一、：本發(fā)明屬于健康護(hù)理類制品中生物發(fā)酵，尤其是涉及一種具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法。

背景技術(shù)

0、二、
背景技術(shù)：

1、精華油作為一種天然的產(chǎn)品，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中很早就開(kāi)始使用植物提取物和精華油，精華油歷史悠久，市場(chǎng)前景好，尤其是在化妝品和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品領(lǐng)域。隨著消費(fèi)者對(duì)健康和天然產(chǎn)品的需求日益增長(zhǎng)，精華油市場(chǎng)持續(xù)擴(kuò)張。特別是針對(duì)個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品的需求，隨著消費(fèi)者對(duì)高品質(zhì)和個(gè)性化產(chǎn)品的需求增加，技術(shù)創(chuàng)新將是推動(dòng)精華油行業(yè)發(fā)展的重要因素，而開(kāi)發(fā)具有多元化生物活性功能的新型產(chǎn)品將是未來(lái)研究的重點(diǎn)，而精華油市場(chǎng)將向這一方向發(fā)展。

2、靈芝(ganoderma?lucidum)是一種著名的藥食兩用真菌，在中國(guó)有著數(shù)千年的藥用歷史，被譽(yù)為“仙草”。其中靈芝孢子油是從靈芝孢子中提取的油狀物質(zhì)，它含有豐富的活性成分，如三萜類靈芝酸、不飽和脂肪酸和靈芝多糖等。這些成分賦予了靈芝孢子精華油多種藥理特性。研究表明，它能夠調(diào)節(jié)皮膚微生物群、降低炎癥反應(yīng)、加速皮膚傷口愈合過(guò)程。此外，靈芝孢子油中的脂肪酸和甘油酯對(duì)皮膚具有保護(hù)作用，可以改善外界對(duì)皮膚的刺激，改善皮膚紅血絲、預(yù)防肌膚炎癥、減少粉刺發(fā)生，使皮膚自然光澤。萜類化合物具有抗炎、抗氧化和修復(fù)表皮的功能。

3、艾草(artemisia?argyi)是一種菊科蒿屬的多年生草本植物，具有悠久的歷史和廣泛的應(yīng)用價(jià)值。它在中國(guó)的分布極為廣泛，其中河南南陽(yáng)為艾草產(chǎn)業(yè)集聚區(qū)。

4、艾草精華油是從艾草的葉子、莖稈中提取的一種揮發(fā)性芳香物質(zhì)，通常呈淺黃或綠黃色，艾草精華油因其獨(dú)特的化學(xué)成分，如三萜類、多糖類等，具有抑菌、消炎、抗氧化、美白等多重功效，可以用于治療皮膚炎癥和祛痘，促進(jìn)皮膚修復(fù)。艾草精華油的滋潤(rùn)作用可以幫助護(hù)膚、嫩膚，促進(jìn)血液循環(huán)，代謝老化細(xì)胞，淡化色斑，使膚色紅潤(rùn)，并促使新細(xì)胞再生，減少皺紋、延緩衰老。

5、面對(duì)激烈的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)，預(yù)計(jì)精華油市場(chǎng)將持續(xù)增長(zhǎng)，特別是在化妝品、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品等領(lǐng)域。雖然靈芝和艾草等植物精華油具有豐富的活性成分，但如何改善人體對(duì)這些活性成分的吸收從而提高對(duì)皮膚保濕能力，以及改善活性成分的抗氧化效率仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。近些年，發(fā)酵技術(shù)在日化產(chǎn)品、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品領(lǐng)域持續(xù)發(fā)展，而通過(guò)發(fā)酵改善傳統(tǒng)精華油活性成分利用率低的問(wèn)題成為可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、三、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：基于靈芝和艾草的植物精華油雖然具有多元化的生物活性，但在使用中的利用率普遍較低，而為了提高靈芝與艾草復(fù)合精華油的利用率，本發(fā)明提供一種具有抗氧化及保濕功效的含有靈芝與艾草復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法。本發(fā)明采用兩種優(yōu)良酵母菌株(產(chǎn)朊圓酵母和解脂耶氏酵母)進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵，從而增強(qiáng)靈芝與艾草復(fù)合精華油的皮膚保濕能力，并且對(duì)三萜、多糖等活性成分進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，從而提升精華油的抗氧化活性；另外，通過(guò)補(bǔ)充維生素e等方式進(jìn)一步增強(qiáng)了復(fù)合精華油的穩(wěn)定性，為開(kāi)發(fā)具有高附加值的天然抗氧化劑提供了新途徑。

2、為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明提供一種具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

4、(1)利用接種環(huán)分別挑取產(chǎn)朊圓酵母和解脂耶氏酵母兩種菌株單菌落，然后分別轉(zhuǎn)接到各自活化培養(yǎng)基中，調(diào)整初始ph為6～7，放置于搖床中，在28～30℃、100～120rpm條件下培養(yǎng)2～3d，培養(yǎng)后得到活化的產(chǎn)朊圓酵母發(fā)酵菌株和活化的解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株；

