專利名稱:治療神經(jīng)損傷及再生神經(jīng)細(xì)胞的載體構(gòu)建體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療神經(jīng)損傷或再生神經(jīng)細(xì)胞的方法及其載體構(gòu)建體，特別涉及一種治療神經(jīng)損傷或再生神經(jīng)細(xì)胞之載體構(gòu)建體的制備方法與用途。
背景技術(shù)：
在發(fā)生物理橫切傷、外傷、挫傷、擠壓傷、手術(shù)損傷或血管藥理傷害包括出血性或缺氧傷害、神經(jīng)退化、其它精神疾病所造成之急性或慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，可能需要再生神經(jīng)細(xì)胞并恢復(fù)切除神經(jīng)組織(denervated tissues)內(nèi)之神經(jīng)連結(jié)。
在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，一般修復(fù)受損神經(jīng)的方式是對患者進(jìn)行神經(jīng)縫合手術(shù)以及神經(jīng)移植，其它可行的神經(jīng)損傷治療包括移植新的神經(jīng)細(xì)胞與支撐細(xì)胞、遞送蛋白質(zhì)以刺激在脊椎神經(jīng)內(nèi)之細(xì)胞再生及減低抑制腦細(xì)胞再生之策略。部分研究發(fā)現(xiàn)在大鼠脊椎神經(jīng)損害部位或附近直接施以神經(jīng)修復(fù)劑能修復(fù)受損的脊椎神經(jīng)(Cheng等人，1996，Science 273510-513)。
美國專利申請公開號US20040267289之內(nèi)容披露了修復(fù)神經(jīng)根的方法，包括將脊椎動物之一部分末梢神經(jīng)系統(tǒng)移近脊椎動物之一部分中樞或末梢神經(jīng)系統(tǒng)，并在兩部分間之縫隙敷上包含生長因子、纖維素源及其它重要元素的纖維蛋白膠混合物，使脊椎動物的該部分末梢神經(jīng)系統(tǒng)與該部分中樞或末梢神經(jīng)系統(tǒng)之間形成功能性連結(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面提供了一種治療神經(jīng)損傷的方法，包括遞送酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)之編碼基因至神經(jīng)損傷部位，并在神經(jīng)損傷部位表達(dá)該基因。
本發(fā)明另一方面提供了一種治療神經(jīng)損傷的載體構(gòu)建體，包括承載aFGF之編碼基因的病毒載體。
本發(fā)明再一方面提供了一種再生神經(jīng)細(xì)胞的方法，包括遞送aFGF之編碼基因至神經(jīng)細(xì)胞，并在神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)該基因。
本發(fā)明又一方面提供了一種再生神經(jīng)細(xì)胞的載體構(gòu)建體，包括承載aFGF之編碼基因的病毒載體。



前述內(nèi)容及以下的發(fā)明詳細(xì)說明，當(dāng)參照附圖時，將更佳地被了解。為了說明本發(fā)明之目的，在附圖顯示目前為較佳的具體實施例。然而，應(yīng)了解的是，本發(fā)明不限于所顯示之確切排列及方法。
在附圖中圖1A為一載體圖，表示了A2殖株載體承載如SEQ ID NO1所示之人類aFGF基因；圖1B為一載體圖，表示了A4殖株載體承載如SEQ ID NO1所示之人類aFGF基因以及rep基因；圖1C為一載體圖，表示了腺相關(guān)病毒(AAV)噬菌體雜合噬質(zhì)粒載體承載如SEQ ID NO1所示之人類aFGF基因、延長因子、聚腺苷酸化及土撥鼠肝炎病毒后轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptionalregulatory element)序列；圖1D為一載體圖，表示了AAV噬菌體輔助載體承載rep-2與cap-2基因；圖2A為一條狀圖，呈現(xiàn)PC12細(xì)胞在AAV-aFGF之不同滴定濃度的腦神經(jīng)分化。
圖2B為一條狀圖，呈現(xiàn)PC12細(xì)胞在AAV-aFGF之不同滴定濃度的細(xì)胞增生。
圖3A與3B為條狀圖，呈現(xiàn)活體外AAV-aFGF表達(dá)的定量分析，其中圖3A顯示蛋白印跡(Western Blot)分析在PC12細(xì)胞所分析的aFGF表達(dá)量，圖3B顯示蛋白印跡(Western Blot)分析在胞外區(qū)域所分析的aFGF表達(dá)量。
圖4為一顯微圖像，顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞在大鼠脊椎神經(jīng)的腹角區(qū)域表達(dá)aFGF；圖5A-5C為條狀圖，呈現(xiàn)活體內(nèi)AAV-aFGF表達(dá)之定量蛋白印跡(Western Blot)分析，其中圖5A顯示在AAV-aFGF之不同滴定濃度時，aFGF mRNA在脊椎組織的絕對表達(dá)量，圖5B顯示在AAV-aFGF之不同滴定濃度時，aFGF在脊椎組織的校準(zhǔn)表達(dá)量，及圖5C顯示在AAV-aFGF之不同滴定濃度時，純化aFGF在脊椎組織的校準(zhǔn)表達(dá)量；以及圖6A與6B為條狀圖，呈現(xiàn)aFGF基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對行為評估的影響。
具體實施方式
為使本
發(fā)明內(nèi)容
清楚易懂，以下將對所使用的專有名詞做更詳盡的解釋。
在此所使用的冠詞“一”意指一或多于一(也就是至少一)的文法對象之冠詞，除非另行解釋該冠詞僅為以單一觀念的特定使用。
“載體”是指包括分離核酸的物質(zhì)組合，并可將該分離核酸輸送至細(xì)胞內(nèi)部。多數(shù)的公知載體包括但不限于線性聚核苷酸、與離子性或兩性化合物(ionic or amphiphilic compounds)有關(guān)之聚核苷酸、質(zhì)粒及病毒。因此“載體”一詞包括自主復(fù)制質(zhì)?；虿《荆矐?yīng)解釋為包括能加速核酸轉(zhuǎn)入細(xì)胞之非質(zhì)粒與非病毒化合物，例如多離胺酸化合物、微脂體及其類似物。病毒載體的例子包括但不限于腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體及類似物。
“腺相關(guān)病毒(AAV)載體”是取自于血清型腺相關(guān)病毒的載體，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5及AAVX7。
AAV載體也包括轉(zhuǎn)錄序列，如聚腺苷酸化位點(diǎn)(polyadenylation site)，還有選擇性標(biāo)記或報導(dǎo)基因、增強(qiáng)子序列及其它能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄之控制要素。
AAV病毒粒子是指完整的病毒粒子，AAV病毒粒子可為野生型AAV病毒粒子(包括線性單鏈AAV核酸基因體與AAV外殼結(jié)合，也就是蛋白質(zhì)外鞘)或重組AAV病毒粒子。AAV病毒粒子能裝入單鏈AAV核酸分子(如一般定義的有義鏈/編碼鏈或無義鏈/非編碼鏈)，有義鏈與無義鏈均具有相同感染力。
“基因”是指聚核苷酸，包含至少一個開放讀碼區(qū)能在轉(zhuǎn)錄或翻譯后編碼特定多肽或蛋白質(zhì)，可使用在此所述之任何多核苷酸序列來辨識相關(guān)基因的較大片段或全長編碼序列，而分離較大片段序列的方法為所屬技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知。
