本發(fā)明涉及凍干制劑,具體涉及一種活性穩(wěn)定的外泌體凍干制劑及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù):
1、外泌體是細(xì)胞外囊泡(extracellular?vesicles,?evs)中的一類(lèi),并且是尺寸最小的一類(lèi)。ev是一類(lèi)幾乎所有類(lèi)型細(xì)胞都可分泌的,源于內(nèi)吞作用的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的,包含母細(xì)胞成分的胞外小體。依據(jù)其大小、來(lái)源、功能等不同,可將ev分為3類(lèi):外泌體(exosome,30-150nm)、核外顆粒體(ectosome,100nm-1μm)和凋亡小體(apoptotic?body,50nm-5μm)。結(jié)構(gòu)上,外泌體具有典型的脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu),包圍著水溶性介質(zhì),介質(zhì)中含有多種生物學(xué)分子,包括核酸、多肽、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等。目前在外泌體中已有近10萬(wàn)種蛋白質(zhì)和超過(guò)1000種脂質(zhì)被記錄。這些組分在細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)通訊中發(fā)揮著重要作用,具有傳遞遺傳信息、調(diào)節(jié)生理功能等特性。外泌體存在于多種生物體液中,包括血液、尿液、唾液、母乳、羊水、滑膜、腦脊液、眼淚等。外泌體的功能取決于其所來(lái)源的細(xì)胞類(lèi)型,其可參與到機(jī)體免疫應(yīng)答、抗原提呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲等方面。
2、隨著外泌體應(yīng)用的拓展,如何安全有效地保存外泌體變得非常重要。目前關(guān)于外泌體的存儲(chǔ)共識(shí)是,外泌體可在2-8℃穩(wěn)定短暫保存;為了維持外泌體的結(jié)構(gòu)完整性及生物活性,須保存在低溫條件下,-20℃保存1個(gè)月左右,其活性會(huì)有顯著改變;-80℃也只能保存3-6個(gè)月,并且不能反復(fù)凍融。外泌體穩(wěn)定性低、容易失活,存儲(chǔ)條件要求高,穩(wěn)定保存時(shí)間短,這些缺點(diǎn)影響了外泌體的運(yùn)輸、存儲(chǔ)以及應(yīng)用。
3、凍干技術(shù)為外泌體保存提供了新的選擇。冷凍干燥過(guò)程在低溫下進(jìn)行,不會(huì)使蛋白質(zhì)、微生物等熱敏性的物質(zhì)變性或失去生物活力。同時(shí),微生物的生長(zhǎng)和酶的作用無(wú)法進(jìn)行,因而能保持原來(lái)的性狀。目前已有文獻(xiàn)和專(zhuān)利將外泌體制備為凍干粉?,F(xiàn)有的一些專(zhuān)利或?qū)@暾?qǐng)方案中,“一種人間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體凍干粉的制備方法、使用方法”(公開(kāi)號(hào)為cn107245472a)采用單組分甘露醇作為保護(hù)劑;“一種制備人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體凍干粉的方法”(公開(kāi)號(hào)為cn104488850a)和“人脂肪干細(xì)胞來(lái)源的外泌體凍干粉及其制備方法和應(yīng)用”(公開(kāi)號(hào)為cn110193025a)均采用單組分的海藻糖作為外泌體的保護(hù)劑。其他申請(qǐng)的專(zhuān)利中采用復(fù)合組分的保護(hù)劑如富血小板因子、白蛋白、甘氨酸、賴(lài)氨酸、甘油、明膠水解物、精氨酸、蔗糖、山梨醇、神經(jīng)酰胺等成分的組合。在這些專(zhuān)利中采用的單一組分或多組分的凍干保護(hù)劑無(wú)法有效保證外泌體在凍干前后的完整性及生物學(xué)功能,仍然存在缺陷不足。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明提供一種外泌體凍干粉及其制備方法和應(yīng)用,以緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的凍干保護(hù)劑無(wú)法有效的維持外泌體凍干后完整性及生物活性的問(wèn)題;本發(fā)明的凍干粉活性穩(wěn)定,刺激反應(yīng)小,并且生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單,易于實(shí)現(xiàn)。
