本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種長雙歧桿菌菌劑在制備防治脫髓鞘病和調(diào)節(jié)腸道菌群藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、髓鞘是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)由少突膠質(zhì)細胞排列在神經(jīng)元軸突附近包裹產(chǎn)生的多層富含髓磷脂的鞘膜，起到絕緣，保護軸突及神經(jīng)元的作用，并能顯著提高軸突傳遞神經(jīng)信號的效率。中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的動態(tài)變化，被認為可以改變神經(jīng)沖動傳遞的速度和強度，從而提高神經(jīng)元間的同步性，參與調(diào)節(jié)腦功能，被稱為髓鞘可塑性。研究發(fā)現(xiàn)髓鞘可塑性參與大腦的復(fù)雜功能，例如學(xué)習(xí)記憶、情緒、運動和視力等方面(annu?rev?neurosci.2018；41:61-76.)。然而，髓鞘病變脫失則會導(dǎo)致神經(jīng)功能異常，引發(fā)脫髓鞘病。多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis,ms)就是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病，由于累及的區(qū)域不同，癥狀具有多樣性，ms患者可出現(xiàn)運動能力受損、精神異常和認知缺陷等(handb?clin?neurol.2017；145:263-283.)，在我國ms患病率呈逐年上升的趨勢(lancet?reg?health?west?pac.2020；1:100010.)。

2、近年來的研究報道，除了ms外，陸續(xù)在阿爾茨海默病(alzheimer's?disease,ad)(neuron.2021；109(14):2292-2307.e5.；nature.2023；618(7964):349-357.)和重度抑郁癥(major?depressive?disorder,mdd)(j?clin?invest.2022；132(8):e152187.)患者腦內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了髓鞘病變脫失的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)在ad疾病早期就出現(xiàn)脫髓鞘的現(xiàn)象，髓鞘的減少比神經(jīng)元軸突退化出現(xiàn)得更早。在動物實驗中，采用遺傳學(xué)或藥理學(xué)方法修復(fù)髓鞘損傷后，ad小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力得到恢復(fù)(neuron.2021；109(14):2292-2307.e5.)。另一方面，給予抑郁癥小鼠促髓鞘化藥物，發(fā)現(xiàn)能夠有效緩解海馬區(qū)的髓鞘損傷，并顯著改善了小鼠的抑郁樣行為(j?clin?invest.2022；132(8):e152187.)。此外，抗抑郁藥-氯胺酮，可以通過促進少突膠質(zhì)前體細胞分化修復(fù)髓鞘來發(fā)揮抗抑郁作用(mol?psychiatry.2023.)。綜上，以上研究表明，髓鞘變化和認知功能缺陷及抑郁的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，髓鞘損傷脫失是ms、ad和mdd的重要病理特征。因此，維持髓鞘完整性和促進髓鞘健康將對防治脫髓鞘類疾病具有重要意義。

3、雙環(huán)己酮草酰二腙(cuprizone，cpz)可以誘導(dǎo)嚙齒類動物胼胝體，海馬和皮層等多個腦區(qū)髓鞘脫失，表現(xiàn)出認知缺陷、運動能力受損和情緒異常等行為學(xué)變化。能夠模擬ms、ad和mdd的神經(jīng)病理和行為變化，是經(jīng)典的脫髓鞘動物模型。cpz是通過螯合線粒體復(fù)合體iv的銅離子，引起少突膠質(zhì)細胞能量代謝障礙，進而誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細胞死亡發(fā)生脫髓鞘。當停止cpz給藥后，cpz模型小鼠髓鞘可自發(fā)進行恢復(fù)(mol?neurodegener.2022；17(1):34.)。因此，該模型可用于脫髓鞘及髓鞘再生作用機制的研究。