5、(2)將所得活化的產(chǎn)朊圓酵母發(fā)酵菌株和活化的解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株進(jìn)行混合，配制成復(fù)合菌株；

6、(3)將靈芝精華油與艾草精華油混合配制成復(fù)合精華油，所得復(fù)合精華油中加入果糖、胰蛋白浸粉，然后在121℃下滅菌15～20min，滅菌后冷卻至室溫，得到復(fù)合精華油培養(yǎng)液；

7、(4)將步驟(2)所得復(fù)合菌株接種于步驟(3)所得復(fù)合精華油培養(yǎng)液中，于28～30℃、120～160rpm條件下進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵4～7d，得到復(fù)合發(fā)酵液；

8、(5)將步驟(4)所得復(fù)合發(fā)酵液進(jìn)行離心處理，離心后取上層復(fù)合精華油，然后加入膽固醇和維生素e進(jìn)行混合，得到靈芝與艾草復(fù)合發(fā)酵精華油。

9、根據(jù)上述具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，步驟(1)中所述活化培養(yǎng)基的制備方法均為：將蛋白胨5～10g、蔗糖10～20g、氯化鈉2～5g，補(bǔ)充蒸餾水到1l，在121℃滅菌15～20min，靜置備用。

10、根據(jù)上述具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，步驟(1)中產(chǎn)朊圓酵母和解脂耶氏酵母兩種菌株單菌落的挑取量均為0.05～0.1g，轉(zhuǎn)接的活化培養(yǎng)基均為20～40ml。

11、根據(jù)上述具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，步驟(1)中所得活化的產(chǎn)朊圓酵母發(fā)酵菌株和活化的解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株的濃度均為1×108～1×1010cfu/ml。

12、根據(jù)上述具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，步驟(2)中活化的產(chǎn)朊圓酵母發(fā)酵菌株和活化的解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株進(jìn)行混合時(shí)的體積比為1～3：1～3。

13、根據(jù)上述具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，步驟(3)中靈芝精華油與艾草精華油混合的體積比為1～3：1～3。

14、根據(jù)上述具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，步驟(3)所得復(fù)合精華油培養(yǎng)液的成分為：果糖5～10g、胰蛋白浸粉5～10g、復(fù)合精華油800ml，補(bǔ)充純凈水到1l。

15、根據(jù)上述具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，步驟(4)中復(fù)合菌株按照3～5％的體積比接種于復(fù)合精華油培養(yǎng)液中。

16、根據(jù)上述具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，步驟(5)中所述離心時(shí)的條件為5000～6000rpm、離心時(shí)間5～10min。

17、根據(jù)上述具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，步驟(5)中所取上層復(fù)合精華油1l中加入0.1～0.2g膽固醇和3～5g維生素e。

18、本發(fā)明技術(shù)方案中，采用的靈芝精華油為靈芝孢子精華油，艾草精華油為艾草葉精華油；靈芝孢子精華油是從靈芝孢子粉中提取的，富含三萜類靈芝酸、不飽和脂肪酸、靈芝多糖等；而艾草葉精華油因其獨(dú)特的草本香氣和具有溫經(jīng)止血、散寒止痛等功效，在傳統(tǒng)中醫(yī)中被廣泛使用。通過(guò)兩者相結(jié)合不僅有滋養(yǎng)和保濕作用，而且具有抗炎抗氧化的特性。

19、本發(fā)明采用產(chǎn)朊圓酵母和解脂耶氏酵母作為雙酵母發(fā)酵菌株，產(chǎn)朊圓酵母的生長(zhǎng)速度優(yōu)于一些酵母菌，例如釀酒酵母。能夠利用五碳糖和六碳糖，在有氧條件下不產(chǎn)酒精，能夠以尿素和硝酸作為氮源，在培養(yǎng)基中不需要加入任何生長(zhǎng)因子即可生長(zhǎng)。而解脂耶氏酵母因其能利用多種疏水性底物、具有較高的耐酸、耐鹽脅迫耐受性，以及高通量的三羧酸循環(huán)，提供充足的乙酰輔酶a前體，被認(rèn)為是生產(chǎn)萜類、聚酮類和黃酮類等天然產(chǎn)物的理想宿主。利用這兩個(gè)優(yōu)勢(shì)菌株對(duì)靈芝與艾草復(fù)合精華油進(jìn)行發(fā)酵，不僅能夠提高復(fù)合精華油的抗氧化活性，而且可以加強(qiáng)復(fù)合精華油生物利用率，改善人體吸收率。在食藥護(hù)理等大健康方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

20、本發(fā)明的積極有益效果：

21、1、復(fù)合精華油與優(yōu)勢(shì)菌株協(xié)同增效：基于靈芝與艾草的復(fù)合精華油，并選取具有高效轉(zhuǎn)化靈芝與艾草復(fù)合精華油活性成分的酵母菌株：產(chǎn)朊圓酵母和解脂耶氏酵母，能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)彼此的有益效果，共同提供更全面的健康益處。

