專利名稱:一種常溫提取靈芝子實體天然活性物質新工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及天然產物提取領域，特別涉及集成雙超技術-超微粉碎技術和超聲波循環(huán)提取技術，實現對總多糖 和總三萜等兩大天然活性物質的高效提取的一種在室溫條件下進行靈芝子實體常溫提取的新工藝。
背景技術：
靈芝(Ganoderma Iucidum)子實體作為中藥制藥和保健食品的生產原料，已知其中兩大類天然活性物質是多糖和三萜類。在中藥制藥和保健食品生產領域，有關靈芝多糖，主要采用熱水提取法對靈芝子實體中多糖等成分進行提取和濃縮，之后采用水提醇沉工藝獲得多糖含量至少2(Γ30%的粗制品，可供進一步分離和制備靈芝多糖中的某一組分或特定分子量的多糖成分。在天然產物化學研究領域，有關靈芝三萜類化合物，基本上都是采用多種有機溶劑進行復雜的多次萃取和層析分離，最終獲得總三萜類(粗制品)，可以進一步用于靈芝三萜單體的分離和制備，并作為檢測分析和構建指紋圖譜的標準品或對照品。
在中藥制藥和食品生產領域，通常采用多功能提取罐和夾層鍋作為提取設備，在原料的前處理通常將子實體切塊或切片、粉碎成棉絮狀粗顆粒，以水作為提取介質，在加蓋式或敞開式加熱沸騰條件下進行，整個提取過程長達數十小時才能完成；提取完成后，進行料液的分離，收集提取液，進行濃縮和干燥脫水得到干膏狀或噴霧干燥成粉末狀的提取物(后者也稱浸膏粉)。
如陳體強等(1994)報道采用熱水提取、過濾并合并濾液，濃縮后進行噴霧干燥得到靈芝浸膏粉(陳體強，李開本，何修金，等.靈芝浸膏粉微量元素與氨基酸測試分析簡報[J].中國中藥雜志，1994，9 (2) : 97-98)。
朱培根、陳體強等報道采用熱水提取、真空濃縮和噴霧干燥工藝，考察生產原料對靈芝浸膏粉質量的影響(朱培根，陳體強，李開本，等.生產原料對靈芝浸膏粉質量的影響[J] ·福建省農業(yè)學報，1997，12 (3) : 39-43.)。
發(fā)明專利《一種靈芝干浸膏的制備方法》(專利號CN200610053412. 7)涉及采用水煎煮(熱水提取法)，并將水提液進行超濾膜濃縮，最后干燥得到干浸膏，得為I. 37%。
胡斌杰等報道超聲波法提取靈芝多糖，與傳統(tǒng)熱水法相比，提取時間縮短3/4，可以在較低的溫度60°C下多糖提取率提高30%以上(胡斌杰，陳金鋒，王宮南.超聲波法與傳統(tǒng)熱水法提取靈芝多糖的比較研究[J].食品工業(yè)科技，2007，28 (2) :190-192.)。發(fā)明專利《一種靈芝多糖的高效制備方法》(專利號CN200810156039. 7)涉及將子實體粉碎得到的靈芝粉，用28倍進行超聲波提取(680W，17min)，靈芝粗多糖得率為20. 79±0. llmg/g。
發(fā)明專利《以靈芝子實體為原料提取靈芝三萜與靈芝多糖的方法》(專利號CN200910097776. 9)涉及超聲波輔助醇提步驟獲得靈芝三萜后，再以復合酶輔助水提醇沉制備靈芝多糖，分別經噴霧干燥得到靈芝三萜提取物和靈芝多糖提取物。
發(fā)明專利《靈芝活性多糖的低溫提取技術》(專利號CN200910310776. 2)涉及一種靈芝活性多糖的低溫三重提取將靈芝在低溫條件下進行水提取、有機溶劑提取后進行酶解、濃縮、超濾后低溫活化處理后進行冷凍干燥。
發(fā)明專利《靈芝提取新工藝》(專利號CN98120550. X)涉及一種以氨溶液提取后再用水提取，可顯著提高產品的有效成分提出率。
發(fā)明專利《靈芝子實體中的有效部位、提取方法及其用途和制劑》(公開號CN102370671A)對靈芝子實體的脫脂產物進行堿提、透析分離等步驟之后，再選用噴霧干燥、減壓干燥、冷凍干燥或常壓干燥中的一種方法進行干燥以獲得有效FYGL，對蛋白酪氨酸磷酸酶活性有抑制作用，具用顯著降血糖功效。
