本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及mir-491-5p在膿毒血癥誘導的急性肺損傷上的應用。

背景技術：

1、膿毒癥是指宿主對感染反應失調(diào)導致的危及生命的器官功能障礙,是一種常見的嚴重臨床疾病,病死率高,盡管在2021年的“拯救膿毒癥運動”推薦了針對膿毒癥患者的個性化治療策略和護理方法,但膿毒癥患者的病死率仍然很高,每年全球約有4890萬膿毒癥病例和1100萬膿毒癥相關性死亡[1]。

2、急性肺損傷(acutelunginjury,ali)或急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratorydistress?syndrome,ards)是膿毒癥的常見臨床并發(fā)癥,是肺泡上皮和肺內(nèi)皮損傷導致肺泡腔中富含蛋白質(zhì)的炎性水腫液積聚的結果。與其他原因引起的ali/ards相比,膿毒癥相關的ali/ards的病死率更高,為30％～40％,主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷、低氧血癥和呼吸窘迫,嚴重危害人類健康,已成為巨大的公共衛(wèi)生負擔。其病理變化主要包括滲出期、康復期和纖維化期3個階段。目前發(fā)病機制尚不是很明確,診斷只是基于共識的綜合征標準,治療尚缺乏特效藥物和具體的治療措施,目前治療重點仍是依靠肺保護性通氣、俯臥位通氣和液體管理來緩解癥狀。最終即使可在ali/ards中存活下來的患者,可留下持續(xù)的功能和(或)心理后遺癥,包括運動受限、心理后遺癥、生活質(zhì)量下降及經(jīng)濟負擔等[1]。一項流行病學調(diào)查納入了我國44個重癥監(jiān)護病房的2322例膿毒癥患者，結果顯示68.2％的膿毒癥患者合并ali，90d病死率達35.5％[2]。

3、目前發(fā)現(xiàn)mir-491-5p具有：靶向folr1抑制乳腺癌細胞增殖及侵襲,可能與改變akt/mtor信號通路相關蛋白表達具有一定相關性[3]；可調(diào)控舌鱗狀細胞癌細胞的增殖和凋亡[4]；通過負向調(diào)控fgfr4抑制肝母細胞瘤細胞增殖和遷移,可能與gsk3β/β-catenin信號通路失活有關[5]等作用。

4、故進一步闡明膿毒癥合并急性肺損傷發(fā)病機制,并積極尋找治療ali的新靶點和方法刻不容緩。

5、參考文獻：

6、[1]薛燕紅,楊秀芬.膿毒癥急性肺損傷的發(fā)病機制及治療進展[j].河北醫(yī)科大學學報,2024,(第4期).

7、[2]劉雨默1,潘郭海容1,梁群1,2.膿毒癥急性肺損傷發(fā)病機制研究進展[j].疑難病雜志,2022,(第8期).

8、[3]朱超,張立功,郭晨旭,殷發(fā)祥,許睿,錢軍.mir-491-5p靶向folr1對乳腺癌細胞增殖及侵襲的影響[j].山西醫(yī)科大學學報,2023,(第10期).

9、[4]湯丹萍,程志剛,鄧少林.mir-491-5p靶向ccl22對舌鱗狀細胞癌細胞增殖及凋亡的影響[j].中國老年學雜志,2021,(第19期).

10、[5]趙天嬌1,耿建磊2,溫嬋3,任慧2,劉鋒2,魏平4.mir-491-5p靶向fgfr4調(diào)節(jié)肝母細胞瘤細胞增殖和遷移[j].中國癌癥防治雜志,2021,(第1期).

技術實現(xiàn)思路

1、針對目前膿毒癥合并急性肺損傷患者病死率高，治療手段有限，本技術研究發(fā)現(xiàn)了抑制mir-491-5p表達可抑制hpaec細胞中的炎性基因表達、抑制炎癥因子分泌、促進hpaec細胞增殖、抑制hpaec細胞遷移、抑制hpaec凋亡，為膿毒癥合并急性肺損傷患者提供了一種新的可能的治療選擇；mir-491-5p高表達可促進炎癥因子水平、促進炎癥因子分泌、抑制hpaec細胞增殖、促進hpaec細胞遷移、促進hpaec凋亡，mir-491-5p高表達可為構建膿毒癥合并急性肺損傷模型提供一種新的可能的方法，為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明具體技術方案如下：

2、第一方面、考察mir-491-5p在膿毒癥患者外周血中的表達

3、分別收取正常人(n＝30)和膿毒癥患者(n＝30)的外周血樣本，使用trizolreagent試劑提取總rna，檢測rna質(zhì)量并進行定量。rt-qpcr檢測mir-491-5p表達水平。

4、結果：膿毒癥患者與正常人外周血樣本中mir-491-5p表達差異顯著，mir-491-5p在膿毒癥患者中高表達。

5、第二方面、考察mir-491-5p在盲腸結扎穿孔模型小鼠外周血中的表達

6、構建c57bl/6j黑色小鼠盲腸結扎穿孔模型(clp)小鼠，分別提取盲腸結扎穿孔模型小鼠和正常小鼠外周血樣本、肺組織、腎組織總rna，rt-qpcr檢測mir-491-5p表達水平。