22、2、提高活性成分抗氧化效率：通過(guò)優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌株和特定的發(fā)酵工藝，增強(qiáng)了靈芝和艾草中天然抗氧化成分的活性；其中本發(fā)明的實(shí)施例9中dpph自由基清除率達(dá)到92.58％，abts自由基清除率達(dá)到78.86％，鐵離子還原能力達(dá)到2.68，從而提供更強(qiáng)的抗氧化保護(hù)。

23、3、改善人體吸收、增強(qiáng)皮膚保濕能力：選取具有高效轉(zhuǎn)化能力的酵母菌株，控制發(fā)酵條件，增強(qiáng)靈芝與艾草復(fù)合精華油活性成分的生物轉(zhuǎn)化能力，高效分解油脂為甘油和游離脂肪酸，同時(shí)發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的微生物代謝產(chǎn)物可以幫助分解植物細(xì)胞壁，將這些有效成分充分釋放，使得更容易被人體利用；其中本發(fā)明實(shí)施例9中皮膚角質(zhì)層水分含量提高了10.71％，表皮水分流失率下降了8.11g/m2·h，保濕效果顯著。

24、4、提高經(jīng)濟(jì)效益、促進(jìn)產(chǎn)品多樣化：通過(guò)優(yōu)勢(shì)材料選取、菌株搭配及發(fā)酵工藝優(yōu)化，不僅可以降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量，而且有助于開(kāi)發(fā)多種健康產(chǎn)品，如保健品、化妝品等，拓寬了應(yīng)用領(lǐng)域，進(jìn)而增進(jìn)產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

25、5、安全性和綠色環(huán)保：本發(fā)明提供的靈芝與艾草復(fù)合發(fā)酵精華油制備方法，該制備方法采用了益生菌和食品級(jí)發(fā)酵材料進(jìn)行發(fā)酵操作，減少或去除可能存在的有害物質(zhì)，提高了產(chǎn)品的安全性。有助于減少對(duì)環(huán)境的影響，符合可持續(xù)發(fā)展的要求。

26、四、具體實(shí)施方式：

27、為了更好的解釋說(shuō)明本發(fā)明的目的、實(shí)施方案和技術(shù)優(yōu)勢(shì)，以下結(jié)合實(shí)施例及對(duì)比例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍。

28、本發(fā)明實(shí)施例中采用的發(fā)酵材料及菌種：靈芝孢子精華油、艾草精華油均為市售產(chǎn)品；試劑及耗材均購(gòu)置于專業(yè)試劑或耗材公司；菌株均購(gòu)置于北納生物菌株保藏中心。

29、以下實(shí)施例中，采用的產(chǎn)朊圓酵母簡(jiǎn)稱：產(chǎn)朊，解脂耶氏酵母簡(jiǎn)稱：解脂，釀酒酵母簡(jiǎn)稱：釀酒，靈芝孢子精華油簡(jiǎn)稱：靈芝，艾草葉精華油簡(jiǎn)稱：艾草。

30、本發(fā)明實(shí)施例和對(duì)比例中菌株及精華油混合比例參數(shù)詳見(jiàn)表1。

31、表1本發(fā)明實(shí)施例和對(duì)比例中菌株及精華油混合比例參數(shù)

32、

33、實(shí)施例1：

34、本發(fā)明具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，其詳細(xì)步驟如下：

35、(1)利用接種環(huán)分別挑取0.1g產(chǎn)朊圓酵母菌株單菌落和0.1g解脂耶氏酵母菌株單菌落，然后分別轉(zhuǎn)接到各自40ml活化培養(yǎng)基中，調(diào)整初始ph為6，放置于搖床中，在29℃、120rpm條件下培養(yǎng)2d，培養(yǎng)后得到活化的產(chǎn)朊圓酵母發(fā)酵菌株和活化的解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株；所得兩種發(fā)酵菌株的濃度均為1×109cfu/ml；

36、所述活化培養(yǎng)基的制備方法均為：將蛋白胨5g、蔗糖15g、氯化鈉3g，補(bǔ)充蒸餾水到1l，在121℃滅菌20min，得到活化培養(yǎng)基；

37、(2)將所得活化的產(chǎn)朊圓酵母發(fā)酵菌株和活化的解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株按照1:1的體積比進(jìn)行混合，配制成復(fù)合菌株；

38、(3)將靈芝孢子精華油中加入果糖、胰蛋白浸粉，然后在121℃下滅菌20min，滅菌后冷卻至室溫，得到復(fù)合精華油培養(yǎng)液；

39、所述復(fù)合精華油培養(yǎng)液的成分為：果糖5g、胰蛋白浸粉5g、復(fù)合精華油800ml，補(bǔ)充純凈水到1l；

40、(4)將步驟(2)所得復(fù)合菌株以3％的體積比接種于步驟(3)所得復(fù)合精華油培養(yǎng)液中，于29℃、140rpm條件下進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵6d，得到復(fù)合發(fā)酵液；