上述中各種提取技術方法，可以歸納為三類一是成熟實用的傳統(tǒng)熱水提取工藝，但存在能耗較大，需要較大的設備和占地空間或車間；二是利用化學溶劑如氨、堿等進行提取，或加酶處理，其工藝過程產生一些化學或酶解反應，提取物中難免有殘留成分或新生成的復雜成分；三是超聲波輔助提取，以發(fā)散式的超聲波進行靜態(tài)的提取，僅適于較小規(guī)模的實驗性制備或生產，效率較低。
超微粉碎(Superfine pulverization)技術又稱超細粉體工程技術,屬于材料科學與精細化工領域的。物料經超細化后，隨著其比表面的驟增，可引起許多特性的變化，如可以提高有效成分溶解釋放速，從而大幅度地提高原材料的使用效果和利用率。
超聲波循環(huán)提取(Ultrasonic circulating extraction)技術超聲波作用于提取介質時產生的高頻振動可促進提取介質與被提取物的液-固界面之間發(fā)生分子的相互滲透，強化溶質擴散、傳遞及溶解，使化學成分在提取介質中快速達到濃度平衡；空化效應使化學成分得以釋放、擴散進入溶劑并充分溶解；而從而極大地提高可溶性成分溶出效率并縮短提取時間。在超聲波循環(huán)提取中，超聲場固定分布，物料循環(huán)，超聲場均勻地作用于流動狀態(tài)的物料，從而最大限度地提高了超聲場作用的物料處理量。
在國內外，這兩項技術雖然已開始應用于中藥與天然藥物制藥領域和保健食品研究與開發(fā)中，但基本上都是單項的獨立應用。
董艷紅等報道對響應曲面優(yōu)化超聲波提取靈芝多糖工藝進行研究，所用的超聲波提取為發(fā)散式、靜態(tài)提取，靈芝多糖得率為20. 790. llmg/g(董艷紅，李姝婧，鄭惠華，等.響應曲面優(yōu)化超聲波提取靈芝多糖工藝研究.食品科學，2009，16(30) :98-101.)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種在常溫條件以水為提取介質，將超微粉碎技術和超聲波循環(huán)提取技術高效集成應用一稱之為“雙超”提取技術，實現靈芝子實體多糖和三萜酸等天然活性物質的高效提取的常溫提取靈芝子實體天然活性物質新工藝。
本發(fā)明中所稱的靈芝子實體天然活性物質，呈干膏狀，稱之為雙超提取物。
為了實現上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案
一種常溫提取靈芝子實體天然活性物質新工藝，其包括如下步驟
I)靈芝子實體預處理將靈芝子實體切片后粉碎成2(Γ40目的粉末；
2)超微粉碎采用超微粉碎裝置將2(Γ40目的粉末粉碎至粉末粒度為20(Γ300目，得靈芝子實體微粉末；
3)超聲波循環(huán)提取取靈芝子實體微粉末與水按質量比I :1(Γ50混合，得靈芝子實體微粉末混合液，在提取溫度36 48°C，超聲功率54(T720w，間歇比1/4. 5^1/5. 5s/s的條件下，用超聲波循環(huán)提取設備對靈芝子實體微粉末混合液提取4(T54min，提取后的靈芝子實體微粉末混合液經離心后，對料液進行分離，取上清液，得提取液；
4)真空濃縮將提取液真空濃縮至2(Γ30° Be’，得膏狀提取物；
5)真空冷凍干燥將膏狀提取物于-45'60°C下預凍4 12h后，在真空度彡30Pa下干燥22 24h，即得雙超提取物。
進一步，所述的雙超提取物包括粗多糖、三萜酸。
進一步，所述的步驟3)中的提取條件設置為提取溫度48°C，超聲功率670w，間歇比1/5. 5s/s，提取時間45min。
進一步，所述的步驟3)中得到的提取液中的粗多糖濃度不低于42mg/mL。進一步，所述的雙超提取物中的粗多糖含量不低于28%，含有三萜酸種類不低于30種。所述的粗多糖含量表示為雙超提取物中粗多糖所占的比例。
本發(fā)明所述的步驟3)中的具體參數條件可根據體外抗氧化活性指標DPPH清除率(%)和粗多糖濃度(mg/mL)作為評價指標，進行單因素選擇和優(yōu)化；其中體外抗氧化活性指標DPPH清除率(%)越高，表明雙超提取物中抗氧化活性成份越多，粗多糖濃度(mg/mL)越高，表明雙超提取物中多糖含量越高；所述的優(yōu)化采用本領域中常用的試驗設計優(yōu)化方法。
