本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，具體涉及一種雙功能水凝膠及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、口腔頜面部腫瘤是指發(fā)生在口腔、唾液腺、上下頜骨、面部及頸部等部位的腫瘤，其中90％以上的病理類型為口腔鱗狀細(xì)胞癌(ora?l?squamous?ce?l?lcarc?i?noma，oscc)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年有約380萬人死于該疾病及相關(guān)疾病，且發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢。oscc具有高度的異質(zhì)性、侵襲性和轉(zhuǎn)移傾向，治療通常采用腫瘤根治術(shù)和放化療。然而，由于口腔中組織解剖復(fù)雜，相鄰器官密切，腫瘤根治術(shù)對宿主具有破壞性，常引起口腔和頜面區(qū)域的骨缺損，可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)咀嚼障礙、語音改變和吞咽困難等生理功能障礙，從而降低患者的生活質(zhì)量和身心健康。由腫瘤引起的骨缺損通常呈形狀不規(guī)則的腔隙特征，目前臨床多用合成骨替代材料，如羥基磷灰石進(jìn)行充填治療，其在使用時(shí)往往面臨諸多問題，如操作復(fù)雜、形狀匹配困難以及造成的創(chuàng)傷大等。此外，對于大多數(shù)患者來說，手術(shù)切除腫瘤后，切緣局部可能仍然存在殘存的腫瘤細(xì)胞，需要輔以放/化療，但是大劑量的放療可能會引發(fā)放射性頜骨壞死，長期的化療也會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和患者的最終死亡。因此，亟需開發(fā)新的治療策略，能夠避免放/化療的嚴(yán)重毒副作用，并實(shí)現(xiàn)對oscc組織切除術(shù)后殘留的腫瘤細(xì)胞的消融和對手術(shù)所致的骨缺損的修復(fù)及再生的雙重目標(biāo)，對提高oscc術(shù)后生存率、降低病死率及改善患者生活質(zhì)量具有重要意義。

2、目前，生物材料介導(dǎo)的腫瘤光治療，特別是光熱(phototherma?l?therapy，ptt)/光動力(photodynami?c?therapy，pdt)協(xié)同治療已展現(xiàn)出巨大的臨床應(yīng)用潛力。ptt是利用光熱轉(zhuǎn)化劑，在近紅外光(near?i?nfrared，n?i?r)等外部光源的照射下將光能轉(zhuǎn)化為熱能的一種無創(chuàng)性療法。然而，ptt過高的溫度(＞50℃)不可避免地會對周圍正常組織造成損傷，而且考慮到近紅外光的穿透能力有限，ptt僅對表淺或小型腫瘤有效。pdt通過光照激活光敏劑產(chǎn)生活性氧自由基(react?i?ve?oxygen?spec?i?es，ros)殺傷腫瘤細(xì)胞，可作為ptt的重要補(bǔ)充。但已經(jīng)商業(yè)化以及在研的大多數(shù)光敏劑是通過能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生單線態(tài)氧(1o2)的i?i型光敏劑，該過程對氧氣濃度的依賴程度高，但是，由于癌細(xì)胞的侵襲性增殖和腫瘤血液供應(yīng)不足，致使實(shí)體瘤中出現(xiàn)了嚴(yán)重缺氧腫瘤微環(huán)境，對氧依賴型pdt產(chǎn)生較大的負(fù)面影響。因此，開發(fā)具有非氧依賴型的光熱協(xié)同治療模式是進(jìn)一步提高癌癥光療效果的關(guān)鍵。熱動力治療(thermodynamic?therapy，tdt)是一種由高毒性烷基自由基介導(dǎo)的新型非氧依賴型癌癥治療手段，主要利用熱分解型自由基引發(fā)劑(如偶氮類化合物)受熱后產(chǎn)生的高毒性烷基自由基誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死。通過將tdt與ptt相結(jié)合，不但能夠采用相對溫和的溫度以降低對周圍正常組織的熱損傷，同時(shí)能夠克服腫瘤缺氧微環(huán)境對pdt的不利影響，開展更為有效的癌癥協(xié)同治療。