41、(5)將步驟(4)所得復(fù)合發(fā)酵液于6000rpm下離心7min，離心后取上層復(fù)合精華油，然后加入0.1g/l膽固醇和4g/l維生素e(保持其活性和穩(wěn)定性)進(jìn)行混合，得到復(fù)合發(fā)酵精華油。

42、實(shí)施例2：

43、本發(fā)明具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于：

44、步驟(3)中：將艾草精華油中加入果糖、胰蛋白浸粉。

45、實(shí)施例3：

46、本發(fā)明具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于：

47、步驟(3)中：將靈芝精華油與艾草精華油按照1：1的體積比混合配制成復(fù)合精華油，所得復(fù)合精華油中加入果糖、胰蛋白浸粉。

48、實(shí)施例4：

49、本發(fā)明具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于：

50、步驟(3)中：將靈芝精華油與艾草精華油按照3：1的體積比混合配制成復(fù)合精華油，所得復(fù)合精華油中加入果糖、胰蛋白浸粉。

51、實(shí)施例5：

52、本發(fā)明具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于：

53、步驟(3)中：將靈芝精華油與艾草精華油按照1：3的體積比混合配制成復(fù)合精華油，所得復(fù)合精華油中加入果糖、胰蛋白浸粉。

54、實(shí)施例6：

55、本發(fā)明具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于：

56、步驟(1)中：利用接種環(huán)挑取0.1g產(chǎn)朊圓酵母菌株單菌落，然后轉(zhuǎn)接到40ml活化培養(yǎng)基中，調(diào)整初始ph為6，放置于搖床中，在29℃、120rpm條件下培養(yǎng)2d，培養(yǎng)后得到活化的產(chǎn)朊圓酵母發(fā)酵菌株，所得發(fā)酵菌株的濃度為1×109cfu/ml；

57、步驟(2)中：省略；

58、步驟(3)中：將靈芝精華油與艾草精華油按照3：1的體積比混合配制成復(fù)合精華油，所得復(fù)合精華油中加入果糖、胰蛋白浸粉；

59、步驟(4)中：將步驟(1)所得活化的產(chǎn)朊圓酵母發(fā)酵菌株以3％的體積比接種于步驟(3)所得復(fù)合精華油培養(yǎng)液中，于29℃、140rpm條件下進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵6d，得到復(fù)合發(fā)酵液。

60、實(shí)施例7：

61、本發(fā)明具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，與實(shí)施例6基本相同，不同之處在于：

62、步驟(1)中：利用接種環(huán)挑取0.1g解脂耶氏酵母菌株單菌落，然后轉(zhuǎn)接到40ml活化培養(yǎng)基中，調(diào)整初始ph為6，放置于搖床中，在29℃、120rpm條件下培養(yǎng)2d，培養(yǎng)后得到活化的解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株，所得發(fā)酵菌株的濃度為1×109cfu/ml；

63、步驟(4)中：將步驟(1)所得活化的解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株以3％的體積比接種于步驟(3)所得復(fù)合精華油培養(yǎng)液中，于29℃、140rpm條件下進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵6d，得到復(fù)合發(fā)酵液。

64、實(shí)施例8：

65、本發(fā)明具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，與實(shí)施例4基本相同，不同之處在于：

66、步驟(2)中：將所得活化的產(chǎn)朊圓酵母發(fā)酵菌株和活化的解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株按照3:1的體積比進(jìn)行混合，配制成復(fù)合菌株。

67、實(shí)施例9：

68、本發(fā)明具有抗氧化及保濕功效的復(fù)合發(fā)酵精華油的制備方法，與實(shí)施例4基本相同，不同之處在于：

69、步驟(2)中：將所得活化的產(chǎn)朊圓酵母發(fā)酵菌株和活化的解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株按照1:3的體積比進(jìn)行混合，配制成復(fù)合菌株。

70、對(duì)比例1：

71、一種復(fù)合發(fā)酵液的制備方法，其詳細(xì)步驟如下：

72、(1)利用接種環(huán)分別挑取0.1g產(chǎn)朊圓酵母菌株單菌落和0.1g解脂耶氏酵母菌株單菌落，然后分別轉(zhuǎn)接到各自40ml活化培養(yǎng)基中，調(diào)整初始ph為6，放置于搖床中，在29℃、120rpm條件下培養(yǎng)2d，培養(yǎng)后得到活化的產(chǎn)朊圓酵母發(fā)酵菌株和活化的解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株；

73、所述活化培養(yǎng)基的制備方法均為：將蛋白胨5g、蔗糖15g、氯化鈉3g，補(bǔ)充蒸餾水到1l，在121℃滅菌20min，得到活化培養(yǎng)基；

74、(2)將所得活化的產(chǎn)朊圓酵母發(fā)酵菌株和活化的解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株按照1:3的體積比進(jìn)行混合，配制成復(fù)合菌株；

