專(zhuān)利名稱(chēng):應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)物流感疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸用疫苗的生產(chǎn)，具體涉及一種應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)物流感 滅活疫苗的方法。
背景技術(shù)：
流感病毒屬于RNA病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3個(gè)型。其中甲型流感病毒多 發(fā)于禽類(lèi)，一些亞型也可感染豬、馬、海豹和鯨等各種哺乳動(dòng)物及人類(lèi)；乙型和丙型流感病 毒則分別見(jiàn)于海豹和豬的感染。禽流感(Al)是由A型流感病毒引起的家禽和野生禽類(lèi)感 染的高度接觸性傳染病。野禽是禽流感病毒天然宿主，已證實(shí)禽流感病毒可以由家禽直接 感染人，引起人類(lèi)的發(fā)病和死亡。豬流感(Si)是由豬流感病毒引起的不同日齡、性別和品 種豬只的一種急性、熱性和高度接觸性的呼吸道傳染病。豬是禽、人、豬流感病毒重組和復(fù) 制的“混合器”，豬流感病毒不需重組就有最大限度感染人的能力。因此禽流感和豬流感不 但是能夠造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失的動(dòng)物疫病，而且具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。
當(dāng)前動(dòng)物流感滅活疫苗生產(chǎn)主要是雞胚培養(yǎng)繁殖抗原的傳統(tǒng)培養(yǎng)方式。雖然其要 求較低、技術(shù)成熟穩(wěn)定，但原料受季節(jié)性制約，如禽流感爆發(fā)會(huì)對(duì)雞胚供應(yīng)造成威脅，后期 廢物處理污染環(huán)境，抗原含卵清蛋白、純度低，免疫后副反應(yīng)大。
以細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)動(dòng)物流感滅活疫苗的生產(chǎn)產(chǎn)量和質(zhì)量取決于病毒株系、宿主細(xì)胞 培養(yǎng)活性及密度、病毒培養(yǎng)條件、以及最終的濃縮、純化和佐劑配制工藝。中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào) 為CN101491672的專(zhuān)利申請(qǐng)，公開(kāi)了一種雞新城疫-禽流感二聯(lián)油乳劑滅活疫苗及其制備 方法；中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)為CN101607084的專(zhuān)利申請(qǐng)，公開(kāi)了一種雞新城疫、H9亞型禽流感 二聯(lián)滅活疫苗的制備方法；中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)為CN101607083的專(zhuān)利申請(qǐng)，公開(kāi)了一種禽流 感四聯(lián)滅活疫苗的制備方法；中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)為CN1010627113A的專(zhuān)利申請(qǐng)，公開(kāi)了一種 支持病毒生長(zhǎng)到高效價(jià)的MDCK細(xì)胞系和采用該細(xì)胞系的生物反應(yīng)器方法。中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi) 號(hào)為CN101511385A的專(zhuān)利申請(qǐng)，公開(kāi)了一種不使用雞蛋制備流感病毒疫苗。中國(guó)專(zhuān)利公 開(kāi)號(hào)為CN101094915A的專(zhuān)利申請(qǐng)，公開(kāi)了一種生產(chǎn)流感疫苗的方法。中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)為 CN101062411A的專(zhuān)利申請(qǐng)，公開(kāi)了一種應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗的方法。中國(guó) 專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)為CN101189326A的專(zhuān)利申請(qǐng)，公開(kāi)了一種用于病毒增殖的非致瘤性MDCK細(xì)胞 系。
以上文獻(xiàn)資料都有不同程度的涉及禽流感疫苗的生產(chǎn)工藝方法或應(yīng)用生物反應(yīng) 器進(jìn)行流感病毒的培養(yǎng)。但是，將特定的生物反應(yīng)器技術(shù)應(yīng)用到宿主細(xì)胞通過(guò)逐級(jí)放大進(jìn) 行高密度培養(yǎng)上，并通過(guò)接種特定的流感病毒細(xì)胞適應(yīng)株進(jìn)行病毒培養(yǎng)和收獲，用于制備 疫苗，均未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為克服上述雞胚培養(yǎng)的技術(shù)缺陷，提供一種應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化 生產(chǎn)動(dòng)物流感滅活疫苗的方法。與其它生產(chǎn)工藝相比，本生產(chǎn)工藝通過(guò)應(yīng)用14L 150L生物反應(yīng)器和2 25g/L高密度微載體技術(shù)，大規(guī)模連續(xù)灌注培養(yǎng)高密度宿主細(xì)胞，收獲病毒 HA效價(jià)達(dá)到21°以上，經(jīng)超濾濃縮、純化、配苗，制備優(yōu)質(zhì)動(dòng)物流感滅活疫苗和/或多價(jià)苗和
