本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，更具體地說，它涉及一種基于細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體的細(xì)菌藥物靶點(diǎn)及藥物。

背景技術(shù)：

1、細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶，作為細(xì)菌體內(nèi)維持dna拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不可或缺的關(guān)鍵酶，在dna的復(fù)制、修復(fù)及轉(zhuǎn)錄等核心生命過程中扮演著至關(guān)重要的角色。dna旋轉(zhuǎn)酶由兩個gyra和兩個gyrb亞基組成，形成一個四聚體復(fù)合物。dna旋轉(zhuǎn)酶的保守性體現(xiàn)在其結(jié)構(gòu)和功能上。從進(jìn)化的角度來看， gyrb基因在不同細(xì)菌屬或科內(nèi)具有較高的保守性，這使得它成為鑒別細(xì)菌近緣種的一個有效分子標(biāo)記。 gyrb基因編碼旋轉(zhuǎn)酶的b亞單位，是一個單拷貝的看家基因，在細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析中是一個重要的新靶標(biāo)，此外，gyrb和pare作為iia型拓?fù)洚悩?gòu)酶的組成部分，它們在結(jié)構(gòu)上是相關(guān)的，并且對于dna復(fù)制和修復(fù)過程同樣至關(guān)重要。它們的基本作用在維持dna結(jié)構(gòu)和功能的方面是保守的。這種保守性也使得它們成為開發(fā)具有廣譜抗菌活性的雙靶向抗菌劑的主要候選者。

2、當(dāng)前，基于dna旋轉(zhuǎn)酶的藥物開發(fā)已成為抗菌領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。其核心策略在于通過干擾或抑制dna旋轉(zhuǎn)酶的活性，有效阻斷細(xì)菌的dna復(fù)制與修復(fù)過程，進(jìn)而達(dá)到抗菌的目的。例如，廣泛應(yīng)用的氟喹諾酮類抗生素，正是通過精準(zhǔn)作用于dna旋轉(zhuǎn)酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶iv，成功實現(xiàn)了對多種細(xì)菌的抑制作用。

3、然而，隨著抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)峻。細(xì)菌通過基因突變，特別是 gyra或 gyrb基因的變異，能夠迅速發(fā)展出針對現(xiàn)有藥物的抗性機(jī)制。這一現(xiàn)象不僅削弱了傳統(tǒng)抗生素的療效，也對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。最新發(fā)現(xiàn)的抗生素evybactin，能夠靶向結(jié)核分枝桿菌的dna旋轉(zhuǎn)酶，作用于dna旋轉(zhuǎn)酶a亞基，但抗生素evybactin仍存在抗藥突變等問題，故需要新的研發(fā)策略。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種基于細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體的細(xì)菌藥物靶點(diǎn)及藥物，具體提供了以dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體作為細(xì)菌藥物靶點(diǎn)的新用途，以及一種基于dna模擬肽段和截短肽的抗菌策略，旨在通過特異性地結(jié)合并干擾細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體的形成或功能，從而有效抑制細(xì)菌的生長和繁殖，為抗菌治療開辟新途徑。

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種基于細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體的細(xì)菌藥物靶點(diǎn)，采用如下的技術(shù)方案：

3、一種基于細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體的細(xì)菌藥物靶點(diǎn)，所述細(xì)菌藥物靶點(diǎn)為細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶在細(xì)菌體內(nèi)形成的凝聚體結(jié)構(gòu)，所述凝聚體結(jié)構(gòu)對于細(xì)菌的dna復(fù)制、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄過程至關(guān)重要。

4、本發(fā)明識別了細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體作為一種新型的細(xì)菌藥物靶點(diǎn)，其中dna旋轉(zhuǎn)酶由兩個gyra和兩個gyrb亞基組成，形成一個四聚體復(fù)合物。

5、本發(fā)明通過生物信息學(xué)工具對細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶的gyra和gyrb亞基進(jìn)行分析，識別出可能參與生物凝聚體形成的無序區(qū)域(intrinsically?disordered?regions,?idrs)。之后，利用實驗方法驗證了以分枝桿菌為代表的細(xì)菌gyra和gyrb亞基具有形成生物凝聚體形成的能力。

6、進(jìn)一步地，利用從大腸桿菌中純化的gyra-yfp和/或gyrb-mcherry蛋白，建立體外凝聚體系統(tǒng)。將純化后的蛋白在特定實驗條件下進(jìn)行混合，并通過熒光顯微鏡在不同時間點(diǎn)監(jiān)測凝聚體的形成。結(jié)果表明，dna旋轉(zhuǎn)酶能夠在體外形成凝聚體。

7、使用frap（光漂白后熒光恢復(fù)）實驗分析凝聚體的動態(tài)特性。frap實驗的定量分析結(jié)果通過擬合歸一化熒光強(qiáng)度至單一指數(shù)函數(shù)，揭示了dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體的液態(tài)特性。

8、將純化的重組蛋白混合，具體地混合物包含0.25?pmol的線性化puc19質(zhì)粒dna和50?pmol的dna旋轉(zhuǎn)酶（由等量的50?pmol?gyra和gyrb組成）及50?pmol?dna?gyrase相互作用蛋白(a0qsy0)的截短體混合，利用1.5凝聚體形成能力的檢測方法，顯示dna旋轉(zhuǎn)酶液態(tài)凝聚體轉(zhuǎn)換為纖維狀。frap技術(shù)分析dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體動態(tài)變化的過程，結(jié)果顯示這些凝聚體展示出非液態(tài)特性。

9、在生物學(xué)研究中，固態(tài)或凝膠狀相的形成常常與疾病的發(fā)生密切相關(guān)，典型的例子包括退行性疾病和癌癥中的淀粉樣纖維（amyloid?fibrils）沉積。這類異常相態(tài)不僅會破壞細(xì)胞的正常生理功能，甚至可能直接引發(fā)細(xì)胞功能喪失或死亡?；谶@一現(xiàn)象的啟示，本發(fā)明進(jìn)一步研究了dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體的固態(tài)化過程，并探討其對細(xì)菌生長動力學(xué)可能產(chǎn)生的影響。

10、本發(fā)明的dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體為治療細(xì)菌疾病提供了新的可能性，可作為藥物篩選靶點(diǎn)。

11、第二方面，本發(fā)明提供了細(xì)菌藥物，采用如下的技術(shù)方案：

12、一種細(xì)菌藥物，以上述的基于細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體的細(xì)菌藥物靶點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計，能夠特異性地結(jié)合并干擾細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體的形成或功能，從而抑制細(xì)菌的生長和繁殖。

13、優(yōu)選的，所述細(xì)菌藥物為小分子化合物、多肽、抗體或其衍生物中的至少一種。

14、優(yōu)選的，所述細(xì)菌藥物為dna模擬肽段和截短肽。

15、優(yōu)選的，所述dna模擬肽段和截短肽是通過生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)設(shè)計并篩選得到的。

16、優(yōu)選的，所述dna模擬肽段為mfpa，其合成所需要的引物序列為：

17、f:ggaggtggaggaggtggaggtggaatgcgtataggggcaaacgg；

18、r:agtccaagctcagctaattaagcttgccgtggacggccagaccgt。

19、優(yōu)選的，所述細(xì)菌藥物以dna模擬肽段和截短肽為活性成分，還包括藥學(xué)上可接受的輔料。

20、優(yōu)選的，所述細(xì)菌藥物的制備方法包括將dna模擬肽段和截短肽與藥學(xué)上可接受的輔料混合均勻后制得。

21、優(yōu)選的，所述細(xì)菌藥物為片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、懸浮劑中的一種。