75、(3)將步驟(2)所得復(fù)合菌株以3％的體積比接種于純凈水中，于29℃、140rpm條件下進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵6d，得到復(fù)合發(fā)酵液；

76、(4)將步驟(3)所得復(fù)合發(fā)酵液于6000rpm離心7min，取上清加入0.1g/l膽固醇和維生素e?4g/l混合，得到復(fù)合發(fā)酵液。

77、對(duì)比例2：

78、一種復(fù)合精華油的制備方法，其詳細(xì)步驟如下：

79、(1)將靈芝精華油與艾草精華油按照3:1的體積比混合配制成復(fù)合精華油，所得復(fù)合精華油中加入果糖、胰蛋白浸粉，然后在121℃下滅菌20min，滅菌后冷卻至室溫，得到復(fù)合精華油培養(yǎng)液；

80、(2)將純凈水以3％的體積比接種于步驟(1)所得復(fù)合精華油培養(yǎng)液中，然后置于搖床中，于29℃、140rpm條件下進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵6d，得到復(fù)合發(fā)酵液；

81、(3)將步驟(2)所得復(fù)合發(fā)酵液于6000rpm下離心7min，離心后取上層復(fù)合精華油，然后加入0.1g/l膽固醇和4g/l維生素e(保持其活性和穩(wěn)定性)進(jìn)行混合，得到復(fù)合發(fā)酵精華油。

82、對(duì)比例3：

83、一種復(fù)合精華油的制備方法，與實(shí)施例6基本相同，不同之處在于：

84、步驟(1)中：利用接種環(huán)挑取0.1g釀酒酵母菌株單菌落，然后轉(zhuǎn)接到40ml活化培養(yǎng)基中，調(diào)整初始ph為6，放置于搖床中，在29℃、120rpm條件下培養(yǎng)2d，培養(yǎng)后得到活化的釀酒酵母發(fā)酵菌株，所得發(fā)酵菌株的濃度為1×109cfu/ml；

85、步驟(4)中：將步驟(1)所得活化的釀酒酵母發(fā)酵菌株以3％的體積比接種于步驟(3)所得復(fù)合精華油培養(yǎng)液中，于29℃、140rpm條件下進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵6d，得到復(fù)合發(fā)酵液。

86、對(duì)比例4：

87、一種復(fù)合精華油的制備方法，與實(shí)施例6基本相同，不同之處在于：

88、步驟(1)中：利用接種環(huán)分別挑取0.1g釀酒酵母菌株單菌落和0.1g產(chǎn)朊圓酵母菌株單菌落，然后各自轉(zhuǎn)接到40ml活化培養(yǎng)基中，調(diào)整初始ph為6，放置于搖床中，在29℃、120rpm條件下培養(yǎng)2d，培養(yǎng)后得到活化的釀酒酵母發(fā)酵菌株和產(chǎn)朊圓酵母發(fā)酵菌株，所得發(fā)酵菌株的濃度均為1×109cfu/ml；

89、步驟(2)中：將所得活化的釀酒酵母發(fā)酵菌株和活化的產(chǎn)朊圓酵母發(fā)酵菌株按照1:1的體積比進(jìn)行混合，配制成復(fù)合菌株；

90、步驟(4)中：將步驟(2)所得復(fù)合菌株以3％的體積比接種于步驟(3)所得復(fù)合精華油培養(yǎng)液中，于29℃、140rpm條件下進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵6d，得到復(fù)合發(fā)酵液。

91、對(duì)比例5：

92、一種復(fù)合精華油的制備方法，與實(shí)施例6基本相同，不同之處在于：

93、步驟(1)中：利用接種環(huán)分別挑取0.1g釀酒酵母菌株單菌落和0.1g解脂耶氏酵母菌株單菌落，然后各自轉(zhuǎn)接到40ml活化培養(yǎng)基中，調(diào)整初始ph為6，放置于搖床中，在29℃、120rpm條件下培養(yǎng)2d，培養(yǎng)后得到活化的釀酒酵母發(fā)酵菌株和解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株，所得發(fā)酵菌株的濃度均為1×109cfu/ml；

94、步驟(2)中：將所得活化的釀酒酵母發(fā)酵菌株和活化的解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株按照1:1的體積比進(jìn)行混合，配制成復(fù)合菌株；

95、步驟(4)中：將步驟(2)所得復(fù)合菌株以3％的體積比接種于步驟(3)所得復(fù)合精華油培養(yǎng)液中，于29℃、140rpm條件下進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵6d，得到復(fù)合發(fā)酵液。

96、對(duì)比例6：

97、一種復(fù)合精華油的制備方法，與實(shí)施例6基本相同，不同之處在于：

98、步驟(1)中：利用接種環(huán)分別挑取0.1g釀酒酵母菌株單菌落和0.1g解脂耶氏酵母菌株單菌落，然后各自轉(zhuǎn)接到40ml活化培養(yǎng)基中，調(diào)整初始ph為6，放置于搖床中，在29℃、120rpm條件下培養(yǎng)2d，培養(yǎng)后得到活化的釀酒酵母發(fā)酵菌株和解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株，所得發(fā)酵菌株的濃度均為1×109cfu/ml；

