本發(fā)明屬于納米材料領(lǐng)域，具體涉及一種植物介導(dǎo)綠色合成銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶的方法。

背景技術(shù)：

1、納米二氧化鈰具有可逆的ce3+/ce4+氧化還原對，表現(xiàn)出多種類酶催化性能，被認(rèn)為是一種很有前途的納米酶，具有疾病診斷和治療的潛力。氧化鈰納米粒子的表面化學(xué)對其酶活性至關(guān)重要，豐富的表面缺陷和大表面積可以提供足夠的表面活性位點(diǎn)，從而提供明顯的過氧化物酶樣活性。據(jù)報道，具有低水平的氧空位結(jié)構(gòu)缺陷的納米氧化鈰由于其對底物的弱親和力以及產(chǎn)生活性氧物質(zhì)的低活化能力而產(chǎn)生較差的活性。一般來說，氧空位結(jié)構(gòu)缺陷的豐度表現(xiàn)出明顯的尺寸依賴性，其中尺寸較小的氧化鈰納米粒子總是引入更多的氧空位。然而，小尺寸的納米氧化鈰由于高比表面能易于團(tuán)聚。

2、研究表明，載體型復(fù)合納米材料可通過克服金屬氧化物納米粒子的團(tuán)聚調(diào)節(jié)其理化性質(zhì)，同時載體-金屬氧化物之間的界面相互作用，可增強(qiáng)納米酶的反應(yīng)活性和穩(wěn)定性。凹凸棒石是結(jié)構(gòu)獨(dú)特的天然一維黏土礦物，具有獨(dú)特的孔道結(jié)構(gòu)和表面硅羥基團(tuán)，一方面可為納米顆粒提供成核位點(diǎn)，另一方面可為納米酶提供一個高度集中的底物微環(huán)境，利于底物的吸附和轉(zhuǎn)運(yùn)，可作為調(diào)控納米氧化鈰類酶活性的載體。此外，通過金屬摻雜也是優(yōu)化氧化鈰納米粒子酶活性的重要策略。納米銀是目前技術(shù)較為成熟的抗菌材料之一，銀作為摻雜劑通?？梢哉{(diào)節(jié)金屬氧化物的表面性質(zhì)和催化性能。但是由于鈰離子和銀離子的氧化還原電位存在巨大差異，導(dǎo)致銀和氧化鈰復(fù)合材料的制備方法復(fù)雜繁瑣，效率低下，有待于進(jìn)一步提升和改進(jìn)。

3、植物介導(dǎo)的綠色合成方法具有清潔環(huán)保，產(chǎn)物綠色安全的優(yōu)勢，近年來備受關(guān)注。植物提取物通常含有具有豐富功能基團(tuán)（例如羥基、羧基、氨基等）的活性生物分子，例如黃酮類、多酚類等。這些活性成分不僅可以和金屬離子形成配合物，而且能夠起到還原和穩(wěn)定納米顆粒的作用，在制備多金屬或金屬氧化物復(fù)合納米粒子方面具有優(yōu)勢，可實現(xiàn)多金屬基納米粒子的一鍋合成，大大簡化合成工藝，避免了中間環(huán)節(jié)復(fù)雜的后處理操作，極大地提高了生產(chǎn)效率。天然植物金銀花是一種常綠纏繞型灌木，分布廣泛。金銀花是一種具有悠久歷史的常用中藥，含有豐富的綠原酸、異綠原酸和木犀草素等藥理活性成分，具有抗菌、消炎、抗氧化性、清熱解毒的功效。金銀花的酚酸和黃酮類物質(zhì)具有豐富的酚羥基結(jié)構(gòu)，能夠螯合和還原金屬離子，可作為天然試劑綠色合成金屬及金屬氧化物納米顆粒。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種植物介導(dǎo)綠色合成銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶的方法。采用植物介導(dǎo)綠色合成技術(shù)，以凹凸棒石為載體，通過載體界面作用和銀納米粒子協(xié)同調(diào)控氧化鈰納米粒子的類酶催化活性，調(diào)控反應(yīng)條件一鍋合成銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶。制備過程清潔環(huán)保，簡單易操作，產(chǎn)物安全性高，并具有ph響應(yīng)的高效殺菌能力和自由基清除活性。