4、研究發(fā)現(xiàn)，ms、ad和mdd患者的腸道微生物群都不同程度出現(xiàn)異常紊亂。臨床上，ms患者的腸道菌群與健康人相比有顯著差異，其中61種細菌存在差異豐度，31種細菌在ms病例中富集，這些異常與血液炎癥標志物直接相關(guān)(genome?med.2023；15(1):1.)。另一項研究則進一步證實，與正常健康人相比，ms患者呼吸甲烷的含量明顯升高，這與觀察到的ms患者腸道甲烷短桿菌屬相對豐度增加一致(nat?commun.2016；7:12015.)。在ad疾病進程中，腸道菌群失衡導(dǎo)致外周血中苯丙氨酸和異亮氨酸的異常增加，進而誘導(dǎo)外周促炎性th1細胞的分化和增殖，并向腦內(nèi)侵潤。入腦的th1細胞和腦內(nèi)固有的m1型小膠質(zhì)細胞共同活化，導(dǎo)致ad相關(guān)神經(jīng)炎癥的發(fā)生(cell?res.2019；29(10):787-803.)。而gv-971在ad中的作用，就是通過重塑腸道菌群平衡、降低外周相關(guān)代謝產(chǎn)物苯丙氨酸/異亮氨酸的積累，減輕腦內(nèi)神經(jīng)炎癥，并減少aβ沉積和tau蛋白的磷酸化，進而改善認知障礙，達到治療ad的效果(cellres.2019；29(10):787-803.)。在抑郁癥方面，mdd患者的微生物組成和代謝物異常變化會導(dǎo)致腸道菌群穩(wěn)態(tài)被破壞，引起腸道屏障功能障礙和炎癥反應(yīng)(cell?mol?gastroenterolhepatol.2021；11(5):1463-1482.)，腸道毒性代謝物則會通過受損腸道屏障導(dǎo)致全身性易位的增加，加劇與抑郁癥發(fā)病機制相關(guān)的全身炎癥反應(yīng)(psychoneuroendocrinology.2018；98:52-60.)。迷走神經(jīng)在抑郁癥患者將微生物信號從腸道傳遞到大腦方面也發(fā)揮著重要作用，在臨床上，迷走神經(jīng)刺激療法已被批準用于治療難治性抑郁癥(am?j?psychiatry.2017；174(7):640-648.)。以上證據(jù)表明，腸道微生物在ms、ad和mdd的發(fā)病機制和進展中具有重要作用。已有的研究表明，益生菌療法對控制ms、ad和mdd的疾病進展具有積極的作用，是調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)干預(yù)治療ms、ad和mdd的一種潛在方法(gut?microbes.2021；13(1):1943289.；int?j?mol?sci.2022；23(9):4494.；frontpsychiatry.2022；13:879491.)。但是，單一的益生菌療法畢竟存在療效不足的局限性。因此，需要開發(fā)更高療效的活體微生物療法。

5、富硒長雙歧桿菌菌劑是一種經(jīng)過富硒發(fā)酵制得的增強型益生菌。長雙歧桿菌菌劑轉(zhuǎn)化硒能夠降低硒毒性和提高硒的生物利用度(biol?trace?elem?res.2020；197(2):599-605.)，硒的加入也會增強長雙歧桿菌菌劑的穩(wěn)定性和抗氧化潛能(j?trace?elem?medbiol.2017；40:1-9.)，二者相互協(xié)同融合或提高各自的功能。但是，目前研究報道的富硒長雙歧桿菌菌劑都是基于其調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)和腸道代謝作用，進一步顯著提升雙歧桿菌的抗腫瘤(asian?pac?j?cancer?prev.2014；15(8):3681-6.)和降血糖作用(r?soc?opensci.2018；5(12):181156.)的療效，以及提高雙歧桿菌原有的改善潰瘍性結(jié)腸炎(frontmicrobiol.2022；13:955112.)和腸易激綜合征(food?funct.2023；14(11):5355-5374.)的作用。

6、目前，尚未見文獻報道富硒長雙歧桿菌菌劑對脫髓鞘防治作用的研究，富硒長雙歧桿菌菌劑對脫髓鞘的預(yù)防和治療作用，以及口服富硒長雙歧桿菌菌劑對脫髓鞘模型中腸道菌群的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。

7、目前尚未有富硒長雙歧桿菌菌劑對髓鞘脫失和髓鞘再生改善的報道，因此本發(fā)明通過引入cpz誘導(dǎo)脫髓鞘模型，來評估富硒長雙歧桿菌菌劑對髓鞘脫失和髓鞘再生的影響。并進一步在app/ps1阿爾茨海默病動物模型進行驗證。最后探討了富硒長雙歧桿菌菌劑對脫髓鞘模型腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明提供了一種長雙歧桿菌菌劑在制備防治脫髓鞘病和調(diào)節(jié)腸道菌群藥物中的應(yīng)用。