互補(bǔ)脫氧核糖核酸庫只包含由細(xì)胞內(nèi)信息核糖核酸分子所合成之互補(bǔ)脫氧核糖核酸分子。
引物是指聚核苷酸，能與特定聚核苷酸模板產(chǎn)生專一性雜合并在合成互補(bǔ)聚核苷酸時提供起始點(diǎn)。在引發(fā)合成條件下(也就是當(dāng)核苷酸、互補(bǔ)聚核苷酸模板及聚合化試劑，如DNA聚合酶存在時)放置聚核苷酸引物會發(fā)生此合成。引物一般為單鏈，但也可能為雙鏈。引物一般為脫氧核糖核酸，但在許多應(yīng)用中亦可使用多種合成及天然引物。引物是與模板互補(bǔ)并可設(shè)計為與模板雜合以作為合成的起始位點(diǎn)，但不必反映模板的確切序列。在此情況下，引物與模板的專一性雜合取決于雜合條件之嚴(yán)苛度?？梢园l(fā)色性、放射活性或熒光性分子部分標(biāo)記引物，并作為可檢測之分子部分。
寡核苷酸一般是指不超過大約50核苷酸的短聚核苷酸，并且當(dāng)核苷序列是由DNA序列(也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C))所表示時，也包括了RNA序列(也就是A、尿嘧啶(U)、G、C)，其中U取代T。
定序引物是寡核苷酸引物，能與至少部分聚合苷酸互補(bǔ)并能通過DNA或RNA聚合酶類，如DNA聚合酶所延長，其中以公知方法結(jié)合定序引物到聚核苷酸并延長引物產(chǎn)生了與至少部分聚合苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸轉(zhuǎn)錄本。
“報導(dǎo)基因”在此是指可由已知方法檢測表達(dá)之基因，例如大腸桿菌的半乳糖酶(lacZ)基因可作為培養(yǎng)基內(nèi)的報導(dǎo)基因，因為能使用已知方法通過對培養(yǎng)基添加呈色基質(zhì)ο-硝基苯-β-半乳糖甘酶，檢測lacZ基因的表達(dá)(Gerhardt等人，1994，Method for General and Molecular Bacteriology，美國微生物學(xué)會，哥倫比亞特區(qū)，華盛頓，第574頁)。
“啟動子/調(diào)節(jié)序列”是指需要表達(dá)與啟動子/調(diào)節(jié)序列連結(jié)運(yùn)作之基因產(chǎn)物的核酸序列。例如，此序列可為核心啟動子序列，又例如，此序列也可包括增強(qiáng)子序列及需要表達(dá)基因產(chǎn)物之其它調(diào)節(jié)元件。啟動子/調(diào)節(jié)序列能以組織專一性方式表達(dá)基因產(chǎn)物。
限制位點(diǎn)是指由限制性核酸內(nèi)切酶所辨識之部分雙鏈核酸。當(dāng)核酸與內(nèi)切酶接觸時，如限制性核酸內(nèi)切酶可在該部分切割核酸的兩條鏈，限制性核酸內(nèi)切酶便能辨識部分的雙鏈核酸。
“轉(zhuǎn)染”是將基因物質(zhì)，如核酸放入培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的一種方法。
“感染”根據(jù)醫(yī)學(xué)字典的解釋是以感染生物或包括細(xì)菌、寄生蟲、真菌、病毒、朊毒體(prions)及類病毒(viroids)等利用宿主生物加倍繁殖之病源體對宿主生物的有害群聚。根據(jù)本發(fā)明的一較佳實施例，“感染”一詞為無害的病毒感染，使病毒基因物質(zhì)能引進(jìn)適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，且病毒能通過最外表面的蛋白進(jìn)行辨識。病毒核酸使用細(xì)胞內(nèi)宿主系統(tǒng)(host machinery)復(fù)制病毒核酸、病毒所需的酶及病毒包覆蛋白。
神經(jīng)損傷一詞是指物理橫切傷、外傷、挫傷、擠壓傷、手術(shù)損傷、血管藥理傷害包括出血性或缺氧傷害、神經(jīng)退化、其它精神疾病或造成神經(jīng)受損或有害情況之其它因素所造成的急性或慢性神經(jīng)損傷或有害情況。
多肽是指由氨基酸殘基、相關(guān)天然結(jié)構(gòu)變異及其非天然合成同源物通過肽鍵連結(jié)所組成的聚合物、相關(guān)天然結(jié)構(gòu)變異及其非天然合成同源物，合成多肽能使用自動多肽合成機(jī)進(jìn)行合成，在此使用已知記號描繪多肽序列多肽序列的左手端為胺基，多肽序列的右手端為羧基。
本發(fā)明涉及一種改善神經(jīng)損傷的方法，包括傳遞酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)之編碼基因到神經(jīng)損傷區(qū)域，接著在該神經(jīng)損傷區(qū)域表達(dá)該基因，其中aFGF基因可轉(zhuǎn)錄成aFGF信使核糖核酸或更進(jìn)一步翻譯為aFGF多肽。神經(jīng)損傷區(qū)域可為神經(jīng)器官、神經(jīng)組織、可轉(zhuǎn)導(dǎo)載體之神經(jīng)細(xì)胞系統(tǒng)、或神經(jīng)細(xì)胞或其突起所存在部位，包括但不限于神經(jīng)軸突路徑。
根據(jù)本發(fā)明一較佳實施例，aFGF基因具有如SEQ ID NO1所示之DNA序列。請參照圖1A至1D，載體的構(gòu)建體包括如SEQ ID NO1所示之a(chǎn)FGF基因，載體可為病毒載體，包括將載體裝入病毒粒子的病毒基因體，病毒基因體可為重組病毒，如重組腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、痘病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒的基因體。根據(jù)本發(fā)明，可使用任何病毒載體將aFGF基因?qū)胨拗骷?xì)胞基因體，而較佳的病毒載體至少包括腺相關(guān)病毒基因與腺病毒基因的其中之一。載體構(gòu)建體也包括報導(dǎo)基因，較佳為細(xì)菌lacZ的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)。可使用所屬技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知的方法構(gòu)建表達(dá)載體，包含結(jié)合了適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄/翻譯控制因子的aFGF編碼序列，這些方法包括Sambrook等人1992年在紐約冷泉港實驗室實驗手冊之分子克隆部分所描述的體外重組DNA技術(shù)。
根據(jù)本發(fā)明的另一較佳實施例，載體可構(gòu)建為包括具有如SEQ IDNO2所示之氨基酸序列的aFGF編碼基因，如SEQ ID NO2所示的aFGF包括如SEQ ID NO2所示之a(chǎn)FGF多肽折疊成不同型式與蛋白質(zhì)構(gòu)型。
根據(jù)本發(fā)明的又一實施例，載體包括人腦cDNA庫所取得的aFGFcDNA。然而載體構(gòu)建體不應(yīng)僅限于此，視所需的神經(jīng)損傷治療或神經(jīng)再生種類，構(gòu)建載體時可使用其它物種的aFGF基因。
此外，載體至少是質(zhì)粒與噬菌體的其中之一，例如AAV質(zhì)粒，如Samulski等人首先披露的pSub201(Journal of Virology，1987，Vol.61，No.10，pp.3096-3101)，此載體包含所有克隆入質(zhì)粒骨干的腺相關(guān)病毒第二型(AAV-2)野生型編碼區(qū)域以及順式調(diào)控終端重復(fù)區(qū)域(cis-acting terminalrepeats)，此載體相當(dāng)適合克隆，因其設(shè)計使限制酶XbaI的限制消化能移除AAV編碼區(qū)域而維持質(zhì)粒骨干內(nèi)的AAV終端重復(fù)區(qū)域不受破壞。
