本發(fā)明涉及一種功能型微針生物檢測，更具體地涉及一種用于mirna檢測的多孔水凝膠微針及其制備和檢測方法。

背景技術(shù)：

1、mirna是一類約由22個核苷酸組成的非蛋白質(zhì)編碼的內(nèi)源性單鏈rna。近年來，越來越多的研究表明mirna除了調(diào)節(jié)各項生命活動外，其異常表達和多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展、惡化、轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系。然而，傳統(tǒng)的mirna獲取方式通過血液，不僅會給患者帶來創(chuàng)傷，還需要對創(chuàng)面進行相應(yīng)的治療和護理。隨著微針技術(shù)的發(fā)展，微針在疾病診斷和監(jiān)測領(lǐng)域顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。微針由25～2500μm的微型針頭組成，微米級的針尖大小在插完皮膚后，留下的微孔很快能復(fù)原，不會明顯損傷皮膚結(jié)構(gòu)，被廣泛應(yīng)用于皮膚組織間質(zhì)液(isf)中生物標(biāo)志物檢測。因此，基于微針實現(xiàn)mirna的靈敏檢測對于癌癥的早期診斷具有至關(guān)重要的意義。

2、中國專利“申請?zhí)枺篶n202211116354.3”報道了一種用于原位檢測炎癥環(huán)境的多參數(shù)sers活性微針，通過金屬納米粒子的表面增強拉曼散射效應(yīng)，從而實現(xiàn)實現(xiàn)對炎癥部位的快速檢測。中國專利“申請?zhí)枺篶n202311009753.4”報道了一種微流控-微針檢測裝置及方法，通過微針提取室與微流控通道連通，實現(xiàn)快速檢測。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明提供一種用于mirna檢測的多孔水凝膠微針及其制備和檢測方法，通過滲透壓驅(qū)動提高微針在isf中mirna-21、mirna-221和mirna-155的捕獲效率，最終實現(xiàn)mirna的超靈敏診斷。

2、技術(shù)方案：本發(fā)明采用的一種用于mirna檢測的多孔水凝膠微針及其制備和檢測方法通過以下方式實現(xiàn)：

3、所述微針具有多孔仿生結(jié)構(gòu)和滲透壓驅(qū)動力，孔隙率為30～35％，微針高度為1000～1200μm，針尖設(shè)計為金字塔形，底部直徑為350～400μm；所述水凝膠微針是通過聚乙二醇和氯化鋰改性水凝膠實現(xiàn)。

4、本發(fā)明還提供所述水凝膠微針制備方法包括以下步驟：將聚乙烯醇(12wt％)、聚乙烯吡咯烷酮(6wt％)、交聯(lián)劑戊二二醛(0.003wt％)和聚乙二醇(0.1～0.2wt％)溶解于去離子水中，將所得混合物加熱至90℃攪拌3h。隨后澆注在pdms模具中，真空除去氣泡后室溫下干燥24h。最后將微針從模具上剝離，浸泡在20～35wt％氯化鋰的溶液中2h，以獲得滲透壓驅(qū)動微針，微針高度為1000～1200μm，針尖設(shè)計為金字塔形，底部直徑為350～400μm，孔隙率為30～35％。

5、本發(fā)明還提供所述水凝膠微針檢測mirna的方法，包括以下步驟：

6、(1)捕獲探針ⅰ首先以0.5～1.0od的濃度溶解至50～150μm，然后加入1～2μl的1～2m的三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽(tcep)溶液并充分混勻，在室溫下進行30～40min的還原反應(yīng)。將制得的微針的針身和針尖插入溶液中靜置10～20min后取出，用pbs緩沖液沖洗后，在室溫下浸入5～8％?bsa溶液中1～2h封裝檢測探針ⅰ。

7、(2)在步驟(1)制得的捕獲探針ⅰ滲透壓驅(qū)動微針浸入待檢測液中或者插入活體組織，反應(yīng)6～8h后取出，用pbs緩沖液沖洗，得到待測mirna結(jié)合的微針。

8、(3)將0.5～1.0od?sh-探針ⅱ溶解至50～150μm，加入5～7μl、1～2m三羥甲基丙烯酸鹽緩沖液(tecp)，混合均勻后，在室溫靜置20～30分鐘。將500～600μl?au納米顆粒溶液(0.1～0.2mg/ml)和已還原的sh-探針ⅱ加入到玻璃瓶中，然后將其放入微波爐中進行中高溫加熱3～5min。接著用ph?7.0～8.0的tris-edta(te)緩沖液重新懸浮混合物，然后在20000～30000rpm下進行離心洗滌兩次，每次15～20min。得到的au-sh探針ⅱ溶液保存在4℃中。

