本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種mir-34b-5p抑制劑在制備治療胃腸疾病藥物中的應用。

背景技術：

1、胃食管反流病(gastroesophageal?reflux?disease,gerd)是胃內容物反流到食道引起癥狀或并發(fā)癥的一系列疾病[1]。gerd嚴重影響人群的健康和生活質量，也給社會醫(yī)療資源帶來巨大負擔。然而，由于其復雜的發(fā)病機制，gerd的機制尚未完全闡明，導致治療結果欠佳。

2、目前質子泵抑制劑(proton?pump?inhibitor，ppi)仍然是胃食管反流病的首選藥物。盡管ppi試驗被用作具有胃灼熱和反流典型癥狀的患者的診斷測試，但這種方法的敏感性僅為80％，特異性為74％。此外，高達45％接受ppi治療的患者可能會繼續(xù)出現(xiàn)副反應癥狀。長期應用ppi可能發(fā)生某些不良反應，如小腸細菌過度生長、機會性感染、骨質疏松相關骨折、慢性腎病、某些維生素和礦物質缺乏及癡呆等。因此，對于一些藥物治療可能無效或不可耐受的患者，需要考慮手術治療。然而，手術治療可能存在一定的風險，如手術并發(fā)癥、食管狹窄等。因此，研究gerd的機制從而精準給藥是gerd治療的重大挑戰(zhàn)。

3、胃腸上皮屏障是引發(fā)機體免疫反應，維持胃腸穩(wěn)態(tài)的關鍵。緊密連接(tightjunction，tjs)是上皮細胞構成屏障的最重要組成部分，它們通過緊密地密封細胞-細胞連接來調節(jié)屏障的通透性。tj蛋白由claudin、occludin、連接粘附分子和occludin支架蛋白閉塞帶代表，這些分子直接與支架蛋白閉塞帶(zos)結合。在這些tj蛋白中，claudin是tj的主要成分，負責上皮細胞的屏障和極性。包括反流性食管炎、炎癥性腸病、功能性胃腸疾病和癌癥在內的胃腸道疾病可能受到這些分子的調節(jié)，它們功能的破壞導致慢性炎癥和慢性或進行性疾病。通過調節(jié)tj蛋白的表達和定位來調節(jié)上皮細胞的屏障功能是治療gerd的潛在新靶點。若通過改善粘膜屏障功能來調節(jié)癥狀的產生和免疫功能障礙，這些疾病的治療策略可能會大大改變。但至今尚無靶向胃腸道屏障功能障礙的藥物進入臨床。mirnas是一組小的、非編碼的、內源性的rna，負調控靶基因，通常通過與靶基因的3‘非翻譯區(qū)(utr)的不完全互補序列配對，導致mrna的切割和翻譯抑制。通過改變的mirnas調控gerd的證據(jù)正在增加，研究發(fā)現(xiàn)mirnas可以抑制barrett食管細胞的增殖、遷移和侵襲。

4、研究表明胃液中的mirnas是穩(wěn)定的，可以作為gc的新的生物標志物。細胞外囊泡(extracellular?vesicle,ev)是由細胞釋放至細胞外基質的雙層膜囊泡結構，目前主要分為三種類型：外泌體(exosome)(直徑小于150nm)、微泡/脫落顆粒和凋亡小體(直徑均被認為大于100nm)。外泌體可以攜帶許多細胞成分，包括dna、rna、蛋白質和脂質，這些細胞成分對細胞通訊和物質交換至關重要。因此胃液外泌體mirnas對上皮屏障的研究對于深入了解胃食管反流病的發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)及病理特點具有重要意義。

技術實現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明提出一種mir-34b-5p抑制劑在制備治療胃腸道疾病藥物中的應用。

2、一方面，提出一種mir-34b-5p抑制劑在制備治療胃腸道疾病藥物中的應用，主要用于胃腸疾病藥物包括預防和/或治療食管反流藥物、抑制上皮屏障破壞藥物和治療胃腸炎癥進程的藥物。

3、進一步的，所述mir-34b-5p源自外泌體，尤其是胃食管反流患者胃液來源的外泌體。所述mir-34b-5p抑制劑為aav，源自重組表達質粒tud(mmu-mir-34b-5p)。

4、進一步的，所述重組表達質粒tud(mmu-mir-34b-5p)的核苷酸序列片段為：ggtggcgctaggatcatcaacacaatcagctaatatcttacactgcctcaagtattctggtcacagaa?tacaacacaatcagctaatatcttacactgcctcaagatgatcctagcgccacctttttt。

5、進一步的，所述重組表達質粒tud(mmu-mir-34b-5p)的正向測序引物：pak?d-ftcatcaacccgctccaaggaat；反向測序引物：pakd-r?caagctcgaaattaaccctca?c。