載體還包含輔助質(zhì)粒pDG(Grimm等人(1998))具有AAV繁殖所需的AAV基因(rep及cap)以及輔助基因以產(chǎn)生重組AAV，此質(zhì)粒提供擴(kuò)增及包裝AAV載體所需的AAV與腺病毒基因功能。
因此，較佳的AAV粒子包裝是以磷酸鈣質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方式對細(xì)胞共同轉(zhuǎn)染載有aFGF cDNA的pSub201質(zhì)粒以及包裝AAV的pDG輔助質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞內(nèi)包裝成熟病毒粒子，而本實施例的宿主細(xì)胞可為HEK293細(xì)胞。
有關(guān)治療神經(jīng)損傷的方法，遞送包含aFGF基因之載體至神經(jīng)損傷部位的其它方式包括以病毒載體感染神經(jīng)損傷部位，注射載有aFGF基因的病毒粒子至神經(jīng)損傷部位，以及利用所屬技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方式，如電穿孔法(electroporation)、顯微鏡下注射法(microinjection)、微脂體轉(zhuǎn)染試劑、多聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)、脂類轉(zhuǎn)染試劑(effectene)、以及活化樹枝狀高分子(activated-dendrimers)將aFGF基因轉(zhuǎn)染到神經(jīng)損傷部位。
另外，改善神經(jīng)損傷的方法包括以具有aFGF基因的病毒粒子感染神經(jīng)損傷部位，而使aFGF表達(dá)在神經(jīng)損傷部位。病毒粒子可根據(jù)溶原性路徑(lysogenic pathway)感染神經(jīng)損傷部位，其中在神經(jīng)損傷部位之細(xì)胞基因體的特定位點(diǎn)導(dǎo)入aFGF基因并在復(fù)制細(xì)胞時復(fù)制基因。病毒載體可為含病毒載體包裝成載有aFGF cDNA的病毒粒子，較佳的病毒粒子為pPAM-AAV質(zhì)粒包含人類aFGF及/或細(xì)菌lacZ的cDNA。
根據(jù)本發(fā)明另一實施例，也提供了一種神經(jīng)再生的方法，包括遞送載體包括aFGF基因到神經(jīng)細(xì)胞，在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)aFGF基因，接著轉(zhuǎn)錄并翻譯aFGF基因以便在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生aFGF多肽。表達(dá)aFGF的神經(jīng)細(xì)胞也可能包括星狀細(xì)胞、寡凸細(xì)胞、神經(jīng)膠細(xì)胞、脈絡(luò)叢細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、腦脊椎神經(jīng)膜細(xì)胞、許旺氏細(xì)胞(Schwann cell)、神經(jīng)母細(xì)胞、微膠細(xì)胞、脊椎神經(jīng)組織內(nèi)細(xì)胞及可以上述載體構(gòu)建轉(zhuǎn)型的神經(jīng)源細(xì)胞株，如嗜鉻細(xì)胞瘤(pheochromocytoma，PC12)細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的一較佳實施例，aFGF基因可為具有如SEQ ID NO1所示之DNA序列的基因，或具有如SEQ ID NO2所示之氨基酸序列的aFGF之編碼基因，aFGF基因可與多種不同啟動子/增強(qiáng)子元件結(jié)合，其包括但不限于啟動子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及其它基因表達(dá)調(diào)控序列，如延長因子、聚腺苷酸化序列、長終端重復(fù)區(qū)域、及抗生素抗藥性基因。這些載體之表達(dá)元件可具有不同強(qiáng)度與專一性，并且視所使用之宿主/載體系統(tǒng)，可使用多數(shù)適當(dāng)轉(zhuǎn)錄及翻譯元件的其中之一。啟動子的形式可能是與所需基因自然結(jié)合的啟動子。另外，DNA的位置可能受重組或異性啟動子，也就是通常不與此基因聯(lián)合之啟動子所控制。啟動子在任何情況下包括有效連結(jié)的啟動子，是指啟動子在上述任何實施例啟動如SEQ ID NO1所示之a(chǎn)FGF基因轉(zhuǎn)錄的情況。
本發(fā)明將由以下之實例做進(jìn)一步說明，但不應(yīng)以此限定本發(fā)明之范圍。
實例1構(gòu)建pPAM-AAV質(zhì)粒包含全長人類aFGF cDNA并產(chǎn)生AAV-aFGF粒子構(gòu)建pPAM-AAV質(zhì)粒包含人類aFGF及/或細(xì)菌lacZ的cDNA如下，首先克隆并擴(kuò)增人類aFGF eDNA，使用擴(kuò)充高精確度PCR系統(tǒng)(RocheDiagnostics有限公司，德國Nonnenwald)對由人腦cDNA基因庫(ClontechLaboratories公司，美國，加州，山景市)所取得之人類aFGF cDNA以下列條件，包括在95℃進(jìn)行30秒、60℃進(jìn)行60秒、及72℃進(jìn)行30秒的30個循環(huán)之PCR步驟，進(jìn)行人類aFGF的PCR分析。對于對照載體，則以下列條件，在95℃進(jìn)行30秒、55℃進(jìn)行60秒、及72℃進(jìn)行30秒的30個循環(huán)之PCR反應(yīng)由pDNR-lacZ供體報導(dǎo)子(Clontech Laboratories公司，美國，加州，山景市)擴(kuò)增全長細(xì)菌lacZ cDNA的報導(dǎo)基因。aFGF及/或細(xì)菌lacZ的引物購自于生工有限公司(臺灣，臺北)，其序列所列如下。
人類aFGF的引物(正向定序引物位置為如SEQ ID NO3所示的5’-ATGGCTGAAGGGGAAATC-3’；及反向定序引物位置為如SEQ ID NO4所示的5’-TTAATCAGAAGAGACTGGCAGGGG-3’)細(xì)菌lacZ的引物(正向定序引物位置為如SEQ ID NO5所示的5’-ATGTCGTTTACTTTACTTTGACCAACAAG-3’；及反向定序引物位置為如SEQ ID NO6所示的5’-CTTTTTTTGACACCAGACCAACTGG-3’)。
直接將擴(kuò)增的片段克隆到pGEM-T easy TA載體系統(tǒng)(Promega公司，美國，威斯康星州，麥迪遜市)，以取得如圖1A所示的A2殖株包含人類aFGF之cDNA，接著以限制酶EcoRI消化A2殖株并溶離，使含有人類aFGF序列的溶離片段與EcoRI-消化pBluescript-SK質(zhì)粒(Stratagene公司，美國，加州，拉荷雅市)連接，結(jié)果產(chǎn)生含aFGF序列之pBluescript質(zhì)粒并與兩個可能方向的精確序列查對后，顯示為圖1B的A4殖株。隨后通過連接A4殖株之較小片段與限制酶HindIII/XbaI所共同消化之pSub201質(zhì)粒，產(chǎn)生含有人類aFGF cDNA的AAV質(zhì)粒。載有人類aFGF cDNA的AAV質(zhì)粒如圖1C顯示為pPAM-AAV并在隨后的實例簡稱為AAV-aFGF。含有野生型AAV基因體以及重組輔助質(zhì)粒pDG的質(zhì)粒pSub201是由馬許醫(yī)生(臺北榮民總醫(yī)院，整形手術(shù)科)(參考數(shù)據(jù)The Journal of Trauma，March2003；54(3)569-73，“以腺相關(guān)病毒載體進(jìn)入蟹足腫組織的基因療法”)所贈。