9、(4)將步驟(2)微針浸入步驟(3)制得的au-sh探針ⅱ溶液懸浮液中，靜置1～2h，隨后取出微針，微針與au結(jié)合，最終通過熒光設(shè)備測得熒光強度。

10、其中，本發(fā)明捕獲探針ⅰ包括mirna-21捕獲探針、mirna-221捕獲探針和mirna-155捕獲探針。

11、有益效果：1.本發(fā)明提供了一種用于mirna檢測的多孔水凝膠微針，其可用于癌癥相關(guān)mirna超靈敏檢測。通過引入聚乙二醇對水凝膠微針進行改性，優(yōu)化微針的多孔結(jié)構(gòu)。通過在有限體積的微針中引入更多的多孔通道，可以增加其表面積，提高對間質(zhì)液提取的容量；同時利用氯化鋰增加水凝膠基質(zhì)中的間質(zhì)液滲透壓，促進皮膚間質(zhì)液在應(yīng)用區(qū)域的擴散并有效進入微針基質(zhì)。這種滲透壓復(fù)合的高溶脹微針在更短時間內(nèi)可收集大量皮膚間質(zhì)液，為多種分析或生物標(biāo)志物研究提供了豐富的樣本來源。

12、2.本發(fā)明提供了一種用于mirna檢測的多孔水凝膠微針，其高度為1000～1200μm，針尖設(shè)計為金字塔形，孔隙率為30～35％，具有優(yōu)異的機械強度。相對于傳統(tǒng)的臨床疾病診斷方法如血常規(guī)檢測、計算機斷層掃描和核磁共振等，該技術(shù)能夠簡化檢測流程、減少樣本采集量、縮短診斷時間，便于醫(yī)護人員操作，且穿透皮膚表皮層進入真皮層，夠避免對神經(jīng)纖維的刺激，從而實現(xiàn)無痛的檢測，減輕患者痛苦。

技術(shù)特征：

1.一種用于mirna檢測的多孔水凝膠微針，其特征在于：所述微針具有多孔仿生結(jié)構(gòu)和滲透壓驅(qū)動力，孔隙率為30～35％，微針高度為1000～1200μm，針尖設(shè)計為金字塔形，底部直徑為350～400μm；所述水凝膠微針是通過聚乙二醇和氯化鋰改性水凝膠實現(xiàn)。

2.權(quán)利要求1所述多孔水凝膠微針的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：將10～16wt％聚乙烯醇、5～8wt％聚乙烯吡咯烷酮、0.002～0.004wt％交聯(lián)劑戊二二醛和0.1～0.2wt％聚乙二醇溶解于去離子水中，將所得混合物加熱至80～90℃攪拌2～3h；隨后澆注在聚二甲基硅氧烷模具中，真空除去氣泡后室溫下干燥20～24h；最后將微針從模具上剝離，浸泡在20～35wt％氯化鋰的溶液中2～3h，以獲得滲透壓驅(qū)動微針；微針高度為1000～1200μm，針尖設(shè)計為金字塔形，底部直徑為350～400μm，孔隙率為30～35％。

3.利用權(quán)利要求1所述多孔水凝膠微針檢測mirna的方法，其特征在于，包括以下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測mirna的方法，其特征在于：捕獲探針ⅰ包括mirna-21捕獲探針、mirna-221捕獲探針或mirna-155捕獲探針。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種用于miRNA檢測的多孔水凝膠微針及其制備和檢測方法。該水凝膠微針具有多孔結(jié)構(gòu)和滲透壓驅(qū)動力。通過聚乙二醇改性水凝膠來改善微針的多孔結(jié)構(gòu)，氯化鋰處理增加間質(zhì)液在水凝膠基質(zhì)中的滲透壓，促進間質(zhì)液在應(yīng)用區(qū)域的擴散并進入水凝膠微針基質(zhì)。在提取過程中，滲透液會溶解于基質(zhì)中并產(chǎn)生滲透壓力，從而促進間質(zhì)液(ISF)從皮膚向水凝膠基質(zhì)的擴散，從而提高miRNA?21、miRNA?221和miRNA?155的捕獲效率，通過捕獲的miRNA與金顆粒結(jié)合，產(chǎn)生有效的局域表面等離子體共振熒光，最終通過熒光光譜實現(xiàn)miRNA的超靈敏檢測。

技術(shù)研發(fā)人員：劉磊,邢佑強,吳敏,黃鵬,吳澤,李冰玨
受保護的技術(shù)使用者：東南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2