99、步驟(2)中：將所得活化的釀酒酵母發(fā)酵菌株和活化的解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株按照3:1的體積比進(jìn)行混合，配制成復(fù)合菌株；

100、步驟(4)中：將步驟(2)所得復(fù)合菌株以3％的體積比接種于步驟(3)所得復(fù)合精華油培養(yǎng)液中，于29℃、140rpm條件下進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵6d，得到復(fù)合發(fā)酵液。

101、對(duì)比例7：

102、一種復(fù)合精華油的制備方法，與實(shí)施例6基本相同，不同之處在于：

103、步驟(1)中：利用接種環(huán)分別挑取0.1g釀酒酵母菌株單菌落和0.1g解脂耶氏酵母菌株單菌落，然后各自轉(zhuǎn)接到40ml活化培養(yǎng)基中，調(diào)整初始ph為6，放置于搖床中，在29℃、120rpm條件下培養(yǎng)2d，培養(yǎng)后得到活化的釀酒酵母發(fā)酵菌株和解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株，所得發(fā)酵菌株的濃度均為1×109cfu/ml；

104、步驟(2)中：將所得活化的釀酒酵母發(fā)酵菌株和活化的解脂耶氏酵母發(fā)酵菌株按照1:3的體積比進(jìn)行混合，配制成復(fù)合菌株；

105、步驟(4)中：將步驟(2)所得復(fù)合菌株以3％的體積比接種于步驟(3)所得復(fù)合精華油培養(yǎng)液中，于29℃、140rpm條件下進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵6d，得到復(fù)合發(fā)酵液。

106、為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明能夠達(dá)到較好的技術(shù)效果，對(duì)各實(shí)施例、對(duì)比例制備所得復(fù)合發(fā)酵精華油產(chǎn)品進(jìn)行了以下試驗(yàn)和調(diào)查問(wèn)卷：

107、1、體外抗氧化活性試驗(yàn)

108、參與試驗(yàn)的實(shí)施例組別：實(shí)施例1～9、對(duì)比例1～7。

109、(1)dpph自由基清除率檢測(cè)(dpph自由基清除能力檢測(cè)試劑盒測(cè)定)

110、試驗(yàn)方法：吸取100μl樣品加入900μl提取液，旋渦振蕩混勻，室溫10000rpm離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。制備空白管(a空白)：提取液+dpph工作液，測(cè)定管(a測(cè)定)：上清液+dpph工作液，對(duì)照管(a對(duì)照)：上清液+無(wú)水乙醇，陽(yáng)性對(duì)照管(a陽(yáng)性對(duì)照)：維生素c+dpph工作液。渦旋混勻，室溫避光靜置30min，分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至od515，無(wú)水乙醇調(diào)零，所有的實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù)。

111、dpph自由基清除率由以下公式計(jì)算獲得：

112、樣品：dpph自由基清除率(％)＝[[a空白-(a測(cè)定-a對(duì)照)]÷a空白]×100％。

113、陽(yáng)性對(duì)照：dpph自由基清除率(％)＝[(a空白-a陽(yáng)性對(duì)照)÷a空白]×100％。

114、(2)abts自由基清除率檢測(cè)(abts自由基清除能力檢測(cè)試劑盒測(cè)定)

115、試驗(yàn)方法：吸取100μl樣品加入900μl提取液，旋渦振蕩混勻，室溫10000rpm離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。制備空白管(a空白)：蒸餾水+測(cè)定工作液+abts工作液，測(cè)定管(a測(cè)定)：上清液+測(cè)定工作液+abts工作液，對(duì)照管(a對(duì)照)：上清液+無(wú)水乙醇，陽(yáng)性對(duì)照管(a陽(yáng)性對(duì)照)：維生素c+abts工作液。渦旋混勻，室溫避光靜置30min，分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至od405，無(wú)水乙醇調(diào)零，所有的實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù)。

116、abts自由基清除率由以下公式計(jì)算獲得：

117、樣品：abts自由基清除率(％)＝[[a空白-(a測(cè)定-a對(duì)照)]÷a空白]×100％。

118、陽(yáng)性對(duì)照：abts自由基清除率(％)＝[(a空白-a陽(yáng)性對(duì)照)÷a空白]×100％。

119、(3)鐵離子還原能力的測(cè)定

120、試驗(yàn)方法：將磷酸緩沖液(0.2mol/l)與鐵氰化鉀溶液(1％)按1:1(v:v)混合后，取2ml加入1ml、0.5mg/ml的樣品中，50℃孵育20min，冰浴冷卻，取三氯乙酸(10％)1ml與之充分混勻，在3000rpm離心10min，將上清中加入三氯化鐵(0.1％)0.6ml混勻，放置10min，蒸餾水調(diào)零，測(cè)定od700處吸光度值(其中空白對(duì)照不加樣品液、陽(yáng)性對(duì)照為維生素c)，所有的實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù)。

