本技術(shù)涉及一種可注射水凝膠體系及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)。

背景技術(shù)：

1、活性氧（reactive?oxygen?species,?ros）在生理上起著重要的作用，當(dāng)腫瘤細(xì)胞中ros水平突破閾值，會(huì)對細(xì)胞成分造成氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)一步凋亡或壞死。因此，基于ros的腫瘤治療策略在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顯示出巨大的前景。目前，外源性ros主要是在微酸性腫瘤微環(huán)境中通過光動(dòng)力、聲動(dòng)力以及化學(xué)動(dòng)力產(chǎn)生的。其中，化學(xué)動(dòng)力療法（chemodynamictherapy,?cdt）不需要借助外界能量或氧氣，主要依賴過渡金屬離子與過氧化氫發(fā)生芬頓或類芬頓反應(yīng)，即可產(chǎn)生細(xì)胞毒性的羥基自由基（?oh）。但受到腫瘤內(nèi)源性h2o2含量不足、生成的?oh快速清除以及嚴(yán)格的fenton反應(yīng)條件（ph?3~4）的限制，導(dǎo)致?oh介導(dǎo)的動(dòng)態(tài)療法的治療效果并不理想，限制了其進(jìn)一步在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。

2、隨著硫酸鹽自由基（?so4?）的出現(xiàn)，ros介導(dǎo)的化學(xué)動(dòng)力療法可以不依賴于腫瘤微環(huán)境并達(dá)到良好的抗腫瘤效果。?so4?與?oh的氧化電位相似，其氧化應(yīng)激能力可以對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生直接的氧化損傷，并且還能在不損傷正常細(xì)胞的情況下誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，?so4?具有更長的半衰期（30~40?μs），比?oh（半衰期小于1?μs）長約30倍，增大了其在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散距離，有效地殺死腫瘤細(xì)胞。通常在ph?2~9范圍內(nèi)，過渡金屬離子（鐵、鈷、銅）、光或熱可以通過激活過氧單硫酸鹽（peroxymonosulfate,?pms：?hso5?）和過氧二硫酸鹽（peroxodisulfate,?pds:?s2o8?）產(chǎn)生?so4?。通過比較兩種硫酸鹽自由基來源，pms由于其不對稱結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為比pds更容易被激活。由此，過氧單硫酸鈉納米粒子（na2s2o8nps）作為新的ros生成劑，其可以通過內(nèi)吞作用高效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而通過逐級降解產(chǎn)生?s2o82-，?s2o82-轉(zhuǎn)變?yōu)橛赾dt的有毒的?so4?和·oh，從而導(dǎo)致細(xì)胞快速裂解。但na2s2o8nps產(chǎn)生ros的過程是緩慢的，而考慮到在腫瘤部位，光熱深度受到限制，這導(dǎo)致上述ros生成劑的使用效果并不理想。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本技術(shù)第一目的，是提供了一種具有高效產(chǎn)生硫酸根自由基的可注射水凝膠體系，該可注射水凝膠體系能夠在體溫附近1?min內(nèi)成膠。

2、具體地，本技術(shù)是通過以下方案實(shí)現(xiàn)的：

3、一種可注射水凝膠體系，其特征在于：所述可注射水凝膠體系以絲素蛋白為主體，并負(fù)載有層狀金屬雙氫氧化物znfe-ldh和過氧單硫酸鈉納米粒子na2s2o8nps，其中，znfe-ldh與na2s2o8nps的濃度比為1:4~1:8。

4、本技術(shù)所提供的可注射水凝膠體系，可注射絲素蛋白水凝膠提供了負(fù)載和穩(wěn)定催化劑的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能夠在體溫附近快速成膠并能較為分散的負(fù)載兩種納米材料，而pms則通過催化反應(yīng)生成硫酸根自由。

5、申請人第二方面目的，是提供了上述可注射水凝膠體系的制備方法，將氨基酸表面活性劑溶于層狀金屬雙氫氧化物znfe-ldh的水溶液中并活化，加入可注射絲素蛋白，待可注射絲素蛋白溶解后，加入過氧單硫酸鈉納米粒子na2s2o8nps的水溶液，等待至成膠，得到可注射水凝膠體系，記作可注射水凝膠nso/zf@h。