6、進一步的，所述mir-34b-5p抑制劑為抑制mir-34b-5p表達或活性的產品。

7、更進一步的，所述產品包括能夠抑制mir-34b-5p表達的mirna模擬物，和/或mir-34b-5p的過表達質粒載體，和/或封閉mir-34b-5p的腺相關病毒載體。

8、所述mir-34b-5p抑制劑(aavmir-34b-5p-tud)的獲取方法包括以下步驟：

9、(1)重組表達質粒tud(mmu-mir-34b-5p)同phelper(攜帶腺病毒來源的基因)和paav-rc(攜帶aav復制和衣殼基因)共轉染進aav-293細胞(提供aav復制和包裝所需的反式作用因子)，轉染2-3天后重組aav在包裝細胞中組裝完成；

10、(2)收集被感染的aav-293細胞，裂解釋放aav-mir-34b-5p-tud顆粒；通過密度梯度離心和超濾濃縮并純化收集的病毒上清液；用定量pcr法測定所得到病毒的滴度。

11、進一步的，所述mir-34b-5p抑制劑個體給予量為1.0e+11v.g.-1.0e+13v.g。

12、本發(fā)明mir-34b-5p抑制劑在制備治療胃腸道疾病藥物中的應用，其有益效果在于：本發(fā)明mir-34b-5p抑制劑可以用于調節(jié)胃食管反流患者胃液外泌體對上皮細胞屏障的影響，從而改善癥狀和減輕炎癥反應，為治療胃食管反流疾病提供了新的靶點和方案，具有重要的臨床價值和良好的臨床應用前景。

技術特征：

1.一種mir-34b-5p抑制劑在制備治療胃腸道疾病藥物中的應用。

2.根據(jù)權利要求1所述mir-34b-5p抑制劑在制備治療胃腸道疾病藥物中的應用，其特征在于：所述mir-34b-5p源自外泌體,所述mir-34b-5p抑制劑源自重組表達質粒tud(mmu-mir-34b-5p)。

3.根據(jù)權利要求2所述mir-34b-5p抑制劑在制備治療胃腸道疾病藥物中的應用，其特征在于：所述重組表達質粒tud(mmu-mir-34b-5p)的核苷酸序列片段為：ggtggcgctaggatcatcaacacaatcagctaatatcttacactgcctcaagtattctggtca?cagaatacaacacaatcagctaatatcttacactgcctcaagatgatcctagcgccacctttttt。

4.根據(jù)權利要求2所述mir-34b-5p抑制劑在制備治療胃腸道疾病藥物中的應用，其特征在于：所述重組表達質粒tud(mmu-mir-34b-5p)的正向測序引物：pakd-ftcatcaacccgctccaaggaat；反向測序引物：pakd-r?caagctcgaaattaaccc?tcac。

5.根據(jù)權利要求1-4任意項所述mir-34b-5p抑制劑在制備治療胃腸道疾病藥物中的應用，其特征在于：所述胃腸疾病藥物包括預防和/或治療食管反流藥物、抑制上皮屏障破壞藥物和治療胃腸炎癥進程的藥物。

6.根據(jù)權利要求5所述mir-34b-5p抑制劑在制備治療胃腸道疾病藥物中的應用，其特征在于：所述mir-34b-5p抑制劑為抑制mir-34b-5p表達或活性的產品。

7.根據(jù)權利要求6所述mir-34b-5p抑制劑在制備治療胃腸道疾病藥物中的應用，其特征在于：所述產品包括能夠抑制mir-34b-5p表達的mirna模擬物，和/或mir-34b-5p的過表達質粒載體，和/或封閉mir-34b-5p的腺相關病毒載體。

8.根據(jù)權利要求6所述mir-34b-5p抑制劑在制備治療胃腸道疾病藥物中的應用，其特征在于：所述mir-34b-5p抑制劑個體給予量為1.0e+11v.g.-1.0e+13v.g。

技術總結
本發(fā)明公開了一種miR?34b?5p抑制劑在制備治療胃腸道疾病藥物中的應用，屬于生物醫(yī)藥技術領域。本發(fā)明miR?34b?5p抑制劑源自胃食管反流患者胃液來源的外泌體?？梢杂糜谡{節(jié)胃食管反流患者胃液外泌體對上皮細胞屏障的影響，從而改善癥狀和減輕炎癥反應，為治療胃食管反流疾病提供了新的靶點和方案，具有重要的臨床價值和良好的臨床應用前景。

技術研發(fā)人員：張冰琪,郭志云,郭元彪,孫悅珊,蘇旭
受保護的技術使用者：西南交通大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/30