121、以上實(shí)施例1-9和對(duì)比例1-7制備所得產(chǎn)品的體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表2。

122、表2實(shí)施例1-9和對(duì)比例1-7制備所得產(chǎn)品的體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果

123、

124、(*：p<0.05)結(jié)果顯著。

125、由表2中數(shù)據(jù)可得出：通過(guò)實(shí)施例1～9以及對(duì)比例1～7之間試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較可知，本發(fā)明制備所得具有抗氧化及保濕功效的靈芝與艾草復(fù)合發(fā)酵精華油，在抗氧化功效方面效果顯著。其中，在產(chǎn)朊圓酵母和解脂耶氏酵母聯(lián)合發(fā)酵下，抗氧化活性同比高于單一菌種發(fā)酵以及釀酒酵母發(fā)酵的情況。另外，靈芝與艾草混合精華油的抗氧化效果高于單一精華油，并且靈芝與艾草混合精華油中靈芝精華油與艾草精華油占比為3:1的實(shí)施條件下抗氧化活性最高，如實(shí)施例9：dpph自由基清除率為92.58％，abts自由基清除率為78.86％，鐵離子還原能力為2.68。

126、2、保濕修復(fù)試驗(yàn)

127、(1)角質(zhì)層水分含量及表皮水分流失率檢測(cè)(皮膚角質(zhì)層水分含量測(cè)試儀/皮膚水分測(cè)試儀檢測(cè))

128、參與試驗(yàn)的實(shí)施例組別：實(shí)施例1～9、對(duì)比例1～7。

129、試驗(yàn)方法：選取年齡在25～45周歲的受試者64人，隨機(jī)分為16組參加試驗(yàn)，分別對(duì)應(yīng)9個(gè)實(shí)施例和7個(gè)對(duì)比例。室溫調(diào)節(jié)為22～26℃，相對(duì)濕度40～50％，取樣品0.08ml，使用乳膠指套均勻涂抹30s，規(guī)定涂抹區(qū)域?yàn)樽笥艺苽?cè)前臂中部，樣品用量2.0～2.2mg/cm2，5min后清水洗凈。分別用皮膚角質(zhì)層水分含量測(cè)試儀及皮膚水分測(cè)試儀測(cè)定樣品涂抹前(a)和樣品涂抹后2h(b)涂抹區(qū)域的皮膚角質(zhì)層水分含量和水分流失率。而樣品使用后皮膚角質(zhì)層水分含量的提升值、表皮水分流失率的下降值以下列公式計(jì)算(數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)取平均值)：

130、提升值＝b皮膚角質(zhì)層水分含量-a皮膚角質(zhì)層水分含量

131、下降值＝a表皮水分流失率-b表皮水分流失率

132、以上實(shí)施例1-9和對(duì)比例1-7制備所得產(chǎn)品的保濕修復(fù)試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表3。

133、表3實(shí)施例1-9和對(duì)比例1-7制備所得產(chǎn)品角質(zhì)層水分含量及表皮水分流失率檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果

134、

135、(*：p<0.05)結(jié)果顯著。

136、由表3中數(shù)據(jù)可知：通過(guò)實(shí)施例1～9以及對(duì)比例1～7之間試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較可知，本發(fā)明方法制備所得的產(chǎn)品，具有明顯改善皮膚保濕能力的優(yōu)勢(shì)，具體數(shù)據(jù)體現(xiàn)為：使用發(fā)酵的樣品后皮膚角質(zhì)層水分含量都有不同程度的提升，表皮水分流失率得到下降。其中實(shí)施例總體保濕效果高于對(duì)比例，特別是實(shí)施例9中皮膚角質(zhì)層水分含量提高了10.71％，表皮水分流失率下降了8.11g/m2·h。

137、(2)皮膚潤(rùn)濕度及舒適度自我評(píng)價(jià)

138、參與調(diào)查問(wèn)卷的實(shí)施例組別：實(shí)施例1～9(由于實(shí)施例同比對(duì)比例優(yōu)勢(shì)明顯，所以只對(duì)實(shí)施例進(jìn)行調(diào)查問(wèn)卷)。

139、調(diào)查問(wèn)卷方法：選取年齡在25～45周歲的受試者64人進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查。室溫調(diào)節(jié)為22～26℃，相對(duì)濕度40～50％，取樣品0.08ml，試樣使用乳膠指套均勻涂抹1min，規(guī)定涂抹區(qū)域?yàn)樽笥艺苽?cè)前臂中部，樣品用量3.0～3.2mg/cm2，10min后清水洗凈。對(duì)樣品涂抹后2h涂抹區(qū)域的皮膚潤(rùn)濕度及舒適度進(jìn)行自我評(píng)價(jià)，其中通過(guò)潤(rùn)濕度評(píng)價(jià)各等級(jí)中的受試者占比，以及舒適度評(píng)價(jià)等級(jí)中感覺(jué)良好的百分率來(lái)進(jìn)行樣品評(píng)估是否具有保濕修護(hù)的功效。自我評(píng)價(jià)結(jié)果詳見(jiàn)表4。

