本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物，具體涉及一種多功能仿生納米藥物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、光動力治療(photodynamic?therapy，pdt)、光熱治療(photothermal?therapy，ptt)同屬于光治療，是基于光物理原理的細(xì)胞殺傷策略。pdt通過產(chǎn)生活性氧(ros)來損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，ptt通過熱能來殺死腫瘤細(xì)胞。

2、免疫原性細(xì)胞死亡(immunogenic?cell?death，icd)通過將危險相關(guān)分子模式(damage-associated?molecularpatterns，damp)暴露和釋放到腫瘤微環(huán)境(tumormicroenvironment，tme)中，這些分子模式被抗原呈遞細(xì)胞(主要是樹突狀細(xì)胞(dc))識別，引發(fā)免疫反應(yīng)。damps，包括三磷酸腺苷(atp)、鈣網(wǎng)蛋白(crt)、高遷移率組蛋白b1(hmgb1)的暴露和分泌最終導(dǎo)致dc的成熟以及cd8+t細(xì)胞介導(dǎo)的針對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答的募集和激活。pdt和ptt誘導(dǎo)的icd效應(yīng)，可在一定程度上刺激免疫反應(yīng)。

3、吲哚菁綠(icg)是一種優(yōu)異的光敏劑，在808nm激光照射下產(chǎn)生大量的ros和熱量，因此可同時滿足pdt和ptt治療，但是，吲哚菁綠單獨治療腫瘤的效果不佳。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供一種多功能仿生納米藥物及其制備方法和應(yīng)用。

2、仿生納米顆粒是混合納米結(jié)構(gòu)，其中最外層裝飾有生物配體或生物細(xì)胞膜。這種方法具有多種優(yōu)點，包括逃逸生物系統(tǒng)、延長在血液循環(huán)中的停留時間、靶向遞送和降低全身毒性。由于癌細(xì)胞具有能夠自我靶向同源細(xì)胞的獨特特征，癌細(xì)胞膜成為包裹納米顆粒的理想候選者。

3、熱休克蛋白90(hsp90)是增強(qiáng)細(xì)胞耐熱性的重要蛋白，并且它還可以通過與其他功能分子形成復(fù)合物，以維持生物體的穩(wěn)定性。藤黃酸(ga)是一種天然的hsp90抑制劑，具有抗腫瘤、抗血管生成和抗轉(zhuǎn)移活性的作用。鐵死亡(ferroptosis)通常是在活性氧的存在下，產(chǎn)生有毒的脂質(zhì)過氧化物(lpo)，損傷細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜等結(jié)構(gòu)。谷胱甘肽(gsh)是鐵死亡過程中的核心物質(zhì)，它是保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的重要抗氧化劑，也是谷胱甘肽過氧化物酶4(gpx4)合成的底物。在鐵死亡過程中，gpx4是清除細(xì)胞質(zhì)中ros的重要酶。

4、hif1(hypoxia?inducible?factor-1)，中文名低氧誘導(dǎo)因子-1，hif1是由兩個基本的螺旋-環(huán)-螺旋pas(per-arnt-sim)蛋白hif-1α和hif-1β組成的異二聚體。

5、本發(fā)明具體技術(shù)方案為：

6、本發(fā)明提供一種多功能仿生納米藥物，其包括載藥的陽離子膠束和包裹在載藥的陽離子膠束之外的腫瘤細(xì)胞膜，其中，載藥的陽離子膠束包括陽離子膠束、光敏劑和脂溶性hsp90抑制劑類藥物，所述光敏劑和脂溶性hsp90抑制劑類藥物通過ππ堆積連接形成光敏劑-脂溶性hsp90抑制劑類藥物，光敏劑-脂溶性hsp90抑制劑類藥物裝載于陽離子膠束內(nèi)部疏水腔中。

7、進(jìn)一步地，所述陽離子膠束的粒徑為90～160nm，帶電荷為+15～+30mv；

8、優(yōu)選地，所述陽離子膠束的粒徑為120～160nm；

9、優(yōu)選地，所述陽離子膠束的粒徑為130～150nm；

10、優(yōu)選地，所述陽離子膠束由卵磷脂、聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯和dotap制備得到。