/或多聯(lián)苗。
本發(fā)明的技術(shù)方案為應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)物流感疫苗的方法，其特征 在于包括如下步驟(1)將攪拌式生物反應(yīng)器和Cytodex系列微載體經(jīng)滅菌后，加入細(xì)胞生 長(zhǎng)液，接種Vero或MDCK細(xì)胞培養(yǎng)；待微載體上的Vero或MDCK細(xì)胞形成致密的單層，接種 禽流感病毒，并繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增病毒；( 待細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時(shí)，收獲病毒液；C3)將上 述收獲的病毒液用100KD或300KD截留分子量的超濾膜包濃縮10 50倍，按滅活劑與病毒 濾液的體積比為1 4000的加入β-丙內(nèi)酯或按滅活劑與病毒濾液的體積比為1 1000 的質(zhì)量濃度為37%甲醛溶液進(jìn)行滅活后，再按佐劑與滅活的病毒液的體積比為1 2加入 納米鋁佐劑，配制成流感滅活疫苗。
所述Vero或MDCK細(xì)胞接毒后在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時(shí)，在培養(yǎng)基中添加終濃 度1 8yg/ml的胰酶。
所述微載體的使用濃度為2g/L 25g/L。
流感病毒接種量為0. 1 0. 000IMOI。
所述流感病毒為禽流感病毒或豬流感病毒。
所述的攪拌式生物反應(yīng)器容積為14L 150L，制苗用細(xì)胞經(jīng)過(guò)14L 40L 150L 逐級(jí)放大培養(yǎng)后，即通過(guò)胰酶將14L生物反應(yīng)器培養(yǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)，作為種子細(xì)胞接種 到40L生物反應(yīng)器，再將40L反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)作為種子細(xì)胞接種到150L生物 反應(yīng)器，如此形成生物反應(yīng)器之間的逐級(jí)放大培養(yǎng)過(guò)程，從而避免了單純的用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)種 子細(xì)胞而容易造成污染和增加勞動(dòng)強(qiáng)度的缺陷；或直接用14L、40L或150L的攪拌式生物反 應(yīng)器培養(yǎng)病毒。
攪拌式生物反應(yīng)器的培養(yǎng)采用批式、流加或灌注培養(yǎng)的方式，灌注的速率根據(jù)細(xì) 胞的密度為0. 5 4個(gè)工作體積/天；
所述的攪拌式生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)為pH 6. 5 7. 6、溫度33 37°C、溶氧30 80%、攪拌速度40 lOOrpm?？紤]到細(xì)胞培養(yǎng)的最適條件，優(yōu)選的pH 6. 8 7. 2、細(xì)胞培 養(yǎng)階段溫度設(shè)定37°C，病毒培養(yǎng)階段溫度設(shè)定35°C、溶氧50%、攪拌速度30 lOOrpm。
制苗用細(xì)胞為MDCK細(xì)胞，原則上只要是適合于培養(yǎng)禽流感病毒的細(xì)胞均可以采 用以上方案實(shí)施，優(yōu)選的采用犬腎細(xì)胞系(MDCK)、非洲綠猴腎細(xì)胞系(Vero)。
本發(fā)明具有工藝參數(shù)可控性好，細(xì)胞密度高，病毒效價(jià)高，生產(chǎn)效率高，勞動(dòng)強(qiáng)度 低等優(yōu)點(diǎn)。利用本發(fā)明生產(chǎn)的動(dòng)物流感疫苗安全性好，質(zhì)量穩(wěn)定可靠，副反應(yīng)減小，免疫效 力高，對(duì)流感野毒攻擊具有較好的免疫保護(hù)作用。


圖1為本發(fā)明的實(shí)施例1的工藝流程圖。
圖加為細(xì)胞接種后4h的微載體細(xì)胞圖片。
圖2b為細(xì)胞接種后3d的微載體細(xì)胞圖片。
圖2c為細(xì)胞接毒后40h病變的微載體細(xì)胞圖片
圖3為本發(fā)明的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這 些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn) 方法，按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
實(shí)施例1
生物反應(yīng)器美國(guó)NBS公司14L 40L生物反應(yīng)器；
微載體=Cytodex-I (美國(guó)通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部)；
病毒H9N2亞型禽流感病毒ZBl株；
細(xì)胞生長(zhǎng)液含體積濃度8%血清的DMEM培養(yǎng)基(北京清大天一生物技術(shù)有限公 司)；
細(xì)胞維持液含1 μ g/ml胰酶的DMEM培養(yǎng)基(北京清大天一生物技術(shù)有限公 司)；