140、良好率計(jì)算公式如下：

141、

142、表4實(shí)施例1-9所得產(chǎn)品的皮膚潤(rùn)濕度及舒適度自我評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)結(jié)果

143、

144、由表4中數(shù)據(jù)可知：通過(guò)實(shí)施例1～9之間調(diào)查問(wèn)卷結(jié)果進(jìn)行比較可知，實(shí)施例9對(duì)皮膚具有良好的潤(rùn)濕度，并且受試者普遍認(rèn)為實(shí)施例9的舒適度好，其中良好率最好，達(dá)到90％。這也充分的驗(yàn)證了本發(fā)明制備所得產(chǎn)品具有良好的保濕效果。

145、3、人體皮膚試驗(yàn)

146、參與試驗(yàn)的實(shí)施例組別：實(shí)施例1～9。

147、本試驗(yàn)遵照2023年修訂的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中的人體皮膚斑貼試驗(yàn)方法，并按受試者入選標(biāo)準(zhǔn)選擇40名受試者。

148、(1)皮膚封閉型斑貼試驗(yàn)

149、試驗(yàn)方法：選用面積不超過(guò)50mm2、深度約1mm的合格斑試器材。將樣品放入斑試器小室內(nèi)，用量約為0.02ml。將加有頭皮養(yǎng)護(hù)液的斑試器用低致敏膠帶貼敷于受試者的前臂曲側(cè)，用手掌輕壓使之均勻地貼敷于皮膚上，持續(xù)24h。分別于去除受試物斑試器后30min(待壓痕消失后)、24h和48h按皮膚反應(yīng)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)觀察皮膚反應(yīng)，并記錄觀察結(jié)果。

150、(2)重復(fù)性開(kāi)放型涂抹試驗(yàn)

151、試驗(yàn)方法：以前臂屈側(cè)作為受試部位，面積3×3cm2，受試部位應(yīng)保持干燥，避免接觸其他外用制劑。取樣品約0.05ml/次、每天2次均勻地涂于受試部位，連續(xù)7d，按皮膚反應(yīng)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行觀察，并記錄結(jié)果。

152、以上實(shí)施例1-9所得產(chǎn)品的人體皮膚安全性試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表5。表6為皮膚反應(yīng)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

153、表5實(shí)施例1-9所得產(chǎn)品的人體皮膚安全性試驗(yàn)

154、 檢測(cè)項(xiàng)目 24h 48h 7d 實(shí)施例1 0級(jí) 0級(jí) 0級(jí) 實(shí)施例2 0級(jí) 0級(jí) 0級(jí) 實(shí)施例3 0級(jí) 0級(jí) 0級(jí) 實(shí)施例4 0級(jí) 0級(jí) 0級(jí) 實(shí)施例5 0級(jí) 0級(jí) 0級(jí) 實(shí)施例6 0級(jí) 0級(jí) 0級(jí) 實(shí)施例7 0級(jí) 0級(jí) 0級(jí) 實(shí)施例8 0級(jí) 0級(jí) 0級(jí) 實(shí)施例9 0級(jí) 0級(jí) 0級(jí)

155、表6皮膚反應(yīng)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

156、

157、由表5中所得數(shù)據(jù)可知：通過(guò)人體皮膚安全性試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明制備所得具有抗氧化及保濕功效的靈芝與艾草復(fù)合發(fā)酵精華油在各種實(shí)施方式下都不會(huì)對(duì)人體皮膚安全造成影響，是一種安全的護(hù)理產(chǎn)品。

158、綜上所述，通過(guò)以上體外抗氧化活性試驗(yàn)、保濕修復(fù)試驗(yàn)、潤(rùn)濕度及舒適度調(diào)查問(wèn)卷、人體皮膚安全性試驗(yàn)，這些試驗(yàn)綜合分析可知，本發(fā)明制備方法中，以產(chǎn)朊圓酵母與解脂耶氏酵母兩種菌株按體積比1:3制備的混合菌株，和以發(fā)酵靈芝與艾草按體積比3:1混合的精華油所獲得的復(fù)合發(fā)酵精華油各項(xiàng)數(shù)據(jù)最好，綜合體外抗氧化活性，保濕修復(fù)，潤(rùn)濕度及舒適度這四個(gè)方面數(shù)據(jù)，其中實(shí)施例9的方案最佳。因此，通過(guò)本發(fā)明制備所得具有抗氧化及保濕功效的靈芝與艾草復(fù)合發(fā)酵精華油，通過(guò)實(shí)施驗(yàn)證具有良好的抗氧化活性和保濕功效，是一種安全、舒適、高效的護(hù)理產(chǎn)品。