2、一、銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶的制備及表征

3、本發(fā)明提供了一種植物介導(dǎo)綠色合成銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶的方法，包括如下步驟：

4、將新鮮金銀花清洗干凈，陰涼干燥后磨粉，加水55~75℃水浴提取1~2h，過濾得到金銀花提取物；將凹凸棒石粉末超聲分散到去離子水得到凹凸棒石懸浮液，加入硝酸鈰和硝酸銀，攪拌均勻后加入金銀花提取液得到前驅(qū)體混合液；向上述前驅(qū)體混合液中慢速滴加氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph后加熱至55~80℃反應(yīng)2~5h，所得產(chǎn)物離心后用去離子水洗滌三次，真空干燥后，研磨過200目篩；產(chǎn)物轉(zhuǎn)入管式爐，在氮?dú)鈿夥障?00~500℃煅燒1~3h得到銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶。

5、所述金銀花粉末與水的固液比為1:10~1:100（g/ml）。所述凹凸棒石懸浮液的固液比為1:6~1:60（g/ml）。所述金銀花提取物與凹凸棒石懸浮液的體積比為1:1~5:1。

6、所述硝酸鈰中的鈰離子與凹凸棒石的質(zhì)量比為1:2.5~1:12；硝酸銀中的銀離子與硝酸鈰中的鈰離子的摩爾比為1:1~1:30。

7、所述ph調(diào)節(jié)劑為0.5~5mol/l氫氧化鈉，反應(yīng)體系ph為8~11。真空干燥是在室溫下干燥20~25h。

8、本發(fā)明的合成機(jī)理為：以金銀花提取物中的酚酸和黃酮類物質(zhì)為還原劑和穩(wěn)定劑，凹凸棒石為載體，綠色合成銀-氧化鈰-凹凸棒石復(fù)合納米酶。銀的氧化還原電位為+0.8v，因此銀離子能被酚酸和黃酮類物質(zhì)直接還原，三價鈰離子易于酚酸絡(luò)合形成鈰配合物，經(jīng)過熱解后可生成氧化鈰。此外，本發(fā)明通過凹凸棒石納米棒晶的界面作用和銀納米粒子協(xié)同調(diào)控氧化鈰納米粒子的類酶催化活性，使制備的三元復(fù)合納米酶具有了ph響應(yīng)的過氧化物類酶活性和超氧化物歧化酶活性。

9、圖1為本發(fā)明實施例1合成的銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶的xrd圖譜，圖中除了凹凸棒石的特征衍射峰（2 θ=?8.5°、13.9°、19.8°、20.7°等）外，在2 θ為28.5°、33.1°、47.4°和56.3°處的衍射峰，分別對應(yīng)氧化鈰的(111)、(200)、(220)和(311)晶面，在2 θ為38.1°、44.2°、64.4°和77.5°處的衍射峰，分別對應(yīng)銀的(111)、(200)、(220)和(311)晶面，表明在凹凸棒石納米棒晶表面成功負(fù)載了氧化鈰和銀納米顆粒。

10、圖2為實施例1合成的銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶的tem圖像，從圖中可以很清楚地

11、看到，凹凸棒石納米棒晶表面上負(fù)載有均勻分散的納米顆粒；高分辨圖像分析顯示，氧化鈰納米顆粒粒徑約為3nm，銀納米顆粒粒徑約為5nm，顆粒分布均勻，分散性良好，此結(jié)果進(jìn)一步表明銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶的成功制備。

12、圖3為實施例1合成的銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶的ftir圖譜，在2924.2cm-1和2853.7cm-1處出現(xiàn)了甲基和羥基的吸收峰，說明煅燒后納米顆粒表面仍然存在植物活性成分，這有利于納米顆粒的穩(wěn)定；486cm?1處為金屬-氧鍵相對應(yīng)的強(qiáng)吸收帶，表明氧化鈰的形成。