2、為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

3、第一方面，本技術(shù)提供一種長雙歧桿菌菌劑在制備防治脫髓鞘病藥物中的應(yīng)用。第二方面，本技術(shù)提供一種長雙歧桿菌菌劑在制備調(diào)節(jié)腸道菌群藥物中的應(yīng)用。第三方面，本技術(shù)提供一種用于防治脫髓鞘病或調(diào)節(jié)腸道菌群的藥物。第四方面，本技術(shù)提供一種提供所述應(yīng)用的藥物的制備方法。

4、本技術(shù)第一方面提供的一種長雙歧桿菌菌劑在制備防治脫髓鞘病藥物中的應(yīng)用。原始菌種名稱：長雙歧桿菌(bifidobacterium?longum)；中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號：cicc?6188。

5、本技術(shù)第二方面提供的一種長雙歧桿菌菌劑在制備調(diào)節(jié)腸道菌群藥物中的應(yīng)用。

6、進一步地，長雙歧桿菌菌劑為富硒長雙歧桿菌菌劑。

7、進一步地，富硒長雙歧桿菌菌劑的制備方法，包括如下步驟：

8、a.配制3l培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph至5.5-7.0，裝入5l發(fā)酵罐；

9、b.在121℃下滅菌20分鐘，然后冷卻至室溫；

10、c.接入種子液30ml-180ml，作為1％-6％的接種量；

11、d.使用20％?naoh溶液控制發(fā)酵ph至5.5-6.5；

12、e.加入過濾除菌的納米硒溶液，使終濃度達到20-50mg/l；

13、f.發(fā)酵8-10小時，期間通氮氣驅(qū)除空氣，并以50ml/h的速度恒速流加30％葡萄糖，制得富硒長雙歧桿菌菌劑。

14、更進一步地，在步驟(e)中，納米硒溶液的制備方法，包括如下步驟：

15、(1)向燒杯中加入穩(wěn)定劑；

16、(2)向燒杯中緩慢加入含有還原劑的水溶液，并在加入過程中保持磁力攪拌，直到穩(wěn)定劑完全溶解；

17、(3)將亞硒酸鈉水溶液緩慢加入到步驟(2)所得的溶液中，在加入過程中，步驟(2)的溶液處于磁力攪拌中；

18、(4)在亞硒酸鈉水溶液加入完畢后，立即使用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph到預(yù)定范圍，然后繼續(xù)磁力攪拌30分鐘，制得紅色的納米硒溶液。

19、進一步地，長雙歧桿菌菌劑用于預(yù)防或抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘，富硒長雙歧桿菌菌劑進一步增強長雙歧桿菌菌劑的抑制效果。脫髓鞘病包括多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默癥或重度抑郁癥中的任意一種。

20、進一步地，長雙歧桿菌菌劑用于促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘再生。

21、更進一步地，長雙歧桿菌菌劑能夠調(diào)節(jié)脫髓鞘動物模型的腸道菌群，減少有害菌群，增加有益菌群，富硒長雙歧桿菌菌劑進一步顯著提升長雙歧桿菌菌劑重塑腸道菌群的能力。

22、進一步地，有害菌群包括desulfovibrio(脫硫弧菌)、christensenellaceae_r-7_group(克里斯滕森菊_r-7)、helicobacter(螺桿菌)、lachnoclostridium(拉克梭狀芽孢桿菌)、oscillibacter(顫桿菌)、anaerotruncus(厭氧棍狀菌)、eisenbergiella(艾森伯格菌)；有益菌群包括dubosiella(杜氏菌)、lactobacillus(乳酸桿菌)、faecalibaculum(糞桿菌)、bifidobacterium(雙歧桿菌)、coriobacteriaceae_ucg-002(科里貝氏菌_ucg-002)、enterorhabdus(腸哈布斯菌)。

23、本技術(shù)第三方面提供一種用于防治脫髓鞘病或調(diào)節(jié)腸道菌群的藥物，包含長雙歧桿菌菌劑或富硒長雙歧桿菌菌劑作為活性成分。

24、本技術(shù)第四方面提供所述應(yīng)用的藥物的制備方法，包括如下步驟：(1)在含長雙歧桿菌的培養(yǎng)液中加入硒，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收取混勻后的菌液，即得到富硒長雙歧桿菌；

25、(2)將富硒長雙歧桿菌與保護劑混合；

26、(3)根據(jù)所需劑型，將富硒長雙歧桿菌重懸于脫脂牛奶加工制成口服液、凍干粉劑或膠囊劑。

27、有益效果：本發(fā)明的長雙歧桿菌菌劑在制備防治脫髓鞘病和調(diào)節(jié)腸道菌群藥物中的應(yīng)用。富硒長雙歧桿菌菌劑及長雙歧桿菌菌劑能預(yù)防或抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘，預(yù)防或改善脫髓鞘模型和阿爾茨海默病模型的行為學(xué)異常，富硒長雙歧桿菌菌劑進一步增強長雙歧桿菌菌劑的抑制效果；富硒長雙歧桿菌菌劑能促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘再生；富硒長雙歧桿菌菌劑及長雙歧桿菌菌劑能調(diào)節(jié)脫髓鞘模型中的腸道菌群，減少有害菌，增加有益菌，富硒長雙歧桿菌菌劑進一步顯著提升長雙歧桿菌菌劑重塑腸道菌群的能力。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

28、(1)髓鞘保護作用：富硒長雙歧桿菌菌劑及長雙歧桿菌菌劑能有效保護或抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘脫失，富硒長雙歧桿菌菌劑進一步增強長雙歧桿菌菌劑的作用效果。

29、(2)促進髓鞘再生：本發(fā)明的富硒長雙歧桿菌菌劑能夠促進脫髓鞘后的髓鞘再生，對受損的神經(jīng)功能恢復(fù)具有積極影響。因此，富硒長雙歧桿菌菌劑能夠用于制備防治脫髓鞘病的藥物。

30、(3)調(diào)節(jié)腸道菌群：富硒長雙歧桿菌菌劑及長雙歧桿菌菌劑能夠調(diào)節(jié)脫髓鞘動物模型的腸道菌群，減少有害菌群，如desulfovibrio(脫硫弧菌)、christensenellaceae_r-7_group(克里斯滕森菊_r-7)等。同時增加有益菌群，如faecalibaculum(糞桿菌)、bifidobacterium(雙歧桿菌)等，從而改善腸道微生物平衡，富硒長雙歧桿菌菌劑進一步顯著提升長雙歧桿菌菌劑重塑腸道菌群的能力。因此，富硒長雙歧桿菌菌劑能夠用于制備改善與調(diào)節(jié)脫髓鞘病腸道菌群的藥物。

31、(4)改善多種行為學(xué)異常：在脫髓鞘模型，富硒長雙歧桿菌菌劑能顯著提高小鼠的運動協(xié)調(diào)能力，優(yōu)于單一的長雙歧桿菌菌劑；此外，富硒長雙歧桿菌菌劑還能顯著改善脫髓鞘模型的認知功能障礙和抑郁樣行為。在阿爾茨海默病模型中，富硒長雙歧桿菌菌劑能顯著提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，緩解阿爾茨海默病小鼠的認知功能缺陷，富硒長雙歧桿菌菌劑進一步增強長雙歧桿菌菌劑的作用效果。提供新的活體微生物療法：與單一的長雙歧桿菌菌劑相比，富硒長雙歧桿菌菌劑在發(fā)揮髓鞘保護和調(diào)節(jié)腸道菌群方面的能力更強，為脫髓鞘病的治療提供了新的療法。

32、(5)安全性和長期服用：長雙歧桿菌菌劑具有良好的安全使用歷史和依從性，已被列入中國《可用于食品菌種名單》和歐盟安全資格認定(qps)名單中，表明其安全性得到認可。富硒長雙歧桿菌菌劑具有很好的安全性，大鼠急性經(jīng)口毒性試驗證明其屬實際無毒級。富硒長雙歧桿菌菌劑兼具藥物和營養(yǎng)功能，具有高安全性，適合長期服用來預(yù)防或治療脫髓鞘病。劑量調(diào)整的靈活性：可以根據(jù)患者的具體情況調(diào)整藥物中活性成分的劑量，以實現(xiàn)最佳的治療效果和安全性。

33、(6)降低醫(yī)療費用：由于富硒長雙歧桿菌菌劑的制備成本較低，使用該菌株作為藥物成分可以在一定程度上減輕病患的醫(yī)療費用。擴展應(yīng)用范圍：本發(fā)明的富硒長雙歧桿菌菌劑在制備防治脫髓鞘病藥物方面的應(yīng)用，擴大了活體微生物藥物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病治療領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。