本發(fā)明屬于分子生物學，涉及模式昆蟲病毒病的防治方法，具體為1-甲基肌苷在制備防治家蠶血液型膿病藥物中的應用。

背景技術：

1、家蠶血液型膿病是由家蠶核型多角體病毒(bombyx?morinucleopolyhedrovirus，bmnpv)引起的一種嚴重的傳染性蠶病，是養(yǎng)蠶過程中最常見的病害之一。因其在家蠶發(fā)育的各個齡期均有發(fā)生，且在發(fā)病前的感染期沒有明顯的外部感染，故經(jīng)常導致發(fā)現(xiàn)時已呈現(xiàn)大面積感染特征。bmnpv屬桿狀病毒科，是一類專一感染節(jié)肢動物的有囊膜的dna病毒。它在病毒復制過程中會形成兩種病毒粒子，即包涵體衍生型病毒粒子(occlusion?derivedvirions，odv)與出芽型病毒粒子(buddedvirions，bv)，隨食物或者體壁傷口攝入的odv感染中腸上皮柱形細胞引起原發(fā)感染后，產(chǎn)生的bv繼發(fā)感染其他敏感組織和細胞引起水平傳播，最終導致宿主的全身性感染，而死亡病蠶、蛹、蛾的尸體、膿汁及被之污染的蠶糞、蠶具、蠶繭，也帶有大量的病毒，具有強烈的傳染性，是血液型膿病的主要傳染源。

2、目前對于家蠶血液型膿病的治療尚無特效藥物，生產(chǎn)上主要是通過使用化學消毒劑在整個養(yǎng)蠶周期進行消毒來防止病毒的感染和擴散,但這些措施僅能起到消毒、預防作用。而實際飼養(yǎng)過程中，家蠶血液型膿病的潛伏期短，發(fā)病快，感染時肉眼難以察覺，當肉眼發(fā)現(xiàn)時，則常處于發(fā)病晚期或是暴發(fā)期。且一旦病毒感染了蠶體，蠶農(nóng)根本束手無策。

3、現(xiàn)有技術中，已有試驗研究證明β-丙內(nèi)酯、萘啶酮酸等化合物對家蠶bmnpv感染后的發(fā)病程度具有一定的抑制效果，但其主要作用還是體現(xiàn)在預防而不是治療。1-甲基肌苷是一種有機化合物，由嘌呤和核苷組成，來源于肌苷，是其在dna合成過程中起類似核苷作用。本領域技術人員常將上述核苷類似物用于阻止病毒在受感染細胞中復制，目前1-甲基肌苷應用于病毒及bmnpv防治方面尚無專利和文獻報道。

技術實現(xiàn)思路

1、解決的技術問題：為了克服現(xiàn)有技術的不足，獲得一種針對家蠶血液型膿病、且兼具預防和治療功能的藥物，本發(fā)明提供了1-甲基肌苷在制備防治家蠶血液型膿病藥物中的應用。

2、技術方案：1-甲基肌苷在制備預防家蠶血液型膿病藥物中的應用。

3、1-甲基肌苷在制備治療家蠶血液型膿病藥物中的應用。

4、1-甲基肌苷在抑制家蠶細胞中bmnpv病毒復制或增殖中的應用。

5、優(yōu)選的，所述1-甲基肌苷的有效濃度為1-100μm。

6、優(yōu)選的，所述1-甲基肌苷的有效濃度為10μm。

7、優(yōu)選的，應用方法包括以下步驟：

8、s1、采用二甲基亞砜(dmso)溶解1-甲基肌苷，配制濃度為10mm的儲存液；

9、s2、bmnpv病毒感染家蠶細胞前添加1-甲基肌苷

10、在細胞培養(yǎng)皿中接種家蠶細胞，細胞貼壁后，培養(yǎng)皿中添加s1中的儲存液，使儲存液終濃度為1-100μm，在27℃條件下繼續(xù)孵育10-120min；然后用moi＝10、攜帶綠色熒光蛋白基因的bmnpv病毒感染細胞，27℃培養(yǎng)24小時，每孔加入10μl?mtt溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，每孔加入100μl?formazan，混勻后27℃培養(yǎng)3-4小時，560-600nm處測吸光值，檢測1-甲基肌苷對細胞活性的影響；

11、s3、bmnpv病毒感染家蠶細胞后添加1-甲基肌苷

12、在細胞培養(yǎng)皿中接種家蠶細胞，細胞貼壁后，用moi＝10、攜帶綠色熒光蛋白基因的bmnpv病毒感染細胞，并在感染后0、12、24、48、72、96小時后加入1-甲基肌苷儲存液，使儲存液終濃度為1-100μm，27℃培養(yǎng)，取細胞培養(yǎng)液用終點稀釋法測定病毒滴度。

13、優(yōu)選的，bmnpv病毒感染家蠶細胞前后，1-甲基肌苷能夠顯著抑制vp39，lef-1和pe38基因的轉錄表達。

14、有益效果：(1)本發(fā)明提供了1-甲基肌苷的一種新應用形式，用于制備家蠶血液型膿病防治藥物；(2)1-甲基肌苷使用終濃度在1μm以上時均可實現(xiàn)bmnpv復制或增殖的完全抑制，且不限制bmnpv感染前(預防)和感染后(治療)；(3)本發(fā)明為家蠶血液型膿病的防治藥物研發(fā)提供了新的思路，具有應用推廣價值。

技術特征：

1.1-甲基肌苷在制備預防家蠶血液型膿病藥物中的應用。

2.1-甲基肌苷在制備治療家蠶血液型膿病藥物中的應用。

3.1-甲基肌苷在抑制家蠶細胞中bmnpv病毒復制或增殖中的應用。

4.根據(jù)權利要求1-3任一所述的應用，其特征在于，所述1-甲基肌苷的有效濃度為1-100μm。

5.根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于，所述1-甲基肌苷的有效濃度為10μm。

6.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，應用方法包括以下步驟：

7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于，bmnpv病毒感染家蠶細胞前后，1-甲基肌苷能夠顯著抑制vp39，lef-1和pe38基因的轉錄表達。

技術總結
本發(fā)明公開了1?甲基肌苷在制備防治家蠶血液型膿病藥物中的應用，與現(xiàn)有技術相比，其優(yōu)點在于：(1)本發(fā)明提供了1?甲基肌苷的一種新應用形式，用于制備家蠶血液型膿病防治藥物；(2)1?甲基肌苷使用終濃度在1μM以上時均可實現(xiàn)BmNPV復制或增殖的完全抑制，且不限制BmNPV感染前(預防)和感染后(治療)；(3)本發(fā)明為家蠶血液型膿病的防治藥物研發(fā)提供了新的思路，具有應用推廣價值。

技術研發(fā)人員：錢平,于瓊,方昱佳,俞博涵,唐旭東
受保護的技術使用者：江蘇科技大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/2