13、二、銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶的酶活性評價

14、采用tmb評價過氧化物酶活性，簡單地，一定量樣品（3mg/ml）在醋酸-醋酸鈉緩沖液中與tmb?（0.5?mmol/l）和h2o2（0.5mmol/l）在室溫（27°c）下孵育，檢測所得混合物在不同時間點(diǎn)的吸光度（652nm）。通過調(diào)變h2o2的濃度采集動力學(xué)參數(shù)。采用超氧化物歧化酶活性檢測試劑盒按照說明書操作評價納米酶對超氧化物陰離子的抑制作用。圖4?為銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶的過氧化物酶活性評價結(jié)果，由圖可知，該納米酶具有優(yōu)異的過氧化物酶活性，并在ph小于4時活性最強(qiáng)；圖5為表明該納米酶能夠產(chǎn)生豐富的羥基自由基。圖6為銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶的超氧化物歧化酶活性評價結(jié)果，表明該納米酶表現(xiàn)出ph依賴的超氧化物歧化酶活性，在ph大于6時具有最佳酶活性。

15、三、銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶的抗菌活性

16、實施例制備的銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶的抗菌性能，以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（mrsa）和產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌（esbls- e.?coli）為測試菌種，采用平板計數(shù)法來評價，測試方法為：1）以培養(yǎng)皿上復(fù)蘇的esbls- e.?coli和mrsa以pbs配制0.5?mcf的菌懸液，此時菌懸液濃度約為1.5×108cfu/ml；將菌懸液稀釋100倍，使最終菌懸液的濃度約為1×106cfu/ml；2）向96孔板的孔中加入20μl待測樣分散液和50ml緩沖液（ph3.7），每孔中加入10μl?h2o2（h2o2最終濃度為100μm），加入20μl菌懸液；輕打混勻后，放入37°c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h；培養(yǎng)結(jié)束后分別吸取共培養(yǎng)液20?μl培養(yǎng)液涂布接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，放入37°c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24h，計數(shù)。3）培養(yǎng)結(jié)束后吸取共培養(yǎng)液20μl培養(yǎng)液涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24h，計數(shù)菌落。實施例1-5中的銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶的抗菌性能評價結(jié)果見表1，可以看出，本發(fā)明所制備復(fù)合納米酶對革蘭氏陽性mrsa和革蘭氏陰性esbls- e.?coli兩種耐藥菌的抑制率均在90%以上，說明本發(fā)明制備的銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶對esbls- e.?coli和mrsa具有高效的抗菌活性。

17、

18、二、銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶的抗氧化性能

19、實施例制備的銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶的抗氧化性能，采用水楊酸法進(jìn)行評價。具體地，將1ml濃度為6mmol/l的七水硫酸鐵，1ml濃度為9mmol/l水楊酸乙醇溶液和1ml不同濃度的樣品（0.1~5?mg/ml）添加到10ml試管中，然后添加0.1ml過氧化氫（0.3%），和1ml超純水啟動反應(yīng)。然后將試管置于37°c水浴中30?min，在510nm處測定吸光度。用超純水代替樣品作為空白組，用0.1?ml超純水代替h2o2作為對照組。每組測定重復(fù)三次。圖7表明本發(fā)明制備的銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶具有優(yōu)異的羥基自由基清除活性。

20、綜上所述，本發(fā)明采用植物介導(dǎo)綠色合成銀-氧化鈰-凹凸棒石多功能復(fù)合納米酶具有以下優(yōu)點(diǎn)：

21、1、以天然植物提取物為還原劑和穩(wěn)定劑，實現(xiàn)銀和氧化鈰復(fù)合納米粒子的一鍋制備，清潔環(huán)保，工藝簡單，產(chǎn)物安全性高，穩(wěn)定性好，屬于一種清潔綠色的制備方法。

22、2、本發(fā)明通過凹凸棒石納米棒晶的界面作用和銀納米粒子協(xié)同調(diào)控氧化鈰納米粒子的類酶催化活性，有效增強(qiáng)了氧化鈰的類酶催化性能，制得納米酶具有ph響應(yīng)的抗菌和抗氧化雙重功效。