本發(fā)明屬于生物材料，尤其涉及一種光固化自體血小板濃縮物水凝膠的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：1、由于腫瘤、創(chuàng)傷、炎癥和先天性疾病導(dǎo)致的組織缺損，一直是臨床治療的難題。缺損形成后的創(chuàng)口愈合和組織再生是一個(gè)動(dòng)態(tài)而又復(fù)雜的過程。目前較為理想的手段是使用再生醫(yī)學(xué)的策略來促進(jìn)傷口愈合和組織再生。再生醫(yī)學(xué)的關(guān)鍵是組織工程的三駕馬車：支架，細(xì)胞以及生物活性因子。簡單來說就是通過在支架材料上負(fù)載種子細(xì)胞和生物活性因子來促進(jìn)新組織新生。這其中存在一些問題，傳統(tǒng)的生物材料支架缺乏生物活性，而外源性生長因子的應(yīng)用則存在成本高、安全性差、效果難以預(yù)測(cè)等問題。在這種情況下人自體血小板濃縮物(autologous?platelet?concentrates,apc)走進(jìn)了人們的視野。apc是通過對(duì)血液進(jìn)行離心得到的，為了利用血小板分泌的生物分子的治療潛力，血液解構(gòu)可以產(chǎn)生自體血小板和血漿衍生的蛋白纖維蛋白支架。源自血小板和血漿的自體生長因子，與纖維蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)和組織細(xì)胞以組合、協(xié)同和多向的方式相互作用，從而控制組織修復(fù)的機(jī)制。作為一類使用患者血液衍生出來的生物制品，其天然包含組織工程中的重要元素：支架-由纖維蛋白原聚合而成的立體纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)，其獨(dú)特的內(nèi)在特征可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞行為直接促進(jìn)傷口愈合，而且還可以通過在體內(nèi)的自發(fā)反應(yīng)從而成為生物活性分子的遞送系統(tǒng)。生物活性因子-制備過程中血小板脫顆粒而釋放的多種生長因子，由于這些生長因子是內(nèi)源性且具有最佳的生理比例，因此對(duì)組織再生起協(xié)同作用，而且不存在副作用。2、目前多種類型的血液衍生物已經(jīng)應(yīng)用于不同類型的組織缺損，例如骨缺損，牙周組織再生以及軟組織愈合，并顯示出了良好的治療效果。然而系統(tǒng)回顧卻與治療效果相矛盾，這主要是由于自體血液衍生物存在以下缺點(diǎn)：①降解速度快，不能保持生長因子的長期釋放，不能保證這些生化信號(hào)長時(shí)間呈現(xiàn)。②機(jī)械性能差，而且機(jī)械性能與組織再生部位的復(fù)雜環(huán)境匹配度差，尤其是其單一應(yīng)用于骨缺損時(shí)，且難以保持長期結(jié)構(gòu)完整性。③臨床操作受限，目前臨床中常用的apc大多在制備完成已經(jīng)是凝膠態(tài)，或不可控的自發(fā)形成凝膠需要擠壓除水后才能放置于缺損處，而且對(duì)于組織沒有黏附能力，需要復(fù)雜的縫合固定，操作時(shí)間長。因此開發(fā)出一種具備優(yōu)異機(jī)械性能、能夠緩釋生長因子并能實(shí)現(xiàn)可控溶膠凝膠轉(zhuǎn)換的自體血小板濃縮物水凝膠具有重大臨床意義。3、目前，利用生物材料來對(duì)apc進(jìn)行修飾是一種新興的策略。大部分apc如prf、cgf制備完成后直接是膠體狀態(tài)，難以與生物材料產(chǎn)生有效結(jié)合。而可注射富血小板纖維蛋白(injectable?platelet-rich?fibrin,iprf)作為apc的一種，在制備完成的初期處于液體狀態(tài)，隨后的大約7分鐘內(nèi)通過凝血作用緩慢成膠，利用這一特性在iprf制備完成的初期與生物材料混合，使得其能夠均勻的與水凝膠結(jié)合，并且其中用于發(fā)生凝血作用的化學(xué)鍵可以與水凝膠中的化學(xué)鍵相結(jié)合一方面能阻斷其自發(fā)成膠的過程，隨后通過水凝膠中的特定基團(tuán)(如光引發(fā)基團(tuán)，溫敏基團(tuán))控制成膠過程，實(shí)現(xiàn)可控的溶膠凝膠轉(zhuǎn)換，另一方面則能在水凝膠的網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上形成新的網(wǎng)絡(luò)體系利用水凝膠的特性來改良生長因子釋放過快、機(jī)械性能差等缺點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路1、本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種光固化自體血小板濃縮物水凝膠的制備方法及應(yīng)用，旨在解決上述
背景技術(shù)：