2、本發(fā)明的第一方面,提供一種外泌體凍干粉,由外泌體溶液和凍干保護(hù)液混合后經(jīng)過(guò)冷凍干燥制得,以各物質(zhì)在混合后溶液中的濃度計(jì),所述外泌體溶液為0.1%~10%v/v,凍干保護(hù)液包括糖類(lèi)0.4%~4%w/v及醇類(lèi)0.25%~4%w/v;所述糖類(lèi)為海藻糖、蔗糖或乳糖中的任一種;所述醇類(lèi)為甘露醇、山梨醇或者甘露醇與聚乙二醇的組合;溶劑為滅菌注射用水或pbs緩沖液。
3、優(yōu)選地,所述糖類(lèi)為海藻糖,所述醇類(lèi)為甘露醇與聚乙二醇的組合,所述聚乙二醇為peg4000,所述溶劑為滅菌注射用水。
4、可選地,所述凍干保護(hù)液還包括蛋白類(lèi)物質(zhì)0.1%~0.5%w/v。
5、可選地,所述蛋白類(lèi)物質(zhì)包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、重組人血清白蛋白中的一種或多種。
6、優(yōu)選地,所述蛋白類(lèi)物質(zhì)為人血清白蛋白。
7、可選地,所述外泌體溶液中的外泌體為間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體。
8、本發(fā)明的第二方面,提供上述的外泌體凍干粉的制備方法,包括以下步驟:
9、a.按各物質(zhì)的組分比例稱(chēng)取凍干保護(hù)液的各組分原料;
10、b.將以上原料在溶劑中溶解,經(jīng)過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌,得到凍干保護(hù)劑溶液;
11、c.取外泌體溶液與所述的凍干保護(hù)劑溶液混合均勻,作為凍干前溶液;
12、d.將所述的凍干前溶液分裝到無(wú)菌西林瓶中,真空冷凍干燥后,得到外泌體凍干粉。
13、可選地,步驟d中所述的真空冷凍干燥包括:
14、d1.預(yù)凍:溫度為-30~-50℃,設(shè)定時(shí)間1~3h,持續(xù)時(shí)間2~5h,目標(biāo)真空度:1000mbar;
15、d2.預(yù)抽真空:0.15mabr,報(bào)警真空:0.8mbar,預(yù)抽真空持續(xù)時(shí)間:60s;
16、d3.升華干燥:溫度為-10~-25℃,設(shè)定時(shí)間1~4h,持續(xù)時(shí)間18~28h,目標(biāo)真空度:0.1~0.15mbar;
17、d4.解析干燥:溫度為20~25℃,設(shè)定時(shí)間3~8h,持續(xù)時(shí)間8~20h,目標(biāo)真空度:0~0.1mbar。
18、本發(fā)明的第三方面,提供一種外泌體精華液或外泌體面膜,包括上述的外泌體凍干粉或上述的制備方法制得的外泌體凍干粉、復(fù)溶溶劑、保濕劑及皮膚調(diào)理劑。
19、可選地,所述保濕劑包括0.1%~2%?w/v丙二醇和0.5%~5%?w/v甘油,所述皮膚調(diào)理劑包括0.1%~0.5%?w/v透明質(zhì)酸鈉和1%~3%?w/v煙酰胺,所述復(fù)溶溶劑為注射用水。
20、本發(fā)明的第四方面,提供上述的外泌體精華液或外泌體面膜的制備方法,包括:
21、1)制備精華原液或面膜原液:稱(chēng)取保濕劑、皮膚調(diào)理劑,加入至復(fù)溶溶劑中,攪拌溶解,得到精華原液或面膜原液;
22、2)將所述精華原液或面膜原液倒入外泌體凍干粉中,搖晃至完全溶解,得到外泌體精華液或外泌體面膜。
23、本發(fā)明的第五方面,提供上述的外泌體凍干粉或上述的制備方法制得的外泌體凍干粉在制備護(hù)膚品或化妝品中的應(yīng)用。
24、本發(fā)明的外泌體凍干粉,其溶液成分與配制比例經(jīng)過(guò)研發(fā)和優(yōu)化,能夠有效的維持外泌體凍干后完整性及生物活性;制得的外泌體凍干粉活性穩(wěn)定,且其不含防腐劑等刺激性原料,刺激性小、安全性好;并且具有良好的促成纖維細(xì)胞增殖的能力,將外泌體凍干粉應(yīng)用于醫(yī)美行業(yè),例如制備形成外泌精華液或面膜,經(jīng)測(cè)定其外泌體活性依舊保持穩(wěn)定,可知本發(fā)明的外泌體凍干粉對(duì)于皮膚抗皺、抗衰老均具有較好的效果,應(yīng)用前景較好。更具體地,經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,采用本發(fā)明的外泌體凍干保護(hù)液對(duì)外泌體進(jìn)行凍干,在凍干前后外泌體粒徑及濃度不會(huì)發(fā)生明顯變化,說(shuō)明本發(fā)明的凍干保護(hù)液可以有效減少外泌體在凍干過(guò)程中的聚集或破裂及顆粒數(shù)的減少;對(duì)凍干前后外泌體的表面特異性標(biāo)志蛋白(cd9、cd63、cd81)進(jìn)行檢測(cè),各標(biāo)志蛋白均有明顯表達(dá),說(shuō)明凍干后外泌體表面分子標(biāo)志物組成未發(fā)生明顯變化;將凍干后的外泌體進(jìn)行成纖維細(xì)胞增殖活性檢測(cè),相比于外泌體新鮮原液組,凍干粉與外泌體新鮮原液的促增殖活性一致,說(shuō)明本發(fā)明的外泌體凍干粉保護(hù)液能夠在凍干過(guò)程中有效保護(hù)外泌體的生物活性。