本發(fā)明涉及生物制劑，涉及一種百合細胞外囊泡在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、百合屬因其出色的觀賞、食用和藥用價值而在世界范圍內(nèi)被廣泛種植。百合含有豐富的氨基酸、多糖、以及酚類、類黃酮和皂苷等生物活性成分，這些化合物已被證明具有多種藥用價值。盡管一些研究已經(jīng)探討了百合提取物在癌癥治療中的潛力，但其發(fā)揮抗腫瘤作用的具體成分仍未完全闡明。

2、細胞外囊泡是一類具有脂質(zhì)膜包被的囊泡，其內(nèi)包裹著蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等活性大分子，由細胞分泌到質(zhì)外體，對細胞間的交流至關(guān)重要。1967年，植物細胞外囊泡首次在胡蘿卜中被發(fā)現(xiàn)。植物細胞外囊泡具有豐富的核酸、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，且與動物來源的細胞外囊泡相比，植物細胞外囊泡因來源于可食用植物，因此不僅無毒，且產(chǎn)率高、生物相容性好，具有非免疫原性。經(jīng)廣泛研究表明，從各種可食用植物中提取的細胞外囊泡具備抗炎、抗癌、抗病毒、抗氧化等多種治療作用，具有研發(fā)為藥物制劑并高效治療一系列人類疾病的藥用潛力；且具有生物活性的植物細胞外囊泡還可作為載體遞送核酸、多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子，如封裝藥物并協(xié)同增強其治療效果。近年來，植物來源細胞外囊泡因其豐富的生物特性和應(yīng)用潛力，已成為一個新的研究熱點。

3、巨噬細胞是單核-巨噬細胞系統(tǒng)的重要組成部分，負責(zé)體內(nèi)的免疫防御和組織修復(fù)。由于巨噬細胞可以識別和攝取外來納米囊泡，因此它們成為納米藥物開發(fā)中的理想靶標(biāo)。研究表明，來源于哺乳動物細胞的天然或改良細胞外囊泡能夠在巨噬細胞中誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)，抑制腫瘤的生長。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tams）是腫瘤的重要組成部分，已知tams在促進腫瘤生長、血管生成和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。因此，tams被認為是癌癥免疫治療的潛在靶標(biāo)。通過改變tams的表型，從腫瘤促進的m2型轉(zhuǎn)化為腫瘤抑制的m1型，是目前的一種重要抗癌策略。

4、中國發(fā)明專利cn116726152a提供了一種中草藥衍生囊泡樣顆粒嵌合的腫瘤疫苗及其制備方法和應(yīng)用。所述腫瘤疫苗由中草藥囊泡樣顆粒與腫瘤細胞膜融合后制得。中草藥囊泡樣顆粒與腫瘤細胞膜的融合比例為1:1-1:10(w/w)。制備方法包括分離制備中草藥囊泡樣顆粒，提取自體腫瘤細胞膜，將所述中草藥囊泡樣顆粒與腫瘤細胞膜融合，得到中草藥囊泡樣顆粒嵌合的個性化腫瘤疫苗。該技術(shù)的個性化腫瘤疫苗在增強樹突狀細胞吞噬的同時，可誘導(dǎo)樹突狀細胞成熟，產(chǎn)生高效的抗腫瘤免疫反應(yīng)及抗腫瘤免疫記憶，最終抑制腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。然而，該技術(shù)未提供能夠調(diào)控巨噬細胞由m2向m1型轉(zhuǎn)變的百合細胞外囊泡及其制備方法。

5、中國發(fā)明專利cn117210384a提供了一種滇重樓來源細胞外囊泡及其分離提取方法與應(yīng)用。所述方法為先將滇重樓塊莖研磨，獲得滇重樓塊莖汁液，通過多次低速離心去除大顆粒滇重樓組織，同時通過8％?peg8000，以對低速離心后的滇重樓外囊泡進行沉淀；沉淀后通過蔗糖梯度超速離心純化細胞外囊泡。這種分離提取方法材料來源廣泛，成本低，試劑易得，操作簡單，能高效的分離提取出滇重樓細胞外囊泡，有助于植物細胞來源的細胞外囊泡提取技術(shù)的發(fā)展，也有助于后期開發(fā)新型納米載藥材料。然而，該技術(shù)未提供能夠調(diào)控巨噬細胞由m2向m1型轉(zhuǎn)變的百合細胞外囊泡及其制備方法。

6、綜上，現(xiàn)有技術(shù)均未能提供一種能夠調(diào)控巨噬細胞由m2向m1型轉(zhuǎn)變的百合細胞外囊泡及其制備方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)未能提供一種能夠調(diào)控巨噬細胞由m2向m1型轉(zhuǎn)變的百合細胞外囊泡及其制備方法的問題，本發(fā)明提供了一種百合細胞外囊泡在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，首次成功從百合鱗莖中分離并純化了細胞外囊泡（lilium?derivedexosomes，ldes）。通過透射電子顯微鏡（tem）和納米顆粒追蹤分析（nta）顯示，這些細胞外囊泡具有典型的茶托狀結(jié)構(gòu)，完整且穩(wěn)定，粒徑分布約為235?nm。通過細胞死活染色和cck-8試驗驗證了其良好的生物相容性。隨后，使用百合來源的細胞外囊泡處理m2型巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)m2型巨噬細胞成功極化為m1型。免疫熒光染色和流式細胞術(shù)進一步支持了這一結(jié)論，證實百合來源的細胞外囊泡在調(diào)控巨噬細胞極化方面的顯著作用?？傮w而言，本發(fā)明首次揭示了百合來源細胞外囊泡在巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)中的潛力，表明其在腫瘤抑制方面的應(yīng)用前景，為開發(fā)基于植物來源細胞外囊泡的癌癥免疫治療提供了新的思路。

2、為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，一方面，本發(fā)明提供一種百合細胞外囊泡在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用，所述百合細胞外囊泡的制備方法包括以下步驟：

3、s1、將百合鱗莖組織榨汁后過濾，得到百合鱗莖原液；

4、s2、將步驟s1得到的百合鱗莖原液進行處理，獲得百合細胞外囊泡提取液；

5、s3、將步驟s2得到的百合細胞外囊泡提取液濃縮純化，獲得百合細胞外囊泡；

6、其中，步驟s2中，所述處理包括離心和濾膜過濾。

7、所述藥物可制備成丸劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、粉劑、片劑、錠劑和注射劑等給藥劑型，針對不同的劑型可選擇本領(lǐng)域合適的藥物載體。

8、所使用的藥物載體可以是固體、液體或氣體。固體載體示例包括乳糖、白陶土、蔗糖、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸鎂和硬脂酸。液體載體的例子包括糖漿、花生油、橄欖油和水。氣體載體的例子包括二氧化碳和氮氣。

9、在制備口服劑型的藥物時，可以使用任何方便的藥物介質(zhì)。例如，水、乙醇、油、醇、調(diào)味劑、防腐劑、著色劑等可用于形成口服液體制劑，如混懸劑、劑和溶液；而載體，如淀粉、糖類、微晶纖維素、稀釋劑、制粒劑、乳化劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑可用于形成口服固體制劑，如粉劑、膠囊劑和片劑。由于其易于給藥，片劑和膠囊是使用固體藥物載體的優(yōu)選口服劑量單位?？蛇x擇使用標(biāo)準(zhǔn)水性或非水性技術(shù)對片劑進行包衣。

10、含有本發(fā)明制備的百合細胞外囊泡的片劑藥物可以通過壓片或模塑制備，可選擇使用一種或多種輔助成分或佐劑?？赏ㄟ^在適當(dāng)?shù)臋C器中以自由流動的形式(如粉末或顆粒)壓片活性成分，可選擇與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性物質(zhì)或分散劑混合來制備壓片。模制片劑可在適當(dāng)?shù)臋C器中模制，即用惰性液體稀釋劑潤濕的粉末狀化合物混合物。每片優(yōu)選含有約0.05mg至約5g活性成分，每個小袋或膠囊優(yōu)選含有約0.05mg至約5g活性成分。例如，擬用于人體口服給藥的制劑可能含有約0.5mg至約5g活性藥物，與適量且方便的載體材料混合，其可能約占總組成的5％至95％。單位劑型通常含有約1mg至約2g活性成分，通常為25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、800mg或1000mg。

11、本發(fā)明中適用于胃腸外給藥的藥物可制備為水溶液或混懸液?？梢园ㄟm當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣?，例如羥丙基纖維素。也可以在甘油、液體聚乙二醇和其油混合物中制備分散體。此外，可以加入防腐劑以防止微生物的有害生長。

12、本發(fā)明中適用于注射使用的藥物包括無菌水溶液或分散體。此外，該藥物可以無菌粉末的形式，用于臨時制備此類無菌注射液或分散體。在所有情況下，最終注射形式必須是無菌的，并且必須是有效的液體，以便于可注射性藥物成分必須在生產(chǎn)和儲存條件下保持穩(wěn)定；因此，最好應(yīng)保存，以防止微生物(如細菌和真菌)的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)、植物油及其合適的混合物。

13、本發(fā)明的藥物可以是適合局部使用的形式，例如氣霧劑、乳膏、軟膏、洗劑、粉劑或類似物。此外，藥物可以是適當(dāng)?shù)男问接糜谕钙そo藥裝置?？梢允褂帽景l(fā)明的藥物，通過常規(guī)處理方法制備這些處方。例如，通過混合親水性材料和水，以及約5wt％至約10wt％的化合物，制備具有所需稠度的乳膏或軟膏。

14、本發(fā)明的藥物可以是適用于直腸給藥的形式，其中載體是固體。最好將混合物制成單位劑量栓劑。合適的載體包括可可脂和其他本領(lǐng)域中常用的材料。栓劑可通過首先形成混合含有軟化或熔化載體的組合物，隨后在模具中冷卻和塑形。

15、除上述載體成分外，上述藥物可能包括(如適用)一種或多種額外的載體成分，如稀釋劑、緩沖液、矯味劑、粘合劑、表面活性劑、增稠劑、潤滑劑、防腐劑(包括抗氧化劑)等。此外，可加入其它輔料，例如乳糖、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等、著色劑和矯味劑等。使制劑與預(yù)期受體的血液等滲。還可以粉末或濃縮液形式制備含有本發(fā)明百合細胞外囊泡的組分。

16、優(yōu)選地，所述腫瘤治療藥物的有效成分包括所述百合細胞外囊泡。

17、更優(yōu)選地，所述腫瘤治療藥物的有效成分為所述百合細胞外囊泡。

18、優(yōu)選地，所述腫瘤治療藥物為腫瘤免疫治療藥物。

19、更優(yōu)選地，所述腫瘤免疫治療藥物為腫瘤區(qū)域巨噬細胞活化免疫治療藥物。

20、再優(yōu)選地，所述腫瘤區(qū)域巨噬細胞活化免疫治療藥物為調(diào)控腫瘤區(qū)域巨噬細胞由m2型向m1型轉(zhuǎn)化的腫瘤免疫治療藥物。

21、優(yōu)選地，步驟s1中，所述百合鱗莖組織選自蘭州百合干鱗莖組織、新鮮蘭州百合鱗莖組織中的至少一種。

22、更優(yōu)選地，步驟s1中，所述榨汁包括以下步驟：取百合鱗莖組織洗凈，與pbs溶液混合，使用榨汁機榨汁。

23、再優(yōu)選地，步驟s1中，所述混合具體為：

24、每克新鮮蘭州百合鱗莖組織與1ml?pbs溶液混合，或者每克蘭州百合干鱗莖組織與1ml?pbs溶液混合。

25、更優(yōu)選地，所述使用榨汁機榨汁的時間為2-5min。

26、更優(yōu)選地，所述pbs溶液的溫度為3-5℃，再優(yōu)選為4℃。

27、更優(yōu)選地，步驟s1中，所述過濾為使用無菌紗布過濾。

28、優(yōu)選地，步驟s2中，所述處理還包括酶解。

29、優(yōu)選地，步驟s3中，所述濃縮純化包括使用超濾管進行濃縮純化、使用色譜柱進行濃縮純化中的至少一種。

30、另一方面，本發(fā)明提供了上述的應(yīng)用中制備的腫瘤治療藥物。

31、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果包括：

32、本發(fā)明提供了一種百合細胞外囊泡及其制備方法，該方法制備的細胞外囊泡具有良好的生物相容性，能夠顯著地誘導(dǎo)巨噬細胞向m1型極化、激活巨噬細胞免疫效應(yīng)，進而起到抗腫瘤的作用。