7、結果：盲腸結扎穿孔模型小鼠和正常小鼠外周血樣本、肺組織、腎組織中的表達差異顯著，p值均小于0.0001，mir-491-5p在盲腸結扎穿孔模型小鼠的外周血樣本、肺組織、腎組織中高表達。

8、第三方面、考察mir-491-5p敲低對炎癥因子水平和肺動脈內(nèi)皮細胞的影響

9、(一)mir-491-5p敲低對促炎基因表達的影響

10、通過將mir-491-5p-inhibitor轉(zhuǎn)染hpaec細胞來抑制mir-491-5p的表達，48h后進行m1誘導，提取總rna，rt-qpcr檢測hpaec細胞中促炎基因il-1β、tnf-α、il-6、cxcl-10、crp轉(zhuǎn)錄表達水平。

11、結論：mir-491-5p敲低抑制了hpaec細胞促炎基因的表達。

12、(二)mir-491-5p敲低對炎癥因子分泌的影響

13、通過將mir-491-5p-inhibitor轉(zhuǎn)染hpaec細胞來抑制mir-491-5p的表達。收取hpaec細胞上清，elisa檢測炎癥因子il-1β、tnf-α、il-6分泌水平。

14、結論：mir-491-5p敲低抑制炎癥因子(il-1β、tnf-α、il-6)分泌。

15、(三)mir-491-5p敲低對hpaec細胞增殖的影響

16、通過將mir-491-5p-inhibitor轉(zhuǎn)染hpaec細胞來抑制mir-491-5p的表達。48h后收樣進行檢測，細胞克隆，edu檢測hpaec細胞的增殖活性。

17、結論：mir-491-5p敲低促進hpaec細胞增殖。

18、(四)mir-491-5p敲低對hpaec細胞遷移的影響

19、通過將mir-491-5p-inhibitor轉(zhuǎn)染hpaec細胞來抑制mir-491-5p的表達。48h后收樣進行檢測，通過劃痕和transwell-migration實驗檢測hpaec細胞的遷移活性。

20、結論：mir-491-5p敲低促進hpaec細胞遷移。

21、(五)mir-491-5p敲低對hpaec凋亡的影響

22、通過將mir-491-5p-inhibitor轉(zhuǎn)染hpaec細胞來抑制mir-491-5p的表達。48h后收樣進行檢測，通過tunel實驗檢測hpaec細胞的凋亡活性。

23、結論：mir-491-5p敲低抑制hpaec凋亡。

24、第四方面、考察mir-491-5p高表達對炎癥因子水平和肺動脈內(nèi)皮細胞的影響

25、(一)mir-491-5p高表達對促炎基因表達的影響

26、通過將mir-491-5p-mimic轉(zhuǎn)染hpaec細胞來升高mir-491-5p的表達。48h后進行m1誘導，rt-qpcr檢測hpaec細胞促炎基因(il-1β、tnf-α、il-6、cxcl10、crp)的表達。

27、結論：mir-491-5p高表達促進炎癥因子水平。

28、(二)mir-491-5p高表達對炎癥因子分泌的影響

29、通過將mir-491-5p-mimic轉(zhuǎn)染hpaec細胞來升高mir-491-5p的表達。48h后收取hpaec細胞上清，elisa檢測炎癥因子il-1β、tnf-α、il-6分泌水平。

30、結論：mir-491-5p高表達促進炎癥因子分泌。

31、(三)mir-491-5p高表達對hpaec細胞增殖的影響

32、通過將mir-491-5p-mimic轉(zhuǎn)染hpaec細胞來升高mir-491-5p的表達。細胞克隆、edu檢測hpaec細胞的增殖活性。

33、結論：mir-491-5p高表達抑制hpaec細胞增殖。

34、(四)mir-491-5p高表達對hpaec細胞遷移的影響

35、通過將mir-491-5p-mimic轉(zhuǎn)染hpaec細胞來升高mir-491-5p的表達。通過劃痕、transwell-migration檢測hpaec細胞的遷移活性。

36、結論：mir-491-5p高表達抑制hpaec細胞遷移。

37、(五)mir-491-5p高表達對hpaec凋亡的影響

38、通過將mir-491-5p-mimic轉(zhuǎn)染hpaec細胞來升高mir-491-5p的表達。通過tunel實驗檢測hpaec細胞的凋亡活性。

39、結論：mir-491-5p高表達促進hpaec凋亡。

40、與現(xiàn)有技術相比，本技術的有益效果在于：

41、本技術首次發(fā)現(xiàn)mir-491-5p在膿毒癥患者和盲腸結扎穿孔模型小鼠外周血中高表達；抑制mir-491-5p表達可抑制hpaec細胞中的炎性基因表達、抑制炎癥因子分泌、促進hpaec細胞增殖、促進hpaec細胞遷移、抑制hpaec凋亡；mir-491-5p高表達可促進炎癥因子水平、促進炎癥因子分泌、抑制hpaec細胞增殖、抑制hpaec細胞遷移、促進hpaec凋亡。

42、綜上，抑制mir-491-5p表達為膿毒癥合并急性肺損傷的治療提供了一種新的可能的治療手段；mir-491-5p高表達可為構建膿毒癥合并急性肺損傷模型提供一種新的可能的方法。