6、進(jìn)一步的，作為優(yōu)選：

7、所述可注射絲素蛋白的分子量為10~15?kda（即相對分子量為10000~15000）。

8、所述可注射絲素蛋白的制備方法為：將na2co3水溶液煮沸，加入蠶繭并煮沸，換新na2co3水溶液煮沸脫膠后，用去離子水清洗，烘干，得到脫膠絲素；加溴化鋰溶液溶解脫膠絲素，得到完全溶解的絲素蛋白溶液，放入透析袋，在室溫下透析；最后冷凍干燥，得到可注射絲素蛋白。優(yōu)選的，透析時(shí)間為3天，每2?h換一次水。透析前，將溶解的絲素蛋白溶液離心去除未溶解的絲素。

9、在可注射絲素蛋白制備過程中，可以通過控制透析袋規(guī)格，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)可注射絲素蛋白的篩選。

10、所述活化的溫度為40~60?℃，活化時(shí)長為4~6?min。

11、所述氨基酸表面活性劑為月桂酰精氨酸鹽酸鹽（ethyl?lauroyl?argininehydrochloride:?lae）、月桂酰谷氨酸鈉（slg）、十二烷基硫酸鈉（sds）或水合膽酸鈉（sc）。

12、上述方案中，層狀金屬雙氫氧化物znfe-ldh的制備方法為：將naoh和na2co3混合水溶液在2?h內(nèi)逐滴加入到fe（no3）3·9h2oh和zn（no3）2·6h2o的混合水溶液中，控制ph至10附近，將所得懸浮液陳化，離心收集，洗滌，真空干燥，得到znfe-ldh粉末，

13、所述fe（no3）3·9h2oh和zn（no3）2·6h2o的混合水溶液中，zn/fe摩爾比為4:1~2:1。

14、上述方案中，過氧單硫酸鈉納米粒子na2s2o8nps的制備方法為：向正己烷與無水乙醇的混合溶液中加入油胺和油酸鈉，待油胺和油酸鈉完全溶解后，再加入過硫酸銨，待過硫酸銨完全溶解，離心，洗滌（優(yōu)選用正己烷和無水乙醇洗滌并離心），得到過氧單硫酸鈉納米粒子na2s2o8nps，

15、油胺、正己烷、無水乙醇的體積比是1:10:3；

16、油酸鈉與過硫酸銨的質(zhì)量比是3:2~2:1。

17、上述制備過程中，先提取低分子量的絲素蛋白（sf）并制備層狀雙氫氧化物、過硫酸鈉納米粒子；將lae溶于znfe-ldh溶液中在40?°c下活化五分鐘，冷卻至室溫加入sf，待sf溶解后加入na2s2o8溶液，放置37?°c水浴鍋中至成膠，得到水凝膠（zf/nso@h）。

18、na2s2o8nps在溶液中的穩(wěn)定性較差，本技術(shù)將znfe-ldh和na2s2o8nps載入具有生物相容性的可注射絲素蛋白（sf）水凝膠中，在將na2s2o8nps轉(zhuǎn)移到水溶液中中可以很好的延長其在水中的穩(wěn)定性；而絲素蛋白獨(dú)特的β-折疊結(jié)構(gòu)使其在形成水凝膠時(shí)表現(xiàn)出極佳的穩(wěn)定性和可塑性，兼之可調(diào)節(jié)的凝膠化條件和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，sf水凝膠能夠負(fù)載多種活性分子，并通過精準(zhǔn)設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)緩釋或刺激響應(yīng)，這是本技術(shù)以可注射絲素蛋白為本體的原因所在，也是其可以同時(shí)負(fù)載兩種活性組分的基礎(chǔ)所在，特別是分子量為10~15?kda的低分子量sf水凝膠，不僅可以避免腫瘤內(nèi)注射時(shí)納米顆粒的泄漏，有利于局部腫瘤的治療，還可以確保藥物在腫瘤區(qū)域的豐富積累，并減輕對正常組織的副作用。配合生物相容性的氨基酸表面活性劑——月桂酰精氨酸鹽酸鹽來誘導(dǎo)sf的超快速凝膠化，在加入znfe-ldh后，不僅可以縮短凝膠時(shí)間，降低溶液-凝膠轉(zhuǎn)變溫度，實(shí)現(xiàn)本技術(shù)所提供水凝膠體系在體溫附近可以1min內(nèi)成膠，還可以提高水凝膠力學(xué)性能，增加水凝膠的儲(chǔ)能模量和壓縮模量。