11、進(jìn)一步地，所述光敏劑選自吲哚菁綠、ce6、亞甲藍(lán)、丫啶橙中的一種或多種；

12、所述脂溶性hsp90抑制劑類藥物選自藤黃酸、gedunin、17-dmag中的一種或多種；

13、優(yōu)選地，所述光敏劑與脂溶性hsp90抑制劑類藥物的質(zhì)量比為0.5～1：1.5～3；

14、優(yōu)選地，所述光敏劑選自吲哚菁綠；

15、優(yōu)選地，所述脂溶性hsp90抑制劑類藥物選自藤黃酸。

16、進(jìn)一步地，所述載藥的陽離子膠束還包括hif-1αsirna，hif-1αsirna吸附于陽離子膠束表面；

17、優(yōu)選地，所述陽離子膠束與hif-1αsirna的質(zhì)量比為4～10：1；

18、優(yōu)選地，所述陽離子膠束與hif-1αsirna的質(zhì)量比為4～8：1；

19、優(yōu)選地，所述hif-1αsirna的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

20、本發(fā)明還提供一種所述多功能仿生納米藥物的制備方法，包括以下步驟：

21、(1)將光敏劑和脂溶性hsp90抑制劑類藥物通過ππ堆積連接形成光敏劑-脂溶性hsp90抑制劑類藥物；

22、(2)將光敏劑-脂溶性hsp90抑制劑類藥物、制備陽離子膠束所需的脂質(zhì)材料和第一有機(jī)溶劑混合，然后通過薄膜水化法，制備得到載藥的陽離子膠束；

23、(3)將hif-1αsirna用第二溶劑溶解，然后與步驟(2)得到的載藥的陽離子膠束混合，翻轉(zhuǎn)孵育，得到吸附hif-1αsirna的載藥的陽離子膠束；

24、(4)將吸附hif-1αsirna的載藥的陽離子膠束和腫瘤細(xì)胞膜碎片混合自組裝，即得到權(quán)利要求1所述多功能仿生納米藥物。

25、進(jìn)一步地，步驟(1)中ππ堆積連接形成光敏劑-脂溶性hsp90抑制劑類藥物的方法為：將光敏劑與脂溶性hsp90抑制劑類藥物分別用dmso溶解，混合后超聲處理，最后凍干處理；

26、優(yōu)選地，所述超聲處理的條件為：超聲功率為150～250w，優(yōu)選為190～220w，超聲時間為10～15min，優(yōu)選為11～13min。

27、進(jìn)一步地，步驟(2)中制備陽離子膠束所需的脂質(zhì)材料為卵磷脂、聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯和dotap；

28、步驟(2)中所述第一有機(jī)溶劑為無水乙醇；

29、優(yōu)選地，所述光敏劑-脂溶性hsp90抑制劑類藥物的質(zhì)量和第一有機(jī)溶劑的體積之比為5～10：10～20mg/ml，優(yōu)選為5～7.5mg：10～15mg/ml；

30、優(yōu)選地，所述光敏劑-脂溶性hsp90抑制劑類藥物、卵磷脂、聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯和dotap的質(zhì)量比為1～5：10～50：10～50：3～15；

31、優(yōu)選地，所述光敏劑-脂溶性hsp90抑制劑類藥物、卵磷脂、聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯和dotap的質(zhì)量比為2～4：20～40：20～40：6～12；

32、優(yōu)選地，所述薄膜水化法的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為45～55℃，優(yōu)選為50℃，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)轉(zhuǎn)速為60～80r/min，優(yōu)選為65～75r/min；所述薄膜水化法的水化過程條件為：超純水10～15ml，水化溫度為45～55℃，優(yōu)選為50℃，水化時間為30～60min，優(yōu)選為40～50min。

33、進(jìn)一步地，步驟(3)中所述第二溶劑為depc水溶液；

34、優(yōu)選地，步驟(3)中所述翻轉(zhuǎn)孵育的溫度為2～8℃，優(yōu)選為4～6℃，轉(zhuǎn)速為30～40r/min，時間為4～6h。

35、進(jìn)一步地，步驟(4)中腫瘤細(xì)胞膜碎片的制備方法為：超聲破碎后的細(xì)胞碎片溶液經(jīng)差速離心法提取膜碎片，低速離心溫度為2～8℃，轉(zhuǎn)速為2000～4000r/min，時間為10～15min；高速離心溫度為2～8℃，轉(zhuǎn)速為12000～14000r/min，時間為30～40min；優(yōu)選地，低速離心溫度為4～6℃，轉(zhuǎn)速為2500～3000r/min；高速離心溫度為4～6℃，轉(zhuǎn)速為12500～13000r/min，時間為40～50min。

36、步驟(4)中混合自組裝采取超聲法，超聲功率為150～250w，超聲溫度為4～6℃，超聲時間為10～20min，超聲時間優(yōu)選為14～16min。

37、本發(fā)明還提供所述的多功能仿生納米藥物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

38、進(jìn)一步地，將所述多功能仿生納米藥物注射到患者體內(nèi)，在近紅外光照射下進(jìn)行治療。在本發(fā)明中，所述近紅外光的波長優(yōu)選為800～900nm，更優(yōu)選為808nm。

39、本發(fā)明提供的多功能仿生納米藥物，一方面，光敏劑在激光照射下可產(chǎn)生熱量和ros，同時滿足pdt和ptt治療；脂溶性hsp90抑制劑類藥物通過抑制hsp90的表達(dá)，從而升高rack1與hif-1α的pas-a結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，促進(jìn)hif-1α的降解，細(xì)胞內(nèi)hif-1α含量的降低最終影響細(xì)胞表面pdl1受體的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤免疫檢測點阻滯效果。進(jìn)一步地，吸附于陽離子膠束表面的hif-1αsirna從基因?qū)用嫔弦种颇[瘤細(xì)胞內(nèi)hif-1α的表達(dá)，沉默hif-1α的表達(dá)，與脂溶性hsp90抑制劑類藥物，共同作用調(diào)低細(xì)胞內(nèi)hif-1α的含量，最終影響細(xì)胞表面pdl1受體的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤免疫檢測點阻滯效果。另一方面，hsp90的抑制也會降低gsh的含量，從而gpx4的含量降低，在pdt產(chǎn)生活性氧的情況下引發(fā)腫瘤細(xì)胞鐵死亡。最后，hsp90的抑制也會降低腫瘤細(xì)胞的耐熱能力，實現(xiàn)低溫?zé)岑煟瑴p少對正常組織的損傷，在ptt過程中提升腫瘤熱療的效果。通過ptt和pdt共同作用誘導(dǎo)強(qiáng)烈icd效應(yīng)，最終引起有效的免疫治療。

40、本發(fā)明的有益效果為：

41、本發(fā)明提供一種多功能仿生納米藥物，其包括載藥的陽離子膠束和包裹在載藥的陽離子膠束之外的腫瘤細(xì)胞膜，其中，載藥的陽離子膠束包括陽離子膠束、光敏劑和脂溶性hsp90抑制劑類藥物，所述光敏劑和脂溶性hsp90抑制劑類藥物通過ππ堆積連接形成光敏劑-脂溶性hsp90抑制劑類藥物，光敏劑-脂溶性hsp90抑制劑類藥物裝載于陽離子膠束內(nèi)部疏水腔中，優(yōu)選地，載藥的陽離子膠束還包括hif-1αsirna，hif-1αsirna吸附于陽離子膠束表面。本發(fā)明多功能仿生納米藥物通過主動靶向(同源靶向效應(yīng))和被動靶向(epr效應(yīng))聚集到腫瘤組織周圍，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，在808nm激光照射下光敏劑產(chǎn)生ros氧化合成膠束的脂質(zhì)材料，釋放抗腫瘤藥物，殺死腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明多功能仿生納米藥物能夠使化療藥物和光敏劑有效釋放，精準(zhǔn)地作用于不同位點，改善腫瘤微環(huán)境，引起hsp90以及鐵死亡相關(guān)蛋白的變化，并且在蛋白和基因兩方面共同降低hif-1α的表達(dá)，實現(xiàn)低溫?zé)岑?、鐵死亡、免疫治療多模式聯(lián)合殺傷腫瘤，更好的抑制腫瘤細(xì)胞的生長。并且，本發(fā)明多功能仿生納米藥物對正常細(xì)胞沒有毒副作用，在體內(nèi)容易代謝，具有良好的生物相容性。