本發(fā)明涉及醫(yī)用生物材料，具體涉及一種制備脫細(xì)胞脂肪基質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：

1、軟組織缺損包括皮膚、脂肪、肌肉和其他結(jié)締組織的缺損，主要由創(chuàng)傷、腫瘤切除、衰老和其他手術(shù)所導(dǎo)致。這些損傷往往過大，無法自行正常愈合，患者生活質(zhì)量因功能喪失而下降，并給醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。臨床上通常采用皮瓣或肌皮瓣移植、脂肪移植來解決輪廓異常和軟組織缺損。然而皮瓣和肌皮瓣的移植存在供區(qū)異常、功能喪失和移植失敗的缺點(diǎn)。脂肪組織雖然具有獲取方便、富含脂肪干細(xì)胞(adipose-derived?stemcells,ascs)的優(yōu)點(diǎn)，但是，脂肪移植存在一定的局限性，如自體脂肪組織移植后其成活率和體積填充的效果是不可預(yù)測(cè)的，自體脂肪組織由于需從自身抽取、存在脂肪保存困難、部分個(gè)體來源受限等問題，異體脂肪移植則存在免疫原性等問題。

2、脫細(xì)胞脂肪基質(zhì)(decellularized?adipose?tissue,dat)是脂肪組織通過物理/化學(xué)/生物等一系列處理后有效去除含免疫原性的細(xì)胞成分，獲得的無細(xì)胞成分的細(xì)胞外基質(zhì)。dat具有良好的生物相容性，即使異體移植也幾乎不會(huì)產(chǎn)生組織排斥和過敏反應(yīng)。dat富含膠原蛋白和糖胺聚糖(glycosaminoglycan,gag)，可模擬天然細(xì)胞微環(huán)境，支持脂肪、血管和神經(jīng)等組織的定向誘導(dǎo)和再生，對(duì)細(xì)胞的黏附、遷移、增殖、分化以及基因表達(dá)方面起重要的調(diào)控作用，尤其是干細(xì)胞增殖和譜系特異性分化。脫細(xì)胞基質(zhì)可保留其固有的形狀構(gòu)象，也可被加工成新的結(jié)構(gòu)。保留其原始結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)材料，提供了完整的血管系統(tǒng)、其衍生組織的精確模型以及良好的機(jī)械強(qiáng)度。

3、傳統(tǒng)制備dat的方法有物理法、化學(xué)法、生物酶法和聯(lián)合法。物理法主要包括凍融法、高水壓法和超臨界二氧化碳法。雖然物理法相對(duì)溫和，能夠保留脫細(xì)胞基質(zhì)的有效成分，對(duì)物理結(jié)構(gòu)也損傷較小，但單獨(dú)使用不能完全去除細(xì)胞成分和遺傳物質(zhì)，需要與其他方法聯(lián)合使用。化學(xué)法是通過溶解細(xì)胞膜的磷脂成分而達(dá)到脫細(xì)胞效果，常用的化學(xué)試劑包括十二烷基硫酸鈉(sodium?dodecyl,sds)、脫氧膽酸鈉(sodium?deoxycholate,sd)和triton-100等?；瘜W(xué)試劑可以實(shí)現(xiàn)較強(qiáng)的脫細(xì)胞作用，但容易殘留或者凝集在脫細(xì)胞材料上。為了減少殘留物的影響，需要額外增加洗滌時(shí)間，這不僅降低脫細(xì)胞效率，而且在反復(fù)洗滌過程中g(shù)ag和生長(zhǎng)因子的含量隨之減少，影響細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)能力。生物酶法是利用酶的水解作用去除細(xì)胞成分或切斷細(xì)胞與基質(zhì)之間連接的肽鍵。常用的生物酶有胰蛋白酶、核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶和脂肪酶。胰蛋白酶可以直接用于去除組織上的細(xì)胞成分，并且作用效果會(huì)隨時(shí)間而增加，但長(zhǎng)時(shí)間處于胰蛋白酶的環(huán)境下會(huì)降低脫細(xì)胞基質(zhì)中彈性蛋白和gag含量。核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶常與化學(xué)試劑sds或sd聯(lián)合使用，有助于在化學(xué)試劑破壞細(xì)胞膜釋放出遺傳物質(zhì)后，進(jìn)一步水解細(xì)胞核物質(zhì)，但核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶會(huì)對(duì)dat的表面結(jié)構(gòu)造成損傷，影響細(xì)胞的黏附和增殖。

4、因此，優(yōu)化dat制備工藝以便獲得脫細(xì)胞更加徹底、無免疫原性、無細(xì)胞毒性、生物相容性好的dat是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種制備脫細(xì)胞脂肪基質(zhì)的方法，要解決的技術(shù)問題是更完整保留細(xì)胞外基質(zhì)的成分。

2、為解決上述問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種制備脫細(xì)胞脂肪基質(zhì)的方法，所述方法包括如下步驟：

3、1)提供脂肪組織原料；

4、2)將所述脂肪組織原料進(jìn)行凍融處理，得到凍融處理后脂肪組織；

5、3)將所述凍融處理后脂肪組織進(jìn)行胰蛋白酶第一處理以去除細(xì)胞，得到胰蛋白酶第一處理后脂肪組織；

6、4)將所述胰蛋白酶第一處理后脂肪組織進(jìn)行萃取第一處理，清洗、瀝干，得到萃取第一處理后脂肪組織；

7、5)將所述萃取第一處理后脂肪組織進(jìn)行胰蛋白酶第二處理以進(jìn)一步去除細(xì)胞，清洗、瀝干，得到胰蛋白酶第二處理后脂肪組織；

8、6)將所述胰蛋白酶第二處理后脂肪組織進(jìn)行水解處理，清洗、瀝干，得到水解處理后脂肪組織；

9、7)將所述水解處理后脂肪組織進(jìn)行萃取第二處理，清洗、瀝干，得到所述的脫細(xì)胞脂肪基質(zhì)。

10、優(yōu)選地，在步驟4)、5)、6)、7)中，清洗處理所采用的清洗液包含na2hpo4、kh2po4、苯甲磺酰氟、青霉素和鏈霉素。

11、優(yōu)選地，在步驟1)中，提供脂肪組織原料的步驟包括：將得到的脂肪組織置于補(bǔ)充有1％-2％的牛血清白蛋白的無菌pbs中，并冷藏運(yùn)輸。

12、優(yōu)選地，在步驟2)中，凍融處理所采用的凍融溶液含有苯甲磺酰氟、青霉素和鏈霉素；和/或

13、在步驟3)和5)中，胰蛋白酶第一處理和胰蛋白酶第二處理所采用的胰蛋白酶處理液含有苯甲磺酰氟、青霉素和鏈霉素；和/或

14、在步驟4)和7)中，萃取第一處理和萃取第二處理所采用的萃取液還含有苯甲磺酰氟、青霉素和鏈霉素；和/或

15、在步驟6)中，水解處理所采用的水解液還含有苯甲磺酰氟、青霉素和鏈霉素。

16、優(yōu)選地，在步驟2)中，凍融處理包括：-80℃以下冷凍1～2h，再升溫至25～37℃，重復(fù)3-5次。

17、優(yōu)選地，胰蛋白酶第一處理和胰蛋白酶第二處理在溫度25～37℃下進(jìn)行，時(shí)間為8～16h。

18、優(yōu)選地，在步驟4)和7)中，萃取第一處理和萃取第二處理所采用的萃取液含有異丙醇。

19、優(yōu)選地，在步驟4)和7)中，萃取第一處理和萃取第二處理在25～37℃下進(jìn)行，時(shí)間為8～16h。

20、優(yōu)選地，在步驟6)中，水解處理所采用的水解液含有脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶和脂肪酶。

21、優(yōu)選地，在步驟6)中，水解處理在在25～37℃下進(jìn)行，時(shí)間為16～24h。

22、優(yōu)選地，在步驟7)中，得到所述的脫細(xì)胞脂肪基質(zhì)經(jīng)過凍干處理。

23、本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明所提供的制備脫細(xì)胞脂肪基質(zhì)的方法，與傳統(tǒng)方法相比，脫細(xì)胞脂肪基質(zhì)潔凈無雜質(zhì)，物理性能優(yōu)，機(jī)械性能佳，更能保留細(xì)胞外基質(zhì)的成分完整，具有顯著的生物相容性，免疫原性低，還能保留更多的生物活性成分(主要為細(xì)胞因子)更加利于發(fā)揮生物學(xué)功能，能夠較好地應(yīng)用于軟組織缺損修復(fù)和促進(jìn)創(chuàng)面愈合，并有望在建立dat新工藝的基礎(chǔ)上并為軟組織缺損和慢性創(chuàng)面愈合的治療提供新策略。

24、以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

技術(shù)特征：

1.一種制備脫細(xì)胞脂肪基質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟4)、5)、6)、7)中，清洗處理所采用的清洗液包含na2hpo4、kh2po4、苯甲磺酰氟、青霉素和鏈霉素。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟2)中，凍融處理所采用的凍融溶液含有苯甲磺酰氟、青霉素和鏈霉素；和/或

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟2)中，凍融處理包括：-80℃以下冷凍1～2h，再升溫至25～37℃，重復(fù)3-5次。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，胰蛋白酶第一處理和胰蛋白酶第二處理在溫度25～37℃下進(jìn)行，時(shí)間為8～16h。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟4)和7)中，萃取第一處理和萃取第二處理所采用的萃取液含有異丙醇。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟4)和7)中，萃取第一處理和萃取第二處理在25～37℃下進(jìn)行，時(shí)間為8～16h。

8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟6)中，水解處理所采用的水解液含有脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶和脂肪酶。

9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟6)中，水解處理在在25～37℃下進(jìn)行，時(shí)間為16～24h。

10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟7)中，得到所述的脫細(xì)胞脂肪基質(zhì)經(jīng)過凍干處理。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了制備脫細(xì)胞脂肪基質(zhì)的方法，包括：1)提供脂肪組織原料；2)將所述脂肪組織原料進(jìn)行凍融處理，得到凍融處理后脂肪組織；3)將所述凍融處理后脂肪組織進(jìn)行胰蛋白酶第一處理以去除細(xì)胞，得到胰蛋白酶第一處理后脂肪組織；4)將所述胰蛋白酶第一處理后脂肪組織進(jìn)行萃取第一處理，清洗、瀝干，得到萃取第一處理后脂肪組織；5)將所述萃取第一處理后脂肪組織進(jìn)行胰蛋白酶第二處理以進(jìn)一步去除細(xì)胞，清洗、瀝干，得到胰蛋白酶第二處理后脂肪組織；6)將所述胰蛋白酶第二處理后脂肪組織進(jìn)行水解處理，清洗、瀝干，得到水解處理后脂肪組織；7)將所述水解處理后脂肪組織進(jìn)行萃取第二處理，清洗、瀝干，得到所述的脫細(xì)胞脂肪基質(zhì)。

技術(shù)研發(fā)人員：王琛,劉蔡鉞,梁辰,傅秀軍,王丹茹,付喬雨,陳諾
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30