22、優(yōu)選的，所述細(xì)菌藥物表現(xiàn)出對細(xì)菌生長的抑制，可作為細(xì)菌疾病的治療劑。

23、綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：

24、本發(fā)明提供了一種基于細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體的細(xì)菌藥物靶點(diǎn)，為治療細(xì)菌疾病提供了新的可能性。

25、本發(fā)明的細(xì)菌藥物以細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體為藥物靶點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計，包括使dna旋轉(zhuǎn)酶的液態(tài)凝聚體向固態(tài)（纖維狀結(jié)構(gòu)）轉(zhuǎn)變的dna模擬肽段。通過在體外凝聚系統(tǒng)和大腸桿菌過夜培養(yǎng)液中分別添加mfpa蛋白，發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)dna旋轉(zhuǎn)酶液態(tài)凝聚體固化，并且對細(xì)菌的生長具有顯著的抑制作用，可作為細(xì)菌疾病的治療劑。

技術(shù)特征：

1.一種基于細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體的細(xì)菌藥物靶點(diǎn)，其特征在于，所述細(xì)菌藥物靶點(diǎn)為細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶在細(xì)菌體內(nèi)形成的凝聚體結(jié)構(gòu)。

2.一種細(xì)菌藥物，其特征在于，所述細(xì)菌藥物以權(quán)利要求1所述的基于細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體的細(xì)菌藥物靶點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計，能夠特異性地結(jié)合并干擾細(xì)菌dna旋轉(zhuǎn)酶凝聚體的形成或功能，從而抑制細(xì)菌的生長和繁殖。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述細(xì)菌藥物，其特征在于，所述細(xì)菌藥物為小分子化合物、多肽、抗體或其衍生物中的至少一種。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述細(xì)菌藥物，其特征在于，所述細(xì)菌藥物為dna模擬肽段和截短肽。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述細(xì)菌藥物，其特征在于，所述dna模擬肽段和截短肽是通過生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)設(shè)計并篩選得到的。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述細(xì)菌藥物，其特征在于，dna模擬肽段為mfpa，其合成所需要的引物序列為：

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述細(xì)菌藥物，其特征在于，所述細(xì)菌藥物以dna模擬肽段和截短肽為活性成分，還包括藥學(xué)上可接受的輔料。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述細(xì)菌藥物，其特征在于，所述細(xì)菌藥物的制備方法包括將dna模擬肽段和截短肽與藥學(xué)上可接受的輔料混合均勻后制得。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述細(xì)菌藥物，其特征在于，所述細(xì)菌藥物為片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、懸浮劑中的一種。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述細(xì)菌藥物，其特征在于，所述細(xì)菌藥物表現(xiàn)出對細(xì)菌生長的抑制，可作為治療細(xì)菌的治療劑。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種基于細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶凝聚體的細(xì)菌藥物靶點(diǎn)及藥物，所述細(xì)菌藥物靶點(diǎn)為細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶在細(xì)菌體內(nèi)形成的凝聚體結(jié)構(gòu)，所述凝聚體結(jié)構(gòu)對于細(xì)菌的DNA復(fù)制、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄過程至關(guān)重要；所述細(xì)菌藥物包含基于藥物靶點(diǎn)凝聚體結(jié)構(gòu)設(shè)計的DNA模擬肽段和截短肽；所述細(xì)菌藥物能夠靶向細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶凝聚體，包括DNA旋轉(zhuǎn)酶突變體，并干擾細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶凝聚體的形成或功能，從而抑制細(xì)菌的生長和繁殖。本發(fā)明的細(xì)菌藥物能夠誘導(dǎo)DNA旋轉(zhuǎn)酶液態(tài)凝聚體固態(tài)化，表現(xiàn)出對細(xì)菌生長的抑制，可作為細(xì)菌疾病的治療劑。

技術(shù)研發(fā)人員：米凱霞,蔣政,周心童,韓亞平
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江安吉吉檢醫(yī)療科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30