細(xì)胞培養(yǎng)分別在14L生物反應(yīng)器內(nèi)，按照10g/L的濃度加入Cytodex-Ι，水化后， 用pH7. 2的磷酸鹽緩沖液PBS淘洗幾遍，滅菌后加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種MDCK細(xì)胞，進(jìn)行培 養(yǎng)。培養(yǎng)的方法參數(shù)為pH7. 2、溫度37°C、溶氧50%、攪拌速度30 IOOrpm ；每天定時(shí)取 樣觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定葡萄糖的消耗，當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到1. 5 X 106/ml 時(shí)開(kāi)始灌注，灌注的速度依據(jù)細(xì)胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0. 5 4個(gè)工作體積，以維 持細(xì)胞的生長(zhǎng)，培養(yǎng)4天，細(xì)胞的密度達(dá)到6X 106/ml。
微載體培養(yǎng)的放大待14L生物反應(yīng)器細(xì)胞密度達(dá)到6X106/ml，將長(zhǎng)滿細(xì)胞的 微載體收集到特定密閉容器中，用含質(zhì)量濃度0. 02% EDTA, pH7. 2的PBS緩沖液清洗細(xì)胞 兩次，加入37°C預(yù)熱的含質(zhì)量濃度0. 02% EDTA、質(zhì)量濃度0. 25%胰酶的胰酶消化液，消化 15min，排出多余的胰酶溶液，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，終止殘余胰酶的消化，啟動(dòng)容器攪拌使其充 分分散消化的細(xì)胞，然后將消化分散的細(xì)胞懸液接種到40L的生物反應(yīng)器，按照上述的培 養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。
病毒繁殖當(dāng)40L生物反應(yīng)器細(xì)胞的密度達(dá)到8X106/ml，更換為細(xì)胞維持液，按 照0. 001M0I接種H9N2亞型禽流感病毒；接毒后他開(kāi)始灌注培養(yǎng)，以維持病毒繁殖必需的 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，待細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時(shí)，同時(shí)收獲病毒液，測(cè)定病毒含量HA效價(jià)21(1，將收獲 的病毒液根據(jù)需要置于2°C 8°C中，或保存在-20°C。
制備疫苗將上述收獲的病毒液用100KD截留分子量的超濾膜包濃縮10倍，按滅 活劑與病毒濾液的體積比為1 4000的加入β-丙內(nèi)酯進(jìn)行滅活后，按佐劑與滅活的病毒 液的體積比為1 2加入的納米鋁佐劑，配制成禽流感滅活疫苗。
實(shí)施例2
生物反應(yīng)器美國(guó)NBS公司14L 40L生物反應(yīng)器
微載體=Cytodex-I (GE生命科學(xué)請(qǐng)寫(xiě)出全稱(chēng))
病毒豬流感病毒Hmi亞型
細(xì)胞生長(zhǎng)液含質(zhì)量濃度8%血清的Μ199培養(yǎng)基
細(xì)胞維持液含1 μ g/ml胰酶的M199培養(yǎng)基
細(xì)胞培養(yǎng)分別在14L生物反應(yīng)器內(nèi)，按照10g/L的濃度加入Cytodex-Ι，水化后，用pH7. 2的磷酸鹽緩沖液PBS淘洗幾遍，滅菌后加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種Vero細(xì)胞，進(jìn)行培 養(yǎng)。培養(yǎng)的方法參數(shù)為pH7. 2、溫度37°C、溶氧50%、攪拌速度30 IOOrpm ；每天定時(shí)取 樣觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定葡萄糖的消耗，當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到1. 5 X 106/ml 時(shí)開(kāi)始灌注，灌注的速度依據(jù)細(xì)胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0. 5 4個(gè)工作體積，以維 持細(xì)胞的生長(zhǎng)，培養(yǎng)4天，細(xì)胞的密度達(dá)到6X 106/ml。
微載體培養(yǎng)的放大待14L生物反應(yīng)器細(xì)胞密度達(dá)到6X106/ml，將長(zhǎng)滿細(xì)胞的 微載體收集到特定密閉容器中，用含質(zhì)量濃度0. 02% EDTA pH7. 2的PBS緩沖液清洗細(xì)胞 兩次，加入37°C預(yù)熱的含質(zhì)量濃度0. 02% EDTA、質(zhì)量濃度0. 25%胰酶的胰酶消化液，消化 IOmin,排出多余的胰酶溶液，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，終止殘余胰酶的消化，啟動(dòng)容器攪拌使其充 分分散消化的細(xì)胞，然后將消化分散的細(xì)胞懸液接種到40L的生物反應(yīng)器，按照上述的培 養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。
病毒繁殖當(dāng)40L生物反應(yīng)器細(xì)胞的密度達(dá)到7X106/ml，更換為細(xì)胞維持液，按 照0. 001M0I接種Hmi豬流感病毒；接毒后M1開(kāi)始灌注培養(yǎng)，以維持病毒繁殖必需的營(yíng)養(yǎng) 物質(zhì)，待細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時(shí)，同時(shí)收獲病毒液，收獲病毒液，測(cè)定病毒含量HA效價(jià) 21(1，將收獲的病毒液根據(jù)需要置于2°C 8°C中，或保存在-20°C。