通過磷酸鈣質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法在HEK293細(xì)胞(Life Technology公司，美國，紐約州，長島市)包裝成熟病毒粒子。AAV粒子的包裝如圖1D所示，以載有aFGF cDNA的pPAM-AAV質(zhì)粒以及含有野生型AAV與AAV包裝所需之腺病毒基因的pDG輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時以棉棒收集細(xì)胞，懸浮在Opti-MEN溶液(GibcoInvitrogen公司，美國，加州，卡爾斯巴德)并以高頻聲波分裂細(xì)胞，接著對細(xì)胞懸浮液與三分之一容量的三氟二氯乙烷(1，1，2-tri-chloro-trifluoroethane)進(jìn)行兩輪的氯化銫密度梯度離心(cesium chloride density gradient centrifugation)以進(jìn)一步純化AAV-aFGF粒子。接著進(jìn)行病毒制備的第一型脫氧核糖核酸水解酶(DNaseI)處理，以消化未用病毒核子包覆的脫氧核糖核酸，并且將含有純化AAV-aFGF粒子的上清液保存在-80℃，通過Progen生技有限公司(德國，海德堡)所取得的三明治酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)試劑盒預(yù)測純化AAV-aFGF粒子的滴定濃度，并同樣根據(jù)制備AAV-aFGF粒子的步驟制備AAV-lacZ粒子。
實例2在培養(yǎng)PC12神經(jīng)細(xì)胞之重組AAV-aFGF的活體外功能性檢測在含有85％(v/v)RPMI-1640(GibcoInvitrogen公司，美國，加州，卡爾斯巴德)、10％(v/v)熱鈍化馬血清、5％(v/v)胎牛血清(Biochrom有限公司，德國柏林)、2mM麩酰胺、以及25mM HEPES緩沖液在pH7.3具有100U/ml盤尼西林與100μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞(美國菌種中心編號CRL-1721TM)，在具有5％二氧化碳的保濕保溫箱內(nèi)維護(hù)PC12細(xì)胞。在分析PC12細(xì)胞時，以補(bǔ)充2％馬血清與1％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細(xì)胞。此外，對細(xì)胞培養(yǎng)添加100ng/ml神經(jīng)生長因子(CytoLab公司，以色列，雷霍沃特)以提供分析PC12細(xì)胞之分化及/或增生的正對照組。其它所有材料都是購自于Sigma化學(xué)公司(美國，密蘇里州，圣路易市)。
在神經(jīng)細(xì)胞的分化分析，以每孔5×105細(xì)胞的密度再次于6孔培養(yǎng)盤培養(yǎng)細(xì)胞。為要測量AAV-aFGF所誘發(fā)的神經(jīng)突外長，以含有對照載體或不同量之AAV-aFGF(每細(xì)胞具有200、2000或20000病毒粒子)的無血清RPMI替換培養(yǎng)基。將細(xì)胞暴露于AAV-aFGF 8小時后，移除含病毒之無血清培養(yǎng)基，再以補(bǔ)充2％馬血清與1％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24或48小時。以含4％三聚甲醛的磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphatebuffer saline，PBS)溶液固定細(xì)胞后，在顯微鏡(EclipseT100TM，Nikon公司，日本，東京)下觀察并拍攝神經(jīng)突外生長的程度。神經(jīng)突之全長測量取自于每個條件至少100個細(xì)胞、三個重復(fù)培養(yǎng)孔及三個獨(dú)立實驗，并使用美國國家衛(wèi)生研究院(National Health Institute，NIH)圖像軟件ImageJ所量化，該圖像軟件可由NIH網(wǎng)站http://rsb.info.nih.gov/ij/所取得。
請參照圖2A，當(dāng)細(xì)胞以AAV-aFGF粒子處理時，可于PC12細(xì)胞發(fā)現(xiàn)神經(jīng)突外生長，顯示AAV-aFGF引起腦神經(jīng)細(xì)胞分化，在滴定濃度增加到200、2000及20000個AAV-aFGF粒子時，會增加神經(jīng)突外生長的全長(以μm為測量單位)，而當(dāng)培養(yǎng)期由24小時延長到48小時，也會在特定滴定濃度增加PC12細(xì)胞的腦神經(jīng)細(xì)胞分化。
為測量AAV-aFGF的增生效果，在37℃補(bǔ)充2％馬血清與1％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基以每孔5×103個細(xì)胞的密度于96孔培養(yǎng)盤培養(yǎng)PC12細(xì)胞。以含有對照載體或不同量之AAV-aFGF(每細(xì)胞具有200、2000或20000病毒粒子)的無血清RPMI替換培養(yǎng)基。將細(xì)胞暴露在AAV-aFGF8小時后，移除含病毒之無血清培養(yǎng)基，再以補(bǔ)充2％馬血清與1％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)24小時后，利用溫的無血清RPMI-1640清洗細(xì)胞并在所檢測的孔內(nèi)添加0.1ml MTT(3-[4，5-dimethyl-thiazol-2-yl]2，5-diphenyltetrazolium bromide)(Promega公司，美國，加州，圣路易歐比斯波)工作溶液(5mg/ml MTT在無血清RPMI-1640)，在37℃培養(yǎng)3小時后，移除工作溶液并對細(xì)胞添加MTT溶解緩沖液(20％SDS與50％DMF溶于二次水)反應(yīng)6小時。使用TecanSunriseTMELISA閱讀機(jī)(Phenix研究產(chǎn)品公司，美國，加州，海沃市)在波長570nm測量吸光值，并在波長650nm減除背景值。并且也利用顯微鏡的tryptan blue排除檢測法及具有碘化丙啶染色的流式細(xì)胞技術(shù)分析aFGF所引起的細(xì)胞增生。通過比較每一組所測量的吸光值與作為100％之對照組所測量的吸光值(在波長570nm具有在波長650nm的背景減除)，計算出每一組之細(xì)胞增生百分比。
如圖2B所示，當(dāng)劑量增加到每個細(xì)胞200、2000及20000個AAV-aFGF粒子時會增加PC12細(xì)胞的增生。例如，在以每個細(xì)胞2000或20000個病毒粒子的劑量處理細(xì)胞會增加120％的細(xì)胞增生，因此AAV-aFGF對PC12細(xì)胞的分裂效果呈劑量依存反應(yīng)(dose-dependentresponse)。
實例3重組AAV-aFGF在活體外表達(dá)的定性與定量分析以無血清RPMI內(nèi)的重組AAV-aFGF感染PC12細(xì)胞8小時，接著在補(bǔ)充2％馬血清與1％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞24小時以進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析，并分別在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24、48及72小時以進(jìn)行蛋白印跡(Western Blot)分析。
進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析時，在AAV感染24小時后以甲醇/丙酮/PBS(容積比為1∶1∶8，溶于10mM MES，pH6.9、0.1mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)及氯化鎂溶于1倍PBS)于4℃固定PC12細(xì)胞25分鐘，接著以1倍PBS(含0.1％吐溫20)清洗兩次，在室溫以溶于PBS的1％胎牛血清阻隔細(xì)胞大約2至3小時。以PBS清洗細(xì)胞后，在室溫以抗aFGF多株抗體(Santa Cruz生技公司，美國，加州，圣塔克魯斯市)培養(yǎng)細(xì)胞兩個小時，隨后以PBS與水清洗細(xì)胞并進(jìn)一步以溶于PBS之50％與70％乙醇及100％乙醇進(jìn)行梯度溶劑清洗，接著在顯微鏡下觀察細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞以每個細(xì)胞2×103或2×104個AAV-aFGF粒子處理時會發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因顯性特征改變，如神經(jīng)突的形成而產(chǎn)生細(xì)胞分化。
在進(jìn)行如SEQ ID NO2所示之a(chǎn)FGF蛋白質(zhì)水平的蛋白印跡(WesternBlot)分析時，于每一時間點(diǎn)(AAV感染后24、48及72小時)收集細(xì)胞，通過離心收集細(xì)胞并將其溶解于溶解緩沖液(1％NP-40含30mM焦磷酸鈉(Na4P2O7)、30mM氟化鈉(NaF)、1mM釩酸鈉(Na3VO4)及1倍的蛋白酶抑制劑綜合錠(Roche Diagnostics有限公司，德國，Nonnenwald))。隨后通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺膠電泳(SDS-PAGE)分離10μg的樣本并使用抗aFGF多株抗體(Santa Cruz生技公司，美國，加州，圣塔克魯斯市)分析如SEQ ID NO2所示的aFGF表達(dá)水平，進(jìn)行SDS-PAGE及免疫點(diǎn)漬的方法是根據(jù)Conway等人(Conway et al.，1999，Biochemical Journal 337171-177)所述的方法。請參照圖3A，由于以每個細(xì)胞20000個AAV-aFGF粒子的劑量感染PC12細(xì)胞超過72小時比以較低劑量并較短時間感染的細(xì)胞具有較高的表達(dá)水平，以絕對光密度所測量的分析如SEQ ID NO2所示之a(chǎn)FGF蛋白質(zhì)水平是以時間與劑量依存方式增加。
進(jìn)行進(jìn)一步分析以判斷如SEQ ID NO2所示之a(chǎn)FGF是否能分泌到胞外環(huán)境(extracellular environment)。以無血清RPMI培養(yǎng)基內(nèi)之AAV-aFGF(1μl)感染PC12細(xì)胞8小時后，在含有2％馬血清與1％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞24小時。在培養(yǎng)24小時后，移除含血清培養(yǎng)基并另以無血清RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞3小時，接著收集以AAV感染之PC12細(xì)胞所產(chǎn)生的無血清條件培養(yǎng)基。此外，在條件培養(yǎng)基內(nèi)注射1ng的重組人類aFGF蛋白以提供正對照組。使用透析膜管(3號3.5kDa的截斷大小，Spectrum Microgon公司，美國，加州，拉古納崗)透析條件培養(yǎng)基，并以冷凍干燥機(jī)(Labconco公司，美國，密蘇里州，堪薩斯市)進(jìn)行冷凍干燥及濃縮，接著對完全冷凍干燥樣本進(jìn)行上述SDS-PAGE分離及蛋白印跡(Western Blot)分析。
請參照圖3B，以1μl AAV-aFGF感染的細(xì)胞在條件培養(yǎng)液顯示很少或沒有增加aFGF的表達(dá)，表示如SEQ ID NO2所示之a(chǎn)FGF沒有從細(xì)胞溶質(zhì)分泌或釋放到胞外區(qū)域。
實例4Sprague-Dawley(SD)大鼠的脊椎神經(jīng)挫傷及使用重組AAV-aFGF轉(zhuǎn)導(dǎo)活體內(nèi)人類aFGF基因進(jìn)入非受傷或受傷成鼠的脊椎神經(jīng)。
由臺灣科會動物中心取得SD大鼠，在此實驗選取重量為240至280克的SD母鼠引發(fā)脊椎神經(jīng)受損(Spinal Cord Injury，SCI)，動物處理與實驗步驟由榮民總醫(yī)院動物研究次委員會所仔細(xì)審核與通過，麻醉SD母鼠并在脊椎神經(jīng)的T9-10層進(jìn)行椎弓切除減壓手術(shù)(laminectomy)，在椎弓切除減壓手術(shù)后使用紐約大學(xué)(New York University，NYU)重量墜落組件，如NYU沖擊式損傷機(jī)，從25至50mm的高度墜落10公克的棒子以引發(fā)脊椎神經(jīng)受損，使挫傷組的脊椎神經(jīng)背面受損。沒有脊椎神經(jīng)受損的SD鼠作為模擬組，與挫傷組及沒有進(jìn)行任何前處理與椎弓切除減壓手術(shù)的正常組形成對照，同時在脊椎神經(jīng)受損的7、14、21及28天后，以移動評比等級(locomotor rating scale)對受損程度進(jìn)行定量測量。
此外，在椎弓切除減壓手術(shù)后于模擬+AAV-aFGF組之SD鼠脊椎神經(jīng)的T8與T10段注射AAV-aFGF，挫傷+AAV-aFGF組之SD鼠在脊椎神經(jīng)受損5分鐘后于神經(jīng)受損中心點(diǎn)前后大約1至2mm處注射AAV-aFGF。為要給予AAV-aFGF，先將大鼠放在立體定位籠(stereotaxic frame)，再通過裝有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格33之斜口針頭的5μl注射器(Hamilton syringe)以每分鐘0.5μl的注射速率，以兩分鐘注射1μl重組AAV-aFGF至脊椎神經(jīng)的目標(biāo)位點(diǎn)。注射后一分鐘向后退回針頭0.5mm，并多維持一分鐘后，再由脊椎神經(jīng)抽離。
為要在脊椎神經(jīng)找出人類aFGF轉(zhuǎn)植基因的表達(dá)，解剖大鼠的脊椎神經(jīng)后固定及冷凍保存，并在七天后使用冷凍切片機(jī)制作連續(xù)橫向切片以進(jìn)行免疫組織分析。在手術(shù)后七天以正常生理食鹽水及溶于PBS的4％仲甲醛(paraformaldehyde)灌注模擬組的大鼠，接著移除脊椎神經(jīng)并以溶于PBS的4％仲甲醛固定兩小時。在0.8M蔗糖溶液內(nèi)儲存脊椎神經(jīng)兩周后，于-20℃使用冷凍切片機(jī)水平切割脊椎神經(jīng)成厚度10m的切片。在AAV感染14天后，以抗aFGF單株或多株抗體(Santa Cruz生技公司，美國，加州，圣塔克魯斯市，R&D Systems公司，美國，明尼蘇達(dá)州，明尼亞波里斯)來對脊椎神經(jīng)切片的aFGF免疫反應(yīng)進(jìn)行染色并拍攝。請參照圖4，在脊椎神經(jīng)的腹角區(qū)(ventral horn area)發(fā)現(xiàn)了具有aFGF的神經(jīng)細(xì)胞。
