本發(fā)明涉及微小殘留病灶智能化檢測，具體而言，涉及一種基于超高深度測序的微小殘留病灶檢測方法及系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

1、循環(huán)腫瘤dna（ctdna）作為生物標(biāo)志物在實(shí)體瘤微小殘留病灶（mrd）檢測中的重要作用，已經(jīng)被越來越多的臨床隊(duì)列證明。通過液體活檢技術(shù)和生物信息學(xué)方法，檢測并識別ctdna信號，可用于預(yù)測多種實(shí)體瘤根治性治療后的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。然而，基于ctdna的mrd檢測在臨床應(yīng)用上仍然存在一系列技術(shù)和生物學(xué)的挑戰(zhàn)。

2、在mrd檢測中，由于血液游離dna有豐富的來源，往往僅有痕量dna是腫瘤來源釋放的，同時(shí)，克隆性造血來源的變異、腫瘤異質(zhì)性帶來的亞克隆變異、以及其他未知來源的變異，都會導(dǎo)致真實(shí)的ctdna信號水平低且難以識別，ctdna水平低是造成mrd檢測假陰性的重要因素。另一方面，樣本處理和建庫測序環(huán)節(jié)產(chǎn)生的技術(shù)性噪音，例如文庫制備過程中的dna鏈損傷、雜交捕獲過程中的損傷、pcr擴(kuò)增過程中的擴(kuò)增錯誤、以及測序過程產(chǎn)生的測序錯誤，是造成mrd檢測假陽性的主要因素。

3、當(dāng)前mrd檢測策略包含兩類，一類是tumor-agonostic策略，采用全基因組的方式，不依賴先驗(yàn)的變異圖譜信息，通過甲基化或片段組學(xué)的方式富集信號；另一類是tumor-informed策略，同時(shí)追蹤多個已知腫瘤來源的基因組變異，通過識別對應(yīng)的變異基因型，進(jìn)而判斷ctdna水平。tumor-agonostic的策略，雖然單次檢測的操作環(huán)節(jié)少，但范圍廣且低深度的技術(shù)路線，需要復(fù)雜的生物信息學(xué)算法以及匹配的基線模型，難以泛化腫瘤特異性的信號，特異性存在不足。而tumor-informed策略，雖然增加了腫瘤先驗(yàn)的依賴，但在構(gòu)建好變異圖譜之后，聯(lián)合追蹤個性化的變異，具有非常高的靈敏度和特異性。

4、目前基于腫瘤先驗(yàn)的mrd檢測，根據(jù)技術(shù)路線的不同，抑制背景噪音的方式也有側(cè)重。在群體定制化panel中，主要利用健康群體構(gòu)建的背景基線模型，通過統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)區(qū)分背景噪音；而在個體定制化panel中，主要利用分子標(biāo)簽技術(shù)得到共識堿基，通過自身來源的基因組上下游context三聚體作為背景，如c[a>t]g、c[g>a]g等進(jìn)行分類，評估樣本內(nèi)的背景錯誤率。

5、利用健康人隊(duì)列數(shù)據(jù)建立背景噪音數(shù)據(jù)庫，對于每個檢測到的變異，檢驗(yàn)血漿樣本中的頻率與正常人群背景數(shù)據(jù)庫中的頻率之間的顯著性，以判斷該變異是否可能是腫瘤來源的，從而排除假陽性結(jié)果。這種方式忽略了數(shù)據(jù)樣本間的差異，缺少對技術(shù)性噪音來源的分層分析，批次效應(yīng)導(dǎo)致的偏離噪音無法完全去除。建庫測序環(huán)節(jié)升級也需要較大成本重新建立背景噪音數(shù)據(jù)庫作為基線，耗時(shí)耗力。

6、利用基因組背景context的三聚體，計(jì)算樣本自身特異性的背景噪音錯誤率，結(jié)合檢測位點(diǎn)的深度和支持?jǐn)?shù)劃分閾值，作為位點(diǎn)判定的依據(jù)。此方法對于背景評估過于籠統(tǒng)，沒有充分利用數(shù)據(jù)，對背景噪音來源層次缺乏分解，難以均衡特異性和靈敏度。此外，背景噪音評估與富集真實(shí)信號的模型相對分離，對血漿中ctdna判定缺乏有效模型，對于ctdna的定量也缺乏有效可解釋的模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是旨在通過分子標(biāo)簽技術(shù)下的超飽和測序，系統(tǒng)性地識別和評估區(qū)分ngs各環(huán)節(jié)中引入的噪音，并對不同水平的背景錯誤進(jìn)行特征提取和統(tǒng)計(jì)建模，同時(shí)建立一套抑制噪音和富集信號的ctdna評估模型，提高mrd檢測的特異性和靈敏度。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本技術(shù)提供了一種基于超高深度測序的微小殘留病灶檢測方法，包括以下步驟：

3、基于測序文庫，按照樣本索引進(jìn)行拆分獲取待測樣本，并根據(jù)待測樣本的分子標(biāo)識符，得到共識序列；

4、基于共識序列，通過過濾掉質(zhì)量值小于25或者family?size小于3的共識序列，聯(lián)合subtype類型和距片段邊緣距離，作為引入原始核酸分子鏈上的噪音水平；聯(lián)合context和鏈特異性，對pcr水平的噪音進(jìn)行評估。

5、基于噪音水平，結(jié)合腫瘤先驗(yàn)知識，估計(jì)ctdna水平，通過檢驗(yàn)分子信號來源的顯著性，從而確定mrd狀態(tài)。

6、優(yōu)選地，在獲取測序文庫的過程中，通過連接接頭的方式向核酸分子添加測序接頭，將接頭-核酸結(jié)合體通過聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，建立測序文庫，其中，接頭為分子標(biāo)識符。

7、優(yōu)選地，在獲取待測樣本的分子標(biāo)識符的過程中，去除待測樣本的接頭和低質(zhì)量測序讀段，進(jìn)行序列比對后，獲取分子標(biāo)識符。

8、優(yōu)選地，在獲取共識序列的過程中，按照分子標(biāo)識符和比對到參考基因組的位置，將測序讀段進(jìn)行分組，將重復(fù)測序讀段上的堿基序列按投票法，形成共識序列。

9、優(yōu)選地，在評估噪音水平的過程中，將組內(nèi)同時(shí)包含源自正鏈模板和負(fù)鏈模板的測序讀段對，作為第一共識序列duplex；將共識序列只由單側(cè)模板鏈的測序讀段對形成，即只包含正鏈或者負(fù)鏈的測序讀段，作為第二共識序列simplex；

10、根據(jù)第一共識序列duplex和第二共識序列simplex，進(jìn)行噪音水平的評估。

11、優(yōu)選地，在評估噪音水平的過程中，排除高頻（vaf＞=1%）的未知變異、已知來源的腫瘤體細(xì)胞變異位點(diǎn)、克隆性造血變異以及胚系變異后，根據(jù)第一共識序列duplex聯(lián)合subtype類型和距片段邊緣距離，對引入原始核酸分子鏈上的噪音水平進(jìn)行評估。第二共識序列simplex聯(lián)合context和鏈特異性，對pcr水平的噪音進(jìn)行評估。

12、優(yōu)選地，在結(jié)合腫瘤先驗(yàn)知識的過程中，在高腫瘤占比（＞=20%）的樣本中識別變異，通過配對的白細(xì)胞對照樣本數(shù)據(jù)扣除胚系變異和克隆性造血變異，確定腫瘤來源的體細(xì)胞變異信息；結(jié)合先驗(yàn)樣本的信息，對體細(xì)胞變異進(jìn)行分類聚類和定量排序，分類類別為主客隆和亞克隆，定量指標(biāo)為拷貝數(shù)和變異豐度，將變異根據(jù)豐度高低進(jìn)行過濾和排序，獲得可追蹤變異集合，構(gòu)建用于腫瘤先驗(yàn)的變異圖譜。

13、優(yōu)選地，在獲取可追蹤變異集合的過程中，將單堿基點(diǎn)突變、短片段插入或缺失突變、以及長片段結(jié)構(gòu)突變作為可追蹤變異集合，其中，點(diǎn)突變、短插入缺失的噪音，通過基因組背景context、邊緣距離、鏈變異方向的特征進(jìn)行建模評估；結(jié)構(gòu)變異片段的噪音，通過變異方向、split長度特征進(jìn)行建模評估。

14、優(yōu)選地，在確定mrd狀態(tài)的過程中，基于待測樣本的深度信息，根據(jù)用于評估第一噪音和評估第二噪音的評估模型，通過計(jì)算多個變異下支持分子數(shù)目的最大似然概率，估計(jì)ctdna水平，獲取評估不同循環(huán)腫瘤占比的期望分子數(shù)目并計(jì)算概率，通過似然比檢驗(yàn)判定顯著性，從而確定mrd狀態(tài)。

15、本發(fā)明公開了一種基于超高深度測序的微小殘留病灶檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于實(shí)現(xiàn)上述的一種基于超高深度測序的微小殘留病灶檢測方法，該系統(tǒng)，包括：

16、數(shù)據(jù)處理單元，用于基于測序文庫，按照樣本索引進(jìn)行拆分獲取待測樣本，并根據(jù)待測樣本的分子標(biāo)識符，得到共識序列；

17、噪音水平評估單元，用于基于共識序列，通過過濾掉質(zhì)量值小于25或者familysize小于3的共識序列，聯(lián)合subtype類型和距片段邊緣距離，作為引入原始核酸分子鏈上的噪音水平；

18、檢測單元，用于基于噪音水平，結(jié)合腫瘤先驗(yàn)知識，估計(jì)ctdna水平，通過檢驗(yàn)分子信號來源的顯著性，從而確定mrd狀態(tài)。

19、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

20、本發(fā)明能夠區(qū)分ngs檢測過程中的噪音來源，并且評估不同環(huán)節(jié)引入噪音的特征以及水平，同時(shí)還能用于橫向比較不同實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)引入的噪音高低，例如，duplex水平噪音能反映cfdna樣本鋸齒狀末端的程度和損傷程度，simplex?水平噪音能反映樣本pcr擴(kuò)增和捕獲過程中的帶來的噪音水平，進(jìn)一步也能用于反應(yīng)建庫擴(kuò)增捕獲過程中試劑的性能。

21、在納入出了腫瘤組織等位基因頻率外的拷貝數(shù)和克隆情況的信息能夠準(zhǔn)確反應(yīng)腫瘤組織的腫瘤占比，結(jié)合分層噪音模型用于分析血漿樣本中信號來源于腫瘤組織的顯著性。