3、此外，oscc術(shù)后導(dǎo)致的骨缺損也需要有效的修復(fù)策略。近年來，為了加速骨缺損的修復(fù)，已經(jīng)開發(fā)了多種材料，包括有機(jī)材料、無機(jī)材料和復(fù)合材料。以有機(jī)大分子為骨架的可注射水凝膠是一種具有類似細(xì)胞外基質(zhì)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的有機(jī)材料。這些水凝膠能夠提供支架結(jié)構(gòu)，促進(jìn)骨細(xì)胞的附著和增值，并提供生長因子的載體，促進(jìn)骨細(xì)胞分化和新骨的生成。此外可注射水凝膠能適應(yīng)不規(guī)則形狀的骨缺損，與植入部位緊密粘附，操作簡單，具有非侵入性、微創(chuàng)性的特點(diǎn)，在治療頜骨缺損方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢?？勺⑸渌z材料可以分為天然和合成來源。天然聚合物，如殼聚糖、海藻酸鹽、透明質(zhì)酸(hya?l?uronic?aci?d，ha)、膠原蛋白、明膠等具有可生物降解、攜帶整合素結(jié)合位點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)但存在免疫原性。人工合成聚合物，如聚乙二醇(po?lyethy?l?ene?g?lyco?l，peg)、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和聚甲基丙烯酸甲酯等具備機(jī)械性能強(qiáng)、可定制性、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，但缺乏先天的生物功能，必須經(jīng)過重要的后處理才能在體內(nèi)引發(fā)所需的反應(yīng)。將二者結(jié)合制備可注射性水凝膠，可改善其機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)對孔隙率、網(wǎng)格結(jié)構(gòu)和釋放行為的精確調(diào)控，同時(shí)又能夠賦予水凝膠良好的細(xì)胞粘附性和增殖性，提供更好的填充效果，促進(jìn)骨組織再生與愈合。

4、通常，在給藥前，通過水凝膠組分水溶液的混合將藥物和細(xì)胞裝載進(jìn)可注射水凝膠，這一過程相對比較簡單。作為局部藥物遞送系統(tǒng)，水凝膠在注射部位能夠逐漸溶脹或降解，從而提供持續(xù)的、有針對性的生物活性劑釋放。然而對于一些疏水性藥物，它和親水凝膠網(wǎng)絡(luò)具有固有的不相容性，因此，如何有效地將疏水性藥物裝載到水凝膠中仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。此外，對于一些未經(jīng)過包裹和保護(hù)，直接從遞送系統(tǒng)中釋放的裸藥，在體內(nèi)穩(wěn)定性低，特別是對于某些疏水性藥物和核酸藥物，它們往往很難穿透細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)，從而導(dǎo)致生物利用度極低。因此，使得水凝膠遞藥具有雙重目標(biāo)，既包括如何將疏水性藥物裝載進(jìn)水凝膠，又要將藥物遞送至靶細(xì)胞的問題是，目前急需解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種雙功能水凝膠及其制備方法和應(yīng)用。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

3、一種雙功能水凝膠，包括f127@i?cg膠束、α-環(huán)糊精修飾的透明質(zhì)酸、熱分解型烷基自由基引發(fā)劑以及水；優(yōu)選的，所述的f127@i?cg膠束為p?l?uronic?f127與光熱轉(zhuǎn)化劑icg自組裝形成的復(fù)合膠束。

4、所述的熱分解型烷基自由基引發(fā)劑為aiph；所述的引發(fā)劑的質(zhì)量濃度為0.01-5％；優(yōu)選為1.25％。

5、α-環(huán)糊精修飾的透明質(zhì)酸在雙功能水凝膠體系中的質(zhì)量濃度≥7.5％；優(yōu)選為10％；α-環(huán)糊精修飾的透明質(zhì)酸ha-cd的接枝率為10％～45％之間，優(yōu)選為11.6％。

6、所述的f127@i?cg膠束的終濃度為5-15％；優(yōu)選為13.4％；i?cg濃度為0.01-1％；優(yōu)選為0.1％；

7、優(yōu)選的，f127@i?cg膠束的水合粒徑為50-500nm，多分散指數(shù)為0.15-0.35；優(yōu)選的。所述的f127@i?cg膠束的水合粒徑為269.7nm，多分散指數(shù)為0.2563。

8、所述的α-環(huán)糊精修飾的透明質(zhì)酸ha-cd采用下述方式制備：將透明質(zhì)酸與氨基修飾的α-環(huán)糊精在縮合劑以及催化劑的作用下反應(yīng)得到；所述的透明質(zhì)酸的相對分子質(zhì)量的范圍在30kda～600kda；優(yōu)選為30kda；

9、優(yōu)選的，所述的縮合劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；所述的催化劑為n-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽；

10、優(yōu)選的，所述的透明質(zhì)酸與氨基修飾的α-環(huán)糊精的質(zhì)量比為1：(0.1-1)；優(yōu)選為1:0.5；

11、優(yōu)選的，具體包括下述步驟：1)將透明質(zhì)酸溶解在嗎啉乙磺酸緩沖液中，加入縮合劑和催化劑，室溫?cái)嚢?.5h-4h；2)用磷酸鹽緩沖液將上述反應(yīng)體系ph調(diào)至7.2，而后，加入氨基修飾的α-環(huán)糊精，室溫?cái)嚢?2～24h；3)在去離子水中透析3-5天，冷凍干燥得到α-環(huán)糊精修飾的透明質(zhì)酸。優(yōu)選的，所述的嗎啉乙磺酸緩沖液的濃度為0.1m，ph＝5；所述的磷酸鹽緩沖液濃度為0.1m，ph＝7.4。

12、f127@i?cg膠束采用下述方式制備：1)將光熱轉(zhuǎn)化劑i?cg的氯仿溶液加入p?luroni?c?f127水溶液中，即刻超聲3-5min，在室溫下攪拌12-24h；優(yōu)選的，超聲的處理?xiàng)l件為：125w，5s/5s?on/off循環(huán)，3分鐘；2)待氯仿完全蒸發(fā)后使用超濾管進(jìn)行后處理得到f127@i?cg膠束；優(yōu)選的，使用超濾管mwco＝3500da離心6000-10000rpm，30-60min進(jìn)行后處理得到膠束f127@i?cg。

13、本發(fā)明還包括一種所述的雙功能水凝膠的制備方法，包括下述步驟：1)室溫下，將α-環(huán)糊精修飾的透明質(zhì)酸ha-cd溶解在去離子水中，充分?jǐn)嚢瑁o置；2)在ha-cd溶液中加入熱分解型烷基自由基引發(fā)劑，使其充分溶解；3)將f127@i?cg膠束加入上述溶液中，充分?jǐn)嚢瑁旌暇鶆?，在室溫下靜置30-120min，使用紫外燈滅菌消毒，得到pfha@i?cg/aiph。

14、本發(fā)明還包括一種所述的雙功能水凝膠的應(yīng)用，應(yīng)用于制備具有熱動力治療功能和口腔頜骨缺損修復(fù)功能的可注射水凝膠；水凝膠的濃度≤10mg/ml，優(yōu)選為4.7mg/ml。

15、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

16、基于環(huán)糊精(cyc?l?odextr?i?n，cd)的主客體超分子水凝膠具備優(yōu)異的生物相容性、剪切稀化和刺激響應(yīng)性等特點(diǎn)，已經(jīng)發(fā)展成為一系列適合生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的水凝膠。從組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的角度，cd主客體超分子水凝膠可分為聚(偽)輪烷衍生的超分子水凝膠和cd與小客體分子之間的主體-客體相互作用的超分子水凝膠。其中，基于α-cd與peg包結(jié)絡(luò)合制備的多準(zhǔn)聚輪烷超分子水凝膠，因制備條件溫和，生物相容性好和具備剪切稀化等特點(diǎn)，在藥物控釋領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用前景。p?l?uronic?f127是一種嵌段聚合物，包含兩條peg鏈，它們通過疏水的聚丙烯醇部分連接起來，表現(xiàn)出獨(dú)特的兩親性，被廣泛運(yùn)用于藥物遞送和生物材料等領(lǐng)域，尤其是對于疏水性藥物，可以改善其溶解性、體內(nèi)循環(huán)半衰期及不良反應(yīng)，還能夠增強(qiáng)藥物在腫瘤組織的滲透性和滯留效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)藥物的多重載藥與控制釋放。

17、本發(fā)明首先將疏水性光熱轉(zhuǎn)化劑吲哚菁綠(i?ndocyani?ne?green，i?cg)包載到pl?uronic?f127中，制備f127@i?cg膠束，此外將熱分解型烷基自由基引發(fā)劑2,2’-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽(2,2-azobi?s[2-(2-imidazo?l?i?n-2-y?l)propane]-d?i?hydroch?l?or?ide，aiph)溶解到α-環(huán)糊精修飾的透明質(zhì)酸(α-cyc?lodextr?i?n-mod?ified?hya?l?uronic?ac?id，ha-cd)中，而后將得到的混合溶液與f127@icg膠束溶液在室溫下混合，得到共負(fù)載i?cg和aiph的多準(zhǔn)聚輪烷超分子水凝膠pfha@i?cg/aiph。在近紅外光照射下，利用i?cg的光熱效應(yīng)誘導(dǎo)aiph在腫瘤部位快速釋放和分解，產(chǎn)生自由基，從而使其在oscc低氧環(huán)境中有效殺死癌細(xì)胞，具有更好的抗腫瘤治療效果。另外，水凝膠還可以填充在骨缺損區(qū)域，為腫瘤清除后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化提供結(jié)構(gòu)支持，引導(dǎo)新骨基質(zhì)形成，從而誘導(dǎo)骨組織的再生，實(shí)現(xiàn)骨組織缺損的有效修復(fù)。