為要分析在AAV-aFGF刺激后aFGF的表達(dá)水平，即刻移除脊椎神經(jīng)組織、解剖成切片或區(qū)域并在手術(shù)后冷凍3及7天。對使用高純度RNA萃取分離試劑盒(Roche Diagnostics有限公司，德國，Nonnenwald)，從有或沒有AAV感染之脊椎神經(jīng)T9段所分離的total RNA(5μg)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR分析，使用SuperScript單一步驟RT-PCR系統(tǒng)(Invitrogen公司)進(jìn)行反應(yīng)(RT步驟55℃進(jìn)行30分鐘；30個循環(huán)的PCR步驟95℃進(jìn)行30秒、60℃進(jìn)行55秒及72℃進(jìn)行30秒)以判斷人類aFGF的mRNA水平。人類aFGF的引物(正向引物為如SEQ ID NO7所示的5’-CGAATTCACTAGTGATTATGG-3’及反向引物為如SEQ ID NO8所示的5’-CTGCAGGAATTCGATTTTAATC-3’)。
大鼠肌動蛋白的引物(正向引物為如SEQ ID NO9所示的5’-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3’及反向引物為如SEQ ID NO10所示的5’-AGCGATGCCTGG-GTACATGG-3’)。
在PCR反應(yīng)后，由0.5％瓊酯凝膠分離cDNA產(chǎn)物并以50μM溴化乙錠溶液進(jìn)行染色，染色的膠體配合Foto/UV-26系統(tǒng)(Fotodyne公司，美國，威斯康星州，哈特蘭)并使用Polaroid膠體照相機(jī)TM，以黑白實時包膠卷(Polaroid公司，英國，赫特福德郡)拍攝，使用NIH發(fā)行的軟件ImageJ進(jìn)行RT-PCR產(chǎn)物水平的定量。
請參照圖5A，在脊椎神經(jīng)組織所表現(xiàn)的mRNA水平以計量依存方式所增加。然而，當(dāng)重組AAV-aFGF的計量增加到1μl時，發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)水平顯著的增加。
在AAV-感染后的每一時間點(diǎn)(24、48及72小時)收集細(xì)胞，以蛋白印跡(Western Blot)分析法分析胞內(nèi)aFGF的蛋白質(zhì)水平。由脊椎神經(jīng)收集的細(xì)胞質(zhì)蛋白不需進(jìn)行進(jìn)一步蛋白質(zhì)純化步驟。將細(xì)胞離心并溶于溶解緩沖液(1％NP-40含30mM焦磷酸鈉(Na4P2O7)、30mM氟化鈉(NaF)、1mM釩酸鈉(Na3VO4)及1倍的蛋白酶抑制劑綜合錠(Roche Diagnostics有限公司，Nonnenwald，德國))，使用Bio-RadDC試劑盒(Bio-Rad Laboratories公司，美國，加州，Hercules)檢測組織樣本的蛋白質(zhì)濃度。由脊椎神經(jīng)組織T9段所取得的30μg蛋白質(zhì)以SDS-PAGE分離，并分別以抗aFGF抗體及抗肌動蛋白抗體在蛋白印跡(Western Blot)分析法分析aFGF及肌動蛋白的表達(dá)水平。如圖5B所示，感染AAV-aFGF的脊椎神經(jīng)較沒有感染的脊椎神經(jīng)稍微表達(dá)更高的如SEQ ID NO2所示之a(chǎn)FGF蛋白。此外，使用50μg的組織蛋白樣本，利用aFGF ELISA Quantikine試劑盒(R&DSystems公司，美國，明尼蘇達(dá)州，明尼亞波里斯)分析準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)水平，在每一組50μg的蛋白樣本內(nèi)計算如SEQ ID NO2所示之a(chǎn)FGF的水平(pg/ml)，并如以下表1所示。
表1


單位pg/ml如表1所列，不論處理期間為3天或14天，接受AAV感染的模擬組通常較沒有AAV感染的仿真組顯示更高的aFGF表達(dá)，接受AAV感染的挫傷組則比沒有AAV感染的挫傷組顯示更顯著的aFGF表達(dá)增加。
此外，對這些活體內(nèi)組織樣本進(jìn)行進(jìn)一步的蛋白質(zhì)純化。將每一樣本直接通過Ultrafree-0.5離心過濾器(Millipore公司，美國，麻州，比勒瑞卡)并收集殘留上清液，以具有連結(jié)緩沖液(10mM磷酸鈉緩沖液，pH 7.0)的肝磷素親合性管柱(Amersham Pharmacia生技公司，美國，紐澤西州，Piscataway)分離上清液并以梯度連結(jié)緩沖液(包括梯度濃度為0.15M、0.5M、0.8至1.5M的氯化鈉溶于pH7.0，10mM磷酸鈉緩沖液)洗脫，洗脫的蛋白質(zhì)溶液再通過SephadexG25旋轉(zhuǎn)管柱(Amersham Pharmacia生技公司，美國，紐澤西州，Piscataway)去鹽，并以冷凍干燥機(jī)(Labconco公司，美國，密蘇里州，堪薩斯市)進(jìn)行冷凍干燥并濃縮。以SDS-PAGE分離總冷凍干燥樣本，并分別以抗aFGF抗體及抗肌動蛋白抗體在蛋白印跡(Western Blot)分析法分析如SEQ ID NO2所示之a(chǎn)FGF的表達(dá)水平。
請參照圖5C，感染AAV-aFGF的脊椎神經(jīng)比沒有以任何AAV-aFGF感染的脊椎神經(jīng)顯示較高的如SEQ ID NO2所示之a(chǎn)FGF蛋白表達(dá)，以1μl的AAV-aFGF感染脊椎神經(jīng)將顯著增加蛋白質(zhì)表達(dá)。
實例6行為評估所有動物在手術(shù)后1至6周的期間每周接受兩個行為測試，拍攝所有行為測試，且參與行為評估的兩位檢測人員并不清楚那些為經(jīng)處理之動物。以Basso，Beattie，Bresnahan(BBB)開放田間移動測試(Basso等人(1995)Journal of Neurotrauma 121-21)及綜合行為分?jǐn)?shù)(CBS)評估大鼠的后肢移動行為。
首先，在開放田間(至少150cm×100cm)進(jìn)行大鼠的BBB分析，脊椎神經(jīng)挫傷的大鼠分別有8只為對照載體處理組(SCI)、12只為AAV-aFGF處理組(SCI+AAV-aFGF)及3只為AAV-lacZ處理組(SCI+AAV-lacZ)，每一段時間持續(xù)5分鐘。通過觀察并對涉及臀部動作、膝蓋動作、關(guān)節(jié)動作以及軀干與尾巴或后肢之間位置的行為計分以決定開放田間移動分?jǐn)?shù)，另外也決定踏步、腳趾分開、腳掌放置、重量支撐及協(xié)調(diào)性的詳細(xì)預(yù)測，分?jǐn)?shù)范圍包括由0到21(0為沒動作，21為正常動作)。請參照圖6A，SCI-AAV-aFGF組顯示顯著的分?jǐn)?shù)增加，表示接受脊椎神經(jīng)內(nèi)注射AAV-aFGF之挫傷大鼠比沒有注射AAV-aFGF或注射AAV-lacZ之挫傷大鼠的復(fù)原狀況更好。相較于SCI組或SCI+AAV-lacZ組，SCI-AAV-aFGF組在第四周至第六周的分?jǐn)?shù)增加最為顯著。
接著，CBS分析為綜合了Tarlov計分系統(tǒng)測試、評估單一及復(fù)雜反射動作，還有自發(fā)與引發(fā)運(yùn)動型態(tài)之傾斜面測試的綜合測試，此多重測量包含運(yùn)動功能、甲趾分開、歸正動作、退縮反應(yīng)、放置、傾斜面及游泳測試，將記錄的行為水平分級并計分。失去多數(shù)活動力的大鼠為100分，最明顯具有活動力改善的大鼠為少于100分并接近0分。如圖6B所示，以AAV-aFGF處理之挫傷大鼠的CBS分?jǐn)?shù)隨著時間降低，處以AAV-aFGF的挫傷大鼠比那些接受AAV-lacZ或?qū)φ蛰d體之SCI大鼠的CBS分?jǐn)?shù)較低，因此接受AAV-aFGF處理之挫傷大鼠的活動力具有最顯著的改善。
由以上之描述得知，所屬技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可輕易了解本發(fā)明中之必要特征，且在不悖離其精神及范圍下，可做各種改變及修改以使本發(fā)明適用于各種用途及情況。
序列表<110>鄭宏志<120>治療神經(jīng)損傷及再生神經(jīng)細(xì)胞的載體構(gòu)建體<130>6P04065-TW<160>10<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2357<212>脫氧核糖核酸<213>人類<400>1gagccgggct actctgagaa gaagacacca agtggattct gcttcccctg ggacagcact 60gagcgagtgt ggagagaggt acagccctcg gcctacaagc tctttagtct tgaaagcgcc 120acaagcagca gctgctgagc catggctgaa ggggaaatca ccaccttcac agccctgacc 180gagaagttta atctgcctcc agggaattac aagaagccca aactcctcta ctgtagcaac 240gggggccact tcctgaggat ccttccggat ggcacagtgg atgggacaag ggacaggagc 300gaccagcaca ttcagctgca gctcagtgcg gaaagcgtgg gggaggtgta tataaagagt 360accgagactg gccagtactt ggccatggac accgacgggc ttttatacgg ctcacagaca 420ccaaatgagg aatgtttgtt cctggaaagg ctggaggaga accattacaa cacctatata 480tccaagaagc atgcagagaa gaattggttt gttggcctca agaagaatgg gagctgcaaa 540cgcggtcctc ggactcacta tggccagaaa gcaatcttgt ttctccccct gccagtctct 600tctgattaaa gagatctgtt ctgggtgttg accactccag agaagtttcg aggggtcctc 660acctggttga cccaaaaatg ttcccttgac cattggctgc gctaaccccc agcccacaga 720gcctgaattt gtaagcaact tgcttctaaa tgcccagttc acttctttgc agagcctttt 780acccctgcac agtttagaac agagggacca aattgcttct aggagtcaac tggctggcca 840gtctgggtct gggtttggat ctccaattgc ctcttgcagg ctgagtccct ccatgcaaaa 900gtggggctaa atgaagtgtg ttaaggggtc ggctaagtgg gacattagta actgcacact 960atttccctct actgagtaaa ccctatctgt gattccccca aacatctggc atggctccct 1020tttgtccttc ctgtgccctg caaatattag caaagaagct tcatgccagg ttaggaaggc 1080agcattccat gaccagaaac agggacaaag aaatcccccc ttcagaacag aggcatttaa 1140aatggaaaag agagattgga ttttggtggg taacttagaa ggatggcatc tccatgtaga 1200ataaatgaag aaagggaggc ccagccgcag gaaggcagaa taaatccttg ggagtcatta 1260ccacgccttg accttcccaa ggttactcag cagcagagag ccctgggtga cttcaggtgg 1320agagcactag aagtggtttc ctgataacaa gcaaggatat cagagctggg aaattcatgt 1380ggatctgggg actgagtgtg ggagtgcaga gaaagaaagg gaaactggct gaggggatac 1440cataaaaaga ggatgatttc agaaggagaa ggaaaaagaa agtaatgcca cacattgtgc 1500ttggcccctg gtaagcagag gctttggggt cctagcccag tgcttctcca acactgaagt 1560gcttgcagat catctgggga cctggtttga atggagattc tgattcagtg ggttgggggc 1620agagtttctg cagttccatc aggtcccccc caggtgcagg tgctgacaat actgctgcct 1680tacccgccat acattaagga gcagggtcct ggtcctaaag agttattcaa atgaaggtgg 1740ttcgacgccc cgaacctcac ctgacctcaa ctaaccctta aaaatgcaca cctcatgagt 1800ctacctgagc attcaggcag cactgacaat agttatgcct gtactaagga gcatgatttt 1860aagaggcttt ggccaatgcc tataaaatgc ccatttcgaa gatatacaaa aacatacttc 1920aaaaatgtta aacccttacc aacagctttt cccaggagac catttgtatt accattactt 1980gtataaatac acttcctgct taaacttgac ccaggtggct agcaaattag aaacaccatt 2040catctctaac atatgatact gatgccatgt aaaggccttt aataagtcat tgaaatttac 2100tgtgagactg tatgttttaa ttgcatttaa aaatatatag cttgaaagca gttaaactga 2160ttagtattca ggcactgaga atgatagtaa taggatacaa tgtataagct actcacttat 2220ctgatactta tttacctata aaatgagatt tttgttttcc actgtgctat tacaaatttt 2280cttttgaaag taggaactct taagcaatgg taattgtgaa taaaaattga tgagagtgtt 2340aaaaaaaaaa aaaaaaa 2357<210>2<211>155<212>蛋白質(zhì)<213>人類
<400>2Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe1 5 10 15Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser20 25 30Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly35 40 45Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu50 55 60Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu65 70 75 80Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu85 90 95Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr100 105 110Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys115 120 125Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala130 135 140Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp145 150 155<210>3<211>18<212>脫氧核糖核酸<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>3atggctgaag gggaaatc 18<210>4<211>24<212>脫氧核糖核酸<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>4ttaatcagaa gagactggca gggg 24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>5atgtcgttta ctttgaccaa caag 24<210>6<211>25<212>脫氧核糖核酸<213>人工序列<220>
<223>合成序列
<400>6ctttttttga caccagacca actgg 25<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物序列<400>7cgaattcact agtgattatgg 21<210>8<211>22<212>脫氧核糖核酸<213>人工序列<220>
<223>引物序列<400>8ctgcaggaat tcgattttaatc 22<210>9<211>20<212>脫氧核糖核酸<213>人工序列<220>
<223>引物序列<400>9aagatcctga ccgagcgtgg 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物序列<400>10agcgatgcct gggtacatgg 20
權(quán)利要求
1.一種治療神經(jīng)損傷的載體構(gòu)建體，其包括病毒載體承載酸性成纖維細(xì)胞生長因子的編碼基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的載體構(gòu)建體，其中該基因具有如SEQ IDNO1所示之脫氧核糖核酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的載體構(gòu)建體，其中該基因是aFGF的編碼基因具有如SEQ ID NO2所示之氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的載體構(gòu)建體，其中該病毒載體至少包括腺相關(guān)病毒基因與腺病毒基因的其中之一。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的載體構(gòu)建體，其中以該病毒載體感染神經(jīng)損傷部位，使該基因傳遞到該神經(jīng)損傷部位并在該神經(jīng)損傷部位表達(dá)該基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的載體構(gòu)建體，其中該神經(jīng)損傷部位至少包括神經(jīng)器官、神經(jīng)組織、可以載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞系統(tǒng)及神經(jīng)細(xì)胞或其突起所在位置的其中之一。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的載體構(gòu)建體，其中還包括病毒基因體，使病毒載體裝入病毒粒子。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的載體構(gòu)建體，其中還包括報導(dǎo)基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8所述的載體構(gòu)建體，其中該報導(dǎo)基因是細(xì)菌半乳糖酶的互補(bǔ)脫氧核糖核酸。
10.一種再生神經(jīng)細(xì)胞的載體構(gòu)建體包括病毒載體承載aFGF的編碼基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求
10所述的載體構(gòu)建體，其中該基因具有如SEQ IDNO1所示之脫氧核糖核酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求
10所述的載體構(gòu)建體，其中該基因具有如SEQ IDNO2所示之氨基酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求
10所述的載體構(gòu)建體，其中該病毒載體至少包括腺相關(guān)病毒基因與腺病毒基因的其中之一。
14.根據(jù)權(quán)利要求
13所述的載體構(gòu)建體，其中以該病毒載體感染該神經(jīng)細(xì)胞，使該基因傳遞到該神經(jīng)細(xì)胞并在該神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該基因。
15.根據(jù)權(quán)利要求
14所述的載體構(gòu)建體，其中該神經(jīng)細(xì)胞至少包括星狀細(xì)胞、寡凸細(xì)胞、神經(jīng)膠細(xì)胞、脈絡(luò)叢細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、腦脊椎神經(jīng)膜細(xì)胞、許旺氏細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞、微膠細(xì)胞、脊椎神經(jīng)組織內(nèi)細(xì)胞及以該基因轉(zhuǎn)型的神經(jīng)源細(xì)胞株的其中之一。
16.根據(jù)權(quán)利要求
10所述的載體構(gòu)建體，其中還包括病毒基因體，使病毒載體裝入病毒粒子。
17.根據(jù)權(quán)利要求
10所述的載體構(gòu)建體，其中還包括報導(dǎo)基因。
18.根據(jù)權(quán)利要求
17所述的載體構(gòu)建體，其中該報導(dǎo)基因是細(xì)菌半乳糖酶之互補(bǔ)脫氧核糖核酸。
專利摘要
本發(fā)明提供一種治療神經(jīng)損傷及再生神經(jīng)細(xì)胞的載體構(gòu)建體，包括病毒載體承載酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)之編碼基因。
文檔編號C12N15/63GKCN1977976SQ200610103261
公開日2007年6月13日 申請日期2006年7月20日
發(fā)明者鄭宏志, 張佩德 申請人:鄭宏志導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan