本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及mir-142-3p治療肺動(dòng)脈高壓的方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肺動(dòng)脈高壓是累及小動(dòng)脈的肺血管疾病，會(huì)導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓力及血管阻力增加；根據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)的標(biāo)準(zhǔn)，海平面、靜息狀態(tài)下右心導(dǎo)管測(cè)量平均肺動(dòng)脈壓(mpap)≥25mmhg，就診斷為肺動(dòng)脈高壓。肺動(dòng)脈高壓可分為原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓和繼發(fā)性肺動(dòng)脈高壓；前者發(fā)病率較低，大約1到2/百萬(wàn)人，后者則很常見(jiàn)，主要病因包括結(jié)締組織疾病、先天性心臟病、hiv感染、肺靜脈疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、血栓栓塞性疾病等。肺動(dòng)脈高壓的持續(xù)惡化進(jìn)展，會(huì)導(dǎo)致右心衰竭、靜脈淤血、重要器官靜脈回流受限等病理狀態(tài)，極易形成惡病質(zhì)，死亡率極高。目前肺動(dòng)脈高壓的治療還十分棘手，繼發(fā)性肺動(dòng)脈高壓主要是糾正病因，而原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓則治療手段不多，臨床常用的靶向藥物往往非常昂貴，總體臨床效果也不理想；因此，積極探索肺動(dòng)脈高壓的防治方法成為亟待解決的臨床問(wèn)題。針對(duì)目前現(xiàn)有對(duì)肺動(dòng)脈高壓診斷及治療的不足，本發(fā)明的目的在于提供mir-142-3p治療肺動(dòng)脈高壓的方法和應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，而提出的mir-142-3p治療肺動(dòng)脈高壓的方法和應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

3、mir-142-3p治療肺動(dòng)脈高壓的方法，該治療方法具體步驟如下：

4、ⅰ、制備慢病毒并進(jìn)行預(yù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；

5、ⅱ、檢測(cè)慢病毒對(duì)hpasmcs細(xì)胞增殖效率與遷移活性的影響；

6、ⅲ、選取并培養(yǎng)多組雄性sd大鼠以制備ph模型大鼠；

7、ⅳ、通過(guò)ph模型大鼠進(jìn)行血液動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)；

8、ⅴ、對(duì)實(shí)驗(yàn)后的ph模型大鼠進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析；

9、ⅵ、收集血液動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)與組織形態(tài)學(xué)分析結(jié)果并記錄。

10、作為本發(fā)明的進(jìn)一步方案，步驟ⅰ所述制備慢病毒具體步驟如下：

11、s1.1：通過(guò)blast公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，選擇與大鼠rno-mir-142-3p序列一致的has-mir-142-3p，并針對(duì)選擇的has-mir-142-3p的序列設(shè)計(jì)特異性引物，之后使用限制酶對(duì)gv260載體進(jìn)行線性化處理；

12、s1.2：通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)線性化效果，切割并純化所需片段，并配置pcr反應(yīng)體系，之后設(shè)置pcr循環(huán)條件，并將has-mir-142-3p置于pcr儀中進(jìn)行反應(yīng)，再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr產(chǎn)物，并純化目標(biāo)片段；

13、s1.3：將線性化的gv260載體與pcr擴(kuò)增得到的mirna片段混合，添加連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，再使用化學(xué)法或電轉(zhuǎn)法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中,在含有抗生素的lb瓊脂平板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，通過(guò)pcr或酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆；

14、s1.4：使用質(zhì)粒提取試劑盒從陽(yáng)性克隆中提取質(zhì)粒dna，使用限制酶切割提取的質(zhì)粒，以確認(rèn)插入片段的存在和正確性，再提交重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證mirna片段的正確序列，將經(jīng)過(guò)鑒定的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到適合的包裝細(xì)胞系中，添加病毒包裝質(zhì)粒，靜置48小時(shí)后收集細(xì)胞上清液，并經(jīng)過(guò)離心和過(guò)濾，以獲取純化的lv-mir-142-3p病毒。

15、作為本發(fā)明的進(jìn)一步方案，s1.2所述pcr反應(yīng)體系配置原料具體包括32.5μl的ddh2o、10μl的5xps?buffer、4μl的dntp?mix(2.5mm?each)、1μl的上游擴(kuò)增引物(10μm)、1μl的下游擴(kuò)增引物(10μm)、1μl的模板(10ng/μl)以及0.5μl的primestar?hsdna?polymerase；

16、上述模板來(lái)源為質(zhì)?；蚓海屹|(zhì)粒模板用量小于200ng，菌液模板用量為1μl。

17、作為本發(fā)明的進(jìn)一步方案，步驟ⅰ所述預(yù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)具體步驟如下：

