達(dá)、分泌到細(xì)胞外的hbsag、hbeag及hbv?dna表達(dá)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種清除SHBs/HBsAg蛋白的藥物及其制備方法，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，該藥物包括TRIM21基因的重組質(zhì)粒和/或OTUD4小干擾RNA；其制備方法為：合成TRIM21基因并克隆到表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒；合成OTUD4基因的小干擾RNA；將構(gòu)建好的重組質(zhì)?；蚝铣傻男「蓴_RNA轉(zhuǎn)染至表達(dá)SHBs蛋白或表達(dá)HBV的肝癌細(xì)胞中。本發(fā)明構(gòu)建了重組載體pcDNATM3.1/myc?His(?)A?TRIM21?myc及OTUD4siRNA的構(gòu)建；過表達(dá)TRIM21或敲弱OTUD4均可顯著抑制肝癌細(xì)胞內(nèi)SHBs/HBsAg蛋白表達(dá)及分泌到細(xì)胞外的HBsAg、HBeAg蛋白表達(dá)及HBV?DNA水平。

技術(shù)研發(fā)人員：林旭,吳淑香
受保護(hù)的技術(shù)使用者：福建醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30