19、上述方案以絲素蛋白為主體，通過氨基酸活性劑鹽酸月桂酰精氨酸乙酯（lae）誘導(dǎo)絲素蛋白快速凝膠化，通過負(fù)載zn-fe層狀雙氫氧化物（znfe-ldh）催化過硫酸鈉（na2s2o8）納米粒子產(chǎn)生硫酸根自由基，故本技術(shù)第三方面目的，是提供了上述可注射水凝膠體系的應(yīng)用，該可注射水凝膠體系可用于藥物緩釋制劑的制備，也可以用于抗腫瘤制劑或抗腫瘤材料的制備。

20、以應(yīng)用于抗腫瘤制劑/材料的制備為例，本技術(shù)以可注射絲素蛋白水凝膠負(fù)載znfe-ldh和na2s2o8nps，不依賴腫瘤微環(huán)境的方式產(chǎn)生ros，從而介導(dǎo)和刺激腫瘤治療。當(dāng)該體系注射腫瘤內(nèi)后，水凝膠降解，釋放出?s2o82-，?s2o82-進(jìn)一步生成?so4?和?oh，刺激細(xì)胞凋亡達(dá)到體內(nèi)和體外腫瘤根除的效果，實(shí)現(xiàn)該水凝膠系統(tǒng)高效運(yùn)行。

21、本技術(shù)用催化劑激活pms的方法快速產(chǎn)生大量的ros。層狀金屬雙氫氧化物znfe-ldh是一種以陽離子金屬為主要成分的材料，具有層狀結(jié)構(gòu)，由數(shù)層帶正電荷的層與存在其中間平衡電荷的陰離子組成。上述特殊結(jié)構(gòu)賦予znfe-ldh良好的陰離子交換性能和較高的比表面積，從而表現(xiàn)出優(yōu)異的納米催化性能。當(dāng)可注射絲素蛋白負(fù)載的znfe-ldh與na2s2o8nps接觸時(shí)，層狀結(jié)構(gòu)中的金屬離子（fe）作為活性位點(diǎn)，催化na2s2o8nps的活化過程，金屬離子能夠與na2s2o8nps發(fā)生配位反應(yīng)生成過渡態(tài)離子，這些過渡態(tài)離子具有較強(qiáng)的氧化能力，能夠促進(jìn)na2s2o8nps的分解，產(chǎn)生活性氧自由基（如硫酸根自由基、羥基自由基等）。并且?guī)д姷膌dhs更傾向于與帶負(fù)電的細(xì)胞膜相互作用，能更有效地遞送至腫瘤部位。

22、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果包括：

23、（1）本發(fā)明制備的一種基于znfe-ldh納米片活化硫酸根自由基生成的可注射絲素蛋白水凝膠體系，對腫瘤細(xì)胞有一定的化學(xué)動(dòng)力殺傷作用，可應(yīng)用于化學(xué)動(dòng)力治療腫瘤方面。

24、（2）可注射水凝膠體系所負(fù)載znfe-ldh納米片可以活化所附載過氧單硫酸鈉納米粒子na2s2o8nps的硫酸根自由基，負(fù)載了znfe-ldh和na2s2o8nps的絲素蛋白水凝膠在體外表現(xiàn)出高效產(chǎn)生硫酸鹽自由基的能力。

25、（3）本發(fā)明對實(shí)驗(yàn)儀器的要求低，制備方法簡單易于操作，得到的水凝膠在機(jī)械性能、生物相容性和抗腫瘤性能等方面都有優(yōu)異的表現(xiàn)。