18、s2.1：使用3-8代hpasmcs細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，在96孔板中，按照每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)鋪好細(xì)胞，并將96孔板放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細(xì)胞融合至20％～30％，按照1、5、10、15、50與100六組不同的moi值的要求，向每孔中加入對(duì)應(yīng)病毒濃度的對(duì)照病毒；

19、s2.2：將細(xì)胞在病毒溶液中培養(yǎng)12小時(shí)，并在培養(yǎng)期間輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板，以確保病毒與細(xì)胞充分接觸，12小時(shí)后，去除孔內(nèi)的病毒溶液，并換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72h；

20、s2.3：在72小時(shí)后，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，確認(rèn)病毒感染效果，同時(shí)拍照并記錄感染細(xì)胞的熒光信號(hào)，根據(jù)熒光顯微鏡觀察結(jié)果，選取表現(xiàn)最佳的moi值，并使用t25培養(yǎng)瓶，同時(shí)每瓶接種5×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞；

21、s2.4：待細(xì)胞融合至20％-30％時(shí)，加入lv-mir-142-3p病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染12小時(shí)后，換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，培養(yǎng)完成后，使用流式細(xì)胞儀篩選成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

22、作為本發(fā)明的進(jìn)一步方案，步驟ⅱ所述檢測(cè)慢病毒對(duì)hpasmcs細(xì)胞增殖效率與遷移活性的影響具體步驟如下：

23、s3.1：選取hpasmcs細(xì)胞作為cck-8實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁細(xì)胞加入胰酶消化，并輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，觀察細(xì)胞脫落情況，當(dāng)細(xì)胞脫落大于70％時(shí)，加血清終止消化，再將含有細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)移至離心管中，設(shè)置離心條件為1200rpm，離心3分鐘；

24、s3.2：離心完成后，棄去上清液，保留細(xì)胞沉淀，用含有血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照將1×104個(gè)/100ul細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)將細(xì)胞接種至96孔板中，設(shè)置一個(gè)不含細(xì)胞的空白對(duì)照組，以及3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，且每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，在周圍各孔加入200μl的pbs緩沖液；

25、s3.3：細(xì)胞接種后，放置于培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞貼壁12小時(shí)后，吸出各孔的培養(yǎng)基，空白組加入不含藥物的無(wú)血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入含10μg/ml脂多糖(lps)的無(wú)血清培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)12小時(shí)后，每孔再加入10μl?cck-8原液，并放入孵箱培養(yǎng)2小時(shí)后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度；

26、s3.4：選取hpasmcs細(xì)胞作為transwell實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，當(dāng)hpasmcs細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到90％時(shí)，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，消化后添加無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，在24孔板中，每孔先加入750μl完全培養(yǎng)基，隨后將transwell小室放入24孔板，且每個(gè)小室內(nèi)加入200μl細(xì)胞懸液；

27、s3.5：待細(xì)胞生長(zhǎng)至30-40％密度時(shí)，加入lps處理細(xì)胞，lps處理12小時(shí)后，用棉簽輕輕去除膜內(nèi)未遷移的細(xì)胞，隨后將小室放入結(jié)晶紫染液中，室溫下染色15分鐘，再用pbs將結(jié)晶紫染液清洗干凈，之后用注射器針頭輕輕取下transwell小室的薄膜；

28、s3.6：在載玻片上滴一滴中性樹(shù)膠，將薄膜倒扣于中性樹(shù)膠上后再取規(guī)定劑量的中性樹(shù)膠覆蓋后封片，并小心按壓排除氣泡，打開(kāi)倒置相差顯微鏡，采集各組細(xì)胞遷移圖像；

29、s3.7：收集并記錄cck-8實(shí)驗(yàn)以及transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并根據(jù)記錄的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，評(píng)估m(xù)ir-142-3p對(duì)人平滑肌細(xì)胞增殖效率以及遷移活性影響。

30、作為本發(fā)明的進(jìn)一步方案，步驟ⅲ所述制備ph模型大鼠具體步驟如下：

31、s4.1：選取30只180～250g的雄性sd大鼠，并按照每組10只將其劃分為a組、b組以及c組，之后將選取的雄性sd大鼠在spf級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性喂養(yǎng)三天；

32、s4.2：按照60mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)在喂養(yǎng)三天的a組雄性sd大鼠的腹腔內(nèi)注射生理鹽水，按照60mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)在喂養(yǎng)三天的b組雄性sd大鼠的腹腔內(nèi)注射野百合堿(mct)，按照60mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)在喂養(yǎng)三天的c組雄性sd大鼠的腹腔內(nèi)注射mct，并在c組每只雄性sd大鼠鼻腔滴注5μl的lv-mir-142-3p。

33、作為本發(fā)明的進(jìn)一步方案，步驟ⅳ所述血液動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)具體步驟如下：

34、s5.1：分別從a組、b組以及c組中選擇一只或多只ph模型大鼠，按照7ml/kg的標(biāo)準(zhǔn)使用20％烏拉坦對(duì)ph模型大鼠進(jìn)行麻醉處死后，在無(wú)菌條件下，用眼科剪剪開(kāi)頸部皮膚，并分離出右頸外靜脈，將預(yù)先填充有5％肝素鈉的聚乙烯導(dǎo)管與壓力傳感器相連，再緩慢將導(dǎo)管插入右頸外靜脈，直至進(jìn)入右心室；

35、s5.2：通過(guò)bl-420f生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連接導(dǎo)管，以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)三組ph模型大鼠右心室收縮壓(rvsp)，并在導(dǎo)管穩(wěn)定后，記錄基礎(chǔ)rvsp值，比較處理前后三組ph模型大鼠的rvsp的變化，并使用統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，確認(rèn)mir-142-3p過(guò)表達(dá)慢病毒滴鼻給藥后是否顯著改善野百合堿所致的右心室收縮壓升高；

36、s5.3：分別從a組、b組以及c組中選擇一只或多只ph模型大鼠，按照7ml/kg的標(biāo)準(zhǔn)使用20％烏拉坦對(duì)ph模型大鼠進(jìn)行麻醉處死后，用pbs清洗心肺外部血液，并立即取出左肺葉在-80℃冰箱凍存，再將右肺葉放置在4％多聚甲醛溶液中固定；

37、s5.4：分別將三組ph模型大鼠的心臟解剖分解成右心室、左心室和室間隔，使用天平稱量各部分的質(zhì)量，根據(jù)稱量的質(zhì)量計(jì)算fulton指數(shù)，即右心室肥厚指數(shù)rvhi值，比較三組ph模型大鼠的rvhi的變化，并確認(rèn)mir-142-3p過(guò)表達(dá)慢病毒滴鼻給藥后是否降低野百合堿所致的大鼠右心指數(shù)升高；

38、s5.5：隨機(jī)選取一只或多只b組ph模型大鼠，在選取的大鼠按照60mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)注射mct后的第1，3，5，7天，按照5mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)鼠尾靜脈注射nc(陰性對(duì)照)或者mimic(mir-142-3p類似物)，一周后，每隔6天注射nc或mir-142-3p?mimic，共進(jìn)行2次注射，并在28天后對(duì)ph模型大鼠進(jìn)行解剖，并測(cè)量rvsp值，將mir-142-3p?mimic組與nc組的rvsp進(jìn)行比較，評(píng)估m(xù)ir-142-3pmimic尾靜脈給藥后是否改善野百合堿所致大鼠右心室收縮壓升高；

39、s5.6：隨機(jī)選取一只或多只b組ph模型大鼠，在選取的大鼠按照60mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)注射mct后的第1，3，5，7天，按照5mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)鼠尾靜脈注射nc或者mimic，一周后，每隔6天注射nc或mir-142-3p?mimic，共進(jìn)行2次注射，并在28天后，按照7ml/kg的標(biāo)準(zhǔn)使用20％烏拉坦對(duì)ph模型大鼠進(jìn)行麻醉處死后，用pbs清洗心肺外部血液，并立即取出左肺葉在-80℃冰箱凍存，再將右肺葉放置在4％多聚甲醛溶液中固定；

40、s5.7：將ph模型大鼠的心臟解剖分解成右心室、左心室和室間隔，使用天平稱量各部分的質(zhì)量，根據(jù)稱量的質(zhì)量計(jì)算fulton指數(shù)，即rvhi值，比較ph模型大鼠的rvhi的變化，并確認(rèn)mir-142-3p過(guò)表達(dá)慢病毒尾靜脈給藥后是否降低野百合堿所致的大鼠右心指數(shù)升高；

41、s5.8：分別對(duì)放置在4％多聚甲醛溶液中固定的右肺葉進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析，并對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行比較分析。

42、作為本發(fā)明的進(jìn)一步方案，步驟ⅴ所述組織形態(tài)學(xué)分析具體步驟如下：

43、s6.1：當(dāng)右肺葉放置在4％多聚甲醛溶液中固定24小時(shí)后，用流水清洗肺組織3小時(shí)，以去除多聚甲醛，再使用不同濃度的乙醇對(duì)清洗后的肺組織進(jìn)行脫水，之后通過(guò)二甲苯對(duì)脫水后的肺組織進(jìn)行透明化處理，將處理后的肺組織放入石蠟中進(jìn)行浸蠟，浸蠟后，使用石蠟對(duì)肺組織進(jìn)行包埋，后將其置于低溫平臺(tái)上進(jìn)行凝固，當(dāng)蠟塊完全凝固時(shí)，使用切片機(jī)將組織處理成5μm厚度的切片；

44、s6.2：將肺組織切片在烤片機(jī)上，60℃烘烤2小時(shí)后，使用二甲苯對(duì)肺組織切片進(jìn)行脫蠟處理，并使用不同濃度的乙醇水化脫蠟完成的肺組織切片，再將處理后的肺組織切片放置在去離子水中；

45、s6.3：脫蠟水化完成后，對(duì)肺組織切片進(jìn)行h&e染色，在組織切片上滴加蘇木精染液，染色3分鐘，再用流水沖洗5分鐘，檢查染色程度，染色程度適當(dāng)后，使用1％鹽酸酒精對(duì)組織切片分化1秒，用自來(lái)水沖洗反藍(lán)20分鐘，之后在組織切片上滴加伊紅染液，染色8分鐘，流水沖洗2秒；

46、s6.4：h&e染色完成后，再使用不同濃度的乙醇對(duì)染色完成的肺組織進(jìn)行脫水，之后通過(guò)二甲苯對(duì)脫水后的肺組織進(jìn)行透明化處理，透明完成后，使用中性樹(shù)膠和蓋玻片將組織切片進(jìn)行封片，并在顯微鏡下觀察染色情況，并拍照保存，同時(shí)使用image?j圖像分析軟件進(jìn)行分析，以獲取mir-142-3p過(guò)表達(dá)慢病毒滴鼻給藥后改善野百合堿所致大鼠肺動(dòng)脈與肺小動(dòng)脈管腔狹窄的結(jié)果；

47、s6.5：對(duì)于染色完成后的各組大鼠肺組織，隨機(jī)選取5張切片，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野，檢測(cè)肺動(dòng)脈血管壁厚度及管腔面積，觀察肺動(dòng)脈狹窄情況，再隨機(jī)選擇直徑100±50μm的肺小動(dòng)脈10-12個(gè)，使用image?j軟件統(tǒng)計(jì)管壁橫截面積占管腔面積的比例，并分析mir-142-3p?mimic尾靜脈給藥后是否改善野百合堿所致的大鼠肺動(dòng)脈與肺小動(dòng)脈管腔狹窄。

48、mir-142-3p治療肺動(dòng)脈高壓的應(yīng)用，所述mir-142-3p在大鼠肺動(dòng)脈高壓模型肺組織中的mir-142-3p表達(dá)顯著降低，采用人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(hpasmcs)，觀察has-mir-142-3p對(duì)hpasmcs增殖和遷移的影響，結(jié)果顯示，has-mir-142-3p過(guò)表達(dá)慢病毒可以顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的hpasmcs的異常增殖與遷移；應(yīng)用mct建立大鼠肺動(dòng)脈高壓模型，并將mir-142-3p過(guò)表達(dá)慢病毒經(jīng)滴鼻入肺動(dòng)脈高壓模型大鼠，28天后觀察，與初始的模型大鼠相比，大鼠的右心室壓力、右心指數(shù)以及肺血管重構(gòu)等癥狀明顯得到改善；應(yīng)用mct建立大鼠肺動(dòng)脈高壓模型，并將合成的mir-142-3p?mimic鼠尾靜脈注射入肺動(dòng)脈高壓模型大鼠，28天后觀察，與初始的模型大鼠相比，大鼠的右心室壓力、右心指數(shù)以及肺血管重構(gòu)等癥狀明顯得到改善；應(yīng)用mct建立大鼠肺動(dòng)脈高壓模型，14天成模后，測(cè)量右心室壓力，觀察右心室大小，將合成的mir-142-3p?mimic注射進(jìn)入肺動(dòng)脈高壓模型大鼠尾靜脈，28天后觀察，與初始的模型大鼠相比，大鼠的右心室壓力、右心指數(shù)以及肺血管重構(gòu)明顯得到改善。

49、相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

50、該mir-142-3p治療肺動(dòng)脈高壓的方法和應(yīng)用中的mir-142-3p以經(jīng)滴鼻和鼠尾靜脈注射兩種方式，進(jìn)入體內(nèi)，具有很好的治療和預(yù)防效果，采用檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓的右心室壓力的方法，確定mir-142-3p的治療效果較好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組肺動(dòng)脈高壓比較，mir-142-3p可以很好的減低右心室壓力，且沒(méi)有明顯的全身毒性作用，包括病毒載體；根據(jù)鼻腔和全身的給藥效果，除了給藥方式和劑量不同，未見(jiàn)治療方面有何差異；可以根據(jù)不同的目的，選擇注射或滴鼻的方式給藥，且本發(fā)明上述mir-142-3p是體內(nèi)的生物成份，表觀遺傳學(xué)中microrna，對(duì)人體無(wú)害，合成容易，給藥容易，簡(jiǎn)單易行，生產(chǎn)成本不高。