：中提出的問題。2、本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種光固化自體血小板濃縮物水凝膠的制備方法，包括以下步驟：3、步驟1、gelma的制備；4、步驟2、iprf的制備；5、步驟3、iprf-ma水凝膠的制備：6、步驟3.1、稱取500mg?gelma水凝膠前體置于4ml?pbs中，放置于55℃水浴箱中，待其充分溶解后得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的gelma溶液。稱取1mg?lap光引發(fā)劑加入上述體系溶液中，攪拌5分鐘。7、步驟3.2、將上述液體裝入離心管中，隨后加入1ml?iprf，利用注射器將兩種成分充分混勻，在405nm紫外光照射30s使其交聯(lián)得到iprf-ma水凝膠。8、進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述步驟1包括以下具體步驟：9、步驟1.1、將5g?a型豬皮明膠分次加入到50ml二磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中。將該體系置于50℃水浴中以400rpm轉(zhuǎn)速連續(xù)攪拌約至完全溶解。從而得到濃度為10％(w/v)的gelma水凝膠前體溶液。10、步驟1.2、將gelma水凝膠前體溶液繼續(xù)在50℃環(huán)境中以400rpm轉(zhuǎn)速攪拌，同時(shí)以0.5ml/min的速率逐滴加入1.5-3ml甲基丙烯酸。持續(xù)反應(yīng)3h后，加入naoh溶液或粉末，直至將ph調(diào)節(jié)為7.2。11、步驟1.3、將gelma水凝膠前體溶液倒入到300ml的溫和pbs溶液中，且pbs溶液的溫度為50℃，混合均勻后將液體轉(zhuǎn)移到14000kd透析膜上。保持其在50℃蒸餾水水浴環(huán)境中透析3-7天。在此期間，前兩天每2小時(shí)更換一次蒸餾水，后期換水頻率可降低至3-4次/日，直至平衡。12、步驟1.4、透析結(jié)束后，使用孔隙直徑0.22μm的濾器對(duì)gelma水凝膠前體溶液進(jìn)行抽濾。13、步驟1.5、將抽濾后的gelma水凝膠前體溶液分次吸出并轉(zhuǎn)移到大皿中，進(jìn)行為期2天的冷凍干燥，最終得到白色多孔泡沫樣的gelma水凝膠前體。14、進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述步驟2包括以下具體步驟：15、步驟2.1、取全血5ml與不含抗凝劑的塑料采血管中。16、步驟2.2、室溫下，以300g離心3分鐘后，收集上層淡黃色液體即為iprf。17、本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于，一種光固化自體血小板濃縮物水凝膠的應(yīng)用，基于上述方法所制備的iprf-ma水凝膠，將iprf-ma水凝膠作為支架應(yīng)用于治療缺損形成后的創(chuàng)口愈合和組織再生。18、本發(fā)明實(shí)施例提供的一種光固化自體血小板濃縮物水凝膠的制備方法及應(yīng)用，通過對(duì)自體血液進(jìn)行低速離心得到了可注射富血小板纖維蛋白，在其初期尚呈現(xiàn)液體狀態(tài)時(shí)，加入gelma水凝膠溶液，在這一過程中，iprf的纖維蛋白原通過氫鍵和靜電相互作用與gelma相結(jié)合，從而阻斷其自發(fā)的凝血反應(yīng)，隨后通過激活水凝膠中的光敏基團(tuán)形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)iprf的光控成膠。本發(fā)明合成的iprf-ma水凝膠支架，在改善其機(jī)械性能的同時(shí)，賦予了其光控成膠的特性，使其能夠以可注射的方式填補(bǔ)不規(guī)則組織缺損，隨后通過光照在組織原位形成具備良好機(jī)械性能的水凝膠，極大地方便了臨床使用。同時(shí)通過水凝膠的包封作用以及水凝膠中的gelma組分對(duì)生長因子的親和力，克服了傳統(tǒng)apc初期生長因子爆發(fā)性釋放的問題，實(shí)現(xiàn)了生長因子的緩釋，使其能夠在組織再生的過程中長期發(fā)揮作用。iprf中的生長因子賦予了水凝膠強(qiáng)大的生物活性，促進(jìn)細(xì)胞遷移，粘附和增殖，在提供適合細(xì)胞生長微環(huán)境的同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞定位、粘附及定植，指導(dǎo)細(xì)胞的增殖和分化。此外，水凝膠中的多種生長因子，能夠極大地促進(jìn)血管化，實(shí)現(xiàn)組織的快速再生。本方法構(gòu)建的iprf-ma水凝膠已經(jīng)在相關(guān)表征中表現(xiàn)出理想的機(jī)械性能，同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中被證明在組織缺損修復(fù)過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，很大程度上促進(jìn)了成血管相關(guān)基因的表達(dá)。因此本發(fā)明未來有望應(yīng)用于組織缺損修復(fù)相關(guān)的臨床治療中。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12