制備疫苗將上述收獲的病毒液用100KD截留分子量的超濾膜包濃縮10倍，按滅 活劑與病毒濾液的體積比為1 1000的加入質(zhì)量濃度為37%甲醛溶液進(jìn)行滅活后，按佐劑 與滅活的病毒液的體積比為1 2加入的納米鋁佐劑，配制成豬流感滅活疫苗。
權(quán)利要求
1.應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)物流感疫苗的方法，其特征在于包括如下步驟(1) 將攪拌式生物反應(yīng)器和Cytodex系列微載體經(jīng)滅菌后，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種Vero或MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)；待微載體上的Vero或MDCK細(xì)胞形成致密的單層，接種流感病毒，并繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò) 增病毒；( 待細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時(shí)，收獲病毒液；C3)將上述收獲的病毒液用100KD 或300KD截留分子量的超濾膜包濃縮10 50倍，按滅活劑與病毒濾液的體積比為1 4000 的加入β-丙內(nèi)酯或按滅活劑與病毒濾液的體積比為1 1000的質(zhì)量濃度為37%甲醛溶 液進(jìn)行滅活后，再按佐劑與滅活的病毒液的體積比1 2加入納米鋁佐劑，配制成流感滅活 疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)物流感疫苗的方法，其特征在 于所述的細(xì)胞接毒后在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時(shí)，在培養(yǎng)基添加濃度1 8μ g/ml的胰 酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)物流感疫苗的方法，其特征在 于所述微載體的使用濃度為2g/L 25g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)物流感疫苗的方法，其特征在 于流感病毒接種量為0. 1 0. 0001M0L·
5.根據(jù)權(quán)利要求
1 4之一所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)物流感疫苗的方法， 其特征在于所述流感病毒為禽流感病毒或豬流感病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1 4之一所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)物流感疫苗的方法， 其特征在于所述的攪拌式生物反應(yīng)器容積為14L 150L，制苗用細(xì)胞經(jīng)過(guò)14L 40L 150L逐級(jí)放大培養(yǎng)后，于150L生物反應(yīng)器培養(yǎng)流感病毒；或直接用14L、40L或150L的攪 拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1-4之一所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)物流感疫苗的方法，其 特征在于攪拌式生物反應(yīng)器的培養(yǎng)采用批式、流加或灌注培養(yǎng)的方式，灌注的速率根據(jù)細(xì) 胞的密度為0. 5 4個(gè)工作體積/天。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1-4之一所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)物流感疫苗的方法，其 特征在于所述的攪拌式生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)為pH6. 5 7. 6、溫度33 37°C、溶氧30 80%、攪拌速度40 lOOrpm。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)物流感疫苗的方法，該方法包括如下步驟(1)Vero或MDCK細(xì)胞接入經(jīng)滅菌的含微載體的生物反應(yīng)器，在含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；(2)將生物反應(yīng)器內(nèi)含血清培養(yǎng)基置換為含胰酶的無(wú)血清培養(yǎng)基；(3)接種動(dòng)物流感病毒繼續(xù)培養(yǎng)；(4)待細(xì)胞病變達(dá)到80％以上時(shí)，收獲得到細(xì)胞培養(yǎng)的流感病毒原液；(5)將流感病毒原液經(jīng)超濾濃縮、滅活、添加佐劑制得流感滅活疫苗。本發(fā)明具有工藝參數(shù)可控，細(xì)胞密度高，病毒效價(jià)高，生產(chǎn)效率高，勞動(dòng)強(qiáng)度低等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明生產(chǎn)的流感疫苗安全性好，質(zhì)量穩(wěn)定可靠，副反應(yīng)減小，免疫效力高，對(duì)流感野毒攻擊具有較好的免疫保護(hù)作用。
文檔編號(hào)C12R1/93GKCN102133398SQ201010282155
公開(kāi)日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年9月15日
發(fā)明者劉漢平, 彭杏, 李偉, 李晶梅, 溫文生, 漆世華, 秦紅剛, 靖志強(qiáng) 申請(qǐng)人:武漢中博生物股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan