本發(fā)明屬于惡性膠質(zhì)瘤，特別涉及一種用于惡性膠質(zhì)瘤治療的靶向藥物、制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、惡性膠質(zhì)瘤，源自神經(jīng)上皮的腫瘤統(tǒng)稱為膠質(zhì)瘤（膠質(zhì)細(xì)胞瘤），占顱腦腫瘤的40-50%，是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤。在全世界范圍內(nèi)原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生率約是6.3例/每年每十萬人，其中，男性患者3.7例、女性患者2.6例。雖然原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤發(fā)生率不高，但其致死率很高。根據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，惡性腫瘤已經(jīng)成為我國第一位致死疾病。惡性膠質(zhì)瘤也是成年人最好發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，并且其也是最難治療的惡性腫瘤之一。目前，國內(nèi)外對于膠質(zhì)瘤的治療較普遍和傳統(tǒng)的治療手段主要是手術(shù)和放化療，但由于原發(fā)灶的位置和血腦屏障等原因，其治療效果并不理想。而且目前并沒有專門針對惡性膠質(zhì)瘤的藥物，使得惡性膠質(zhì)瘤的治療過程不安全，副作用大。

2、研究表明惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織可表達(dá)腫瘤特異性表達(dá)的氯離子通道（glioma-specific?chloride?ion?channel,gcc），該氯離子通道對從以色列金蝎中分離出來的氯霉素（ctx）顯示出特異的敏感型。因此，這類氯通道可以被作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的特異標(biāo)記物或靶點(diǎn)用來治療這類神經(jīng)膠質(zhì)瘤。

3、卡奇霉素（calicheamicins，clm）是從稀有放線茵小單孢菌發(fā)酵液中分離得到的烯二炔類抗腫瘤抗生素。clm是有效的細(xì)胞毒性試劑，可引起dna雙鏈斷裂。卡奇霉素抑制dna合成?？ㄆ婷顾卦诮】岛湍[瘤細(xì)胞中均與dna結(jié)合，導(dǎo)致分裂和細(xì)胞死亡。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提出一種用于惡性膠質(zhì)瘤治療的靶向藥物、制備方法及應(yīng)用，解決了目前沒有專門針對惡性膠質(zhì)瘤藥物的問題。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

3、一種用于惡性膠質(zhì)瘤治療的靶向藥物，該藥物為卡奇霉素與氯霉素的化學(xué)交聯(lián)復(fù)合物。

4、一種用于惡性膠質(zhì)瘤治療的靶向藥物的制備方法，具體包括以下步驟：

5、s1、構(gòu)建pgex-4t-1-his-ctx原核表達(dá)載體，獲得6×his-ctx基因；

6、s2、gst-6×his-ctx的原核表達(dá)與純化；

7、s3、gst-6×his-ctx的酶切與6×his-ctx的純化；

8、s4、ctx的體外折疊與純化；

9、s5、ctx的spdp化學(xué)標(biāo)記及純化；

10、s6、clm的末端巰基還原與純化；

11、s7、ctx與clm化學(xué)交聯(lián)與純化。

12、可選的，步驟s1中，構(gòu)建pgex-4t-1-his-ctx原核表達(dá)載體的dna引物對，所述引物對的上游序列為seq?id?no：1（5′-cgcggatccatgcatcaccatcacca-3′），所述引物對的下游序列為seq?id?no：2（5′-ccgctcgagttaacggcacagacact-3′），dna引物對通過pcr獲得了6×his-ctx基因；

13、步驟s1中，pcr擴(kuò)增得到的6×his-ctx基因經(jīng)電泳檢測和凝膠純化后，用限制性內(nèi)切酶bamhⅰ和xhoⅰ在37℃對其處理過夜，再次凝膠純化后，與經(jīng)過同樣處理的pgex-4t-1載體在16℃下連接過夜，連接產(chǎn)物通過熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh12s中，涂到帶有氨芐抗性的平板，37℃過夜培養(yǎng)，次日挑單克隆于lb培養(yǎng)基中，37℃、200rpm搖菌過夜，最后抽提質(zhì)粒。

14、可選的，步驟s2中，將構(gòu)建好pgex-4t-1-his-ctx原核表達(dá)載體熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21中，涂到帶有氨芐抗性的平板，37℃過夜培養(yǎng)，次日挑單克隆于lb培養(yǎng)基中，37℃、200rpm搖菌過夜,次日將菌液按1:100接種的tb培養(yǎng)基中，37℃、200rpm搖菌培養(yǎng)至od600=2.5左右時，加入iptg終濃度為1mm,然后16℃，170rpm搖菌培養(yǎng)20小時后離心收集菌體，菌體重懸于pbs緩沖液中后，-20℃保存待用；

15、在重懸的菌體中加入蛋白酶抑制劑pmsf，壓力破胞，再加入dnaseⅰ消化0.5～1小時，待dnaseⅰ消化結(jié)束后加入終濃度為0.2m/l的亞硫酸鈉，室溫反應(yīng)0.5小時后，再加入終濃度為0.15m/l的連四硫酸鈉，室溫反應(yīng)1.5小時后，離心，取上清用0.42μm的膜過濾；

16、用上樣緩沖液沖洗ni2+-chelating?sepharose?fast?flow親和柱至基線，將上述上清過柱，上樣結(jié)束后繼續(xù)用上樣緩沖液沖洗親和柱至基線，然后用含30mm/l咪唑的pbs洗脫，待基線沖平后用含100mm/l咪唑的pbs洗脫并收集洗脫峰，最后用tricine-sds-page檢測洗脫樣品。

17、可選的，步驟s3中，對步驟s2中收集的洗脫峰先通過超濾濃縮成5～10ml體積后加入腸激酶于25℃酶切過夜，酶切用tricine?sds-page檢測，離心并上預(yù)裝的g-50分子篩，并收集洗脫峰。

18、可選的，步驟s4中，含有ctx的洗脫樣品中加入精氨酸至終濃度為0.5m/l,加sds至終濃度為1mm/l后調(diào)ph值至8.5，冰浴預(yù)冷0.5～1小時左右至0℃，預(yù)冷后再向洗脫液中先后加入gsh和gssg均至1mm/l，混勻并冰浴折疊反應(yīng)2小時,折疊產(chǎn)物用tfa調(diào)酸離心后，用c18反相柱hplc純化。

19、可選的，步驟s5中，在反應(yīng)體系：50mm磷酸鈉,150mmnacl,ph=8.0中，重組的ctx與spdp按摩爾比為1:1室溫反應(yīng)1小時后，用tfa調(diào)酸，hplc純化。

20、可選的，步驟s6中，在反應(yīng)體系：50mm磷酸鈉,150mm?nacl,ph=8.0，500mm?dtt,dmso與水比例1:1中，室溫反應(yīng)1小時，用tfa調(diào)酸，hplc純化。

21、可選的，步驟s7中，純化后的spdp標(biāo)記的ctx和2-亞氨基硫烷鹽酸鹽標(biāo)記的豹蛙酶，按摩爾比約為1:1在反應(yīng)體系：50mm磷酸鈉,150mm?nacl,ph=8.0，dmso與水比例1:1中室溫反應(yīng)0.5小時，用tfa調(diào)酸，hplc純化。

22、卡奇霉素與氯霉素的化學(xué)交聯(lián)復(fù)合物在治療惡性膠質(zhì)瘤方面的應(yīng)用。

23、采用了上述技術(shù)方案后，本發(fā)明的有益效果是：

24、本發(fā)明制備了一種ctx和clm的化學(xué)交聯(lián)復(fù)合物（ctx-clm），該復(fù)合物有潛在靶向治療惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用。ctx作為靶向的彈頭，將復(fù)合物定向引導(dǎo)并結(jié)合在與惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤特異性表達(dá)的氯離子通道上，然后導(dǎo)致復(fù)合物通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而將clm導(dǎo)入細(xì)胞中，發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。

技術(shù)特征：

1.一種用于惡性膠質(zhì)瘤治療的靶向藥物，其特征在于，該藥物為卡奇霉素與氯霉素的化學(xué)交聯(lián)復(fù)合物。

2.一種用于惡性膠質(zhì)瘤治療的靶向藥物的制備方法，其特征在于，該制備方法用于制備權(quán)利要求1中的卡奇霉素與氯霉素的化學(xué)交聯(lián)復(fù)合物，該制備方法具體包括以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于惡性膠質(zhì)瘤治療的靶向藥物的制備方法，其特征在于，步驟s1中，構(gòu)建pgex-4t-1-his-ctx原核表達(dá)載體的dna引物對，所述引物對的上游序列為seq?id?no：1，所述引物對的下游序列為seq?id?no：2，dna引物對通過pcr獲得了6×his-ctx基因；

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于惡性膠質(zhì)瘤治療的靶向藥物的制備方法，其特征在于，步驟s2中，將構(gòu)建好pgex-4t-1-his-ctx原核表達(dá)載體熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21中，涂到帶有氨芐抗性的平板，過夜培養(yǎng)，次日挑單克隆于lb培養(yǎng)基中，搖菌過夜,次日將菌液接種到tb培養(yǎng)基中，搖菌培養(yǎng)后，加入iptg，再次搖菌培養(yǎng)后離心收集菌體，菌體重懸于pbs中；

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于惡性膠質(zhì)瘤治療的靶向藥物的制備方法，其特征在于，步驟s3中，對步驟s2中收集的洗脫峰先通過超濾濃縮成5～10ml體積后加入腸激酶，進(jìn)行酶切過夜，酶切用tricine?sds-page檢測，離心并上預(yù)裝的g-50分子篩，并收集洗脫峰。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于惡性膠質(zhì)瘤治療的靶向藥物的制備方法，其特征在于，步驟s4中，含有ctx的洗脫樣品中加入精氨酸、十二烷基硫酸鈉，調(diào)ph值至8.5，冰浴預(yù)冷至0℃，預(yù)冷后再向洗脫液中先后加入gsh和gssg，混勻并冰浴折疊反應(yīng),折疊產(chǎn)物用tfa調(diào)酸離心后，用c18反相柱hplc純化。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種用于惡性膠質(zhì)瘤治療的靶向藥物的制備方法，其特征在于，步驟s5中，在反應(yīng)體系：50mm磷酸鈉,150mmnacl,ph=8.0中，重組的ctx與spdp按摩爾比為1:1室溫反應(yīng)后，用tfa調(diào)酸，hplc純化。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種用于惡性膠質(zhì)瘤治療的靶向藥物的制備方法，其特征在于，步驟s6中，在反應(yīng)體系：50mm磷酸鈉,150mm?nacl,ph=8.0，500mm?dtt,dmso與水比例1:1中，室溫反應(yīng)后，用tfa調(diào)酸，hplc純化。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種用于惡性膠質(zhì)瘤治療的靶向藥物的制備方法，其特征在于，步驟s7中，純化后的spdp標(biāo)記的ctx和2-亞氨基硫烷鹽酸鹽標(biāo)記的豹蛙酶，按摩爾比1:1在反應(yīng)體系：50mm磷酸鈉,150mm?nacl,ph=8.0，dmso與水比例1:1中，室溫反應(yīng)后，用tfa調(diào)酸，hplc純化。

10.卡奇霉素與氯霉素的化學(xué)交聯(lián)復(fù)合物在治療惡性膠質(zhì)瘤方面的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于惡性膠質(zhì)瘤技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于惡性膠質(zhì)瘤治療的靶向藥物、制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明制備了一種CTX和CLM的化學(xué)交聯(lián)復(fù)合物，該復(fù)合物有潛在靶向治療惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用，CTX作為靶向的彈頭，將復(fù)合物定向引導(dǎo)并結(jié)合在與惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤特異性表達(dá)的氯離子通道上，然后導(dǎo)致復(fù)合物通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而將CLM導(dǎo)入細(xì)胞中，發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。

技術(shù)研發(fā)人員：王曉敏,武雋忞,張茂,馮月蘭
受保護(hù)的技術(shù)使用者：包頭市中心醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9