本發(fā)明采用的超聲波循環(huán)提取設備是聚能式(20KHz，19^20. 5KHz窄幅自動跟蹤)。
本發(fā)明采用以上技術方案，通過將超微粉碎和超聲波循環(huán)提取技術有效的結合，使靈芝子實體的天然活性物質溶解性好，能在常溫下進行提取，對靈芝中的有效成分影響小，提取的有效成分含量高，提取效率高，能耗低。超聲波循環(huán)提取設備在超聲波循環(huán)提取中，超聲場固定分布，物料循環(huán)，因而超聲場均勻地作用于流動狀態(tài)的物料，從而最大限度地提高了超聲場作用的物料處理量。


圖I是本發(fā)明的雙超提取物提取工藝流程(技術路線)示意圖；
圖2是本發(fā)明的靈芝子實體；
圖3是靈芝子實體切片；
圖4是靈芝子實體粉碎后2(Γ40目的粉末；
圖5是靈芝子實體微粉末的掃描電子顯微鏡相片；
圖6是本發(fā)明的靈芝子實體微粉末的激光粒度分布圖；
圖7是本發(fā)明的雙超提取物中三萜酸成分的液相色譜-質譜(LC-MS)圖；
圖8是本發(fā)明的雙超提取物中三萜酸成分的高效液相色譜圖(標準品對照)；
圖9是本發(fā)明的雙超提取物中三萜酸成分的高效液相色譜圖(標示出峰時間)。
具體實施方式
本發(fā)明的技術方案為
在常溫提取靈芝子實體天然活性物質新工藝，其包括如下步驟
I)靈芝子實體預處理將靈芝子實體切片后粉碎成2(Γ40目的粉末；
2)超微粉碎采用超微粉碎裝置將20 40目的粉末粉碎至粉末粒度為200 300目，得靈芝子實體微粉末；[0046]3)超聲波循環(huán)提取取靈芝子實體微粉末與水按質量比I :1(Γ50混合，得靈芝子實體微粉末混合液，在提取溫度36 48°C，超聲功率54(T720w，間歇比1/4. 5^1/5. 5s/s的條件下，用超聲波循環(huán)提取設備對靈芝子實體微粉末混合液提取4(T54min，提取后的靈芝子實體微粉末混合液經離心后，對料液進行分離，取上清液，得提取液；
超聲波循環(huán)提取設備由北京弘祥隆生物技術有限公司制造，或采用上海矩源機械設備有限公司或南京先歐生物科技有限公司等其他廠家所產的同類設備，頻率20KH(19^20. 5KHz，窄幅自動跟蹤)，功率可調。
4)真空濃縮將提取液真空濃縮至2(Γ30° Be’，得膏狀提取物；
5)真空冷凍干燥將膏狀提取物于-45'60°C下預凍4 12h后，在真空度彡30Pa下干燥22 24h，即得雙超提取物。
進一步，所述的雙超提取物主要包括粗多糖和三萜酸。
進一步，所述的步驟3)中的提取條件設置為提取溫度48°C，超聲功率670w，間歇比1/5. 5s/s，提取時間45min。
進一步，所述的步驟3)中得到的提取液中的粗多糖濃度不低于42mg/mL。
進一步，所述的雙超提取物中的粗多糖含量不低于28%，含有三萜酸種類不低于30種。
步驟3)所得的提取液可以測定多糖濃度和DPPH自由基清除率；
步驟5)所得的靈芝提取物可以測定粗多糖含量；同時，可采用經典的鹽酸化氯仿萃取法，從步驟5)所得的靈芝提取中分離總三萜酸類成分，并進行高效液相色譜(HPLC)或液相色譜_質譜(LC-MS)聯用分析。
上述所用的粗多糖濃度或含量測定方法為本領域中通用的硫酸苯酚法或硫酸蒽酮法。
所述DPPH清除率是一種常用的體外抗氧化活性指標，具體測定方法如下
樣品組取樣品溶液加入新鮮配制的O. 2mmol/L DPPH甲醇溶液，室溫25°C避光反應30min，所述的樣品溶液與DPPH甲醇溶液兩種溶液的體積比為1:1 ;空白對照組用重蒸水代替樣品溶液，其余同樣品組；以80%甲醇溶液為空白調零，在517nm波長處分別測定樣品組和空白對照組的吸光值，按公式清除率AzKl-A1 / AJ X 100計算清除率(％)，平行測定三次取平均值，式中A0為空白對照組的吸光值，A1為樣品組的吸光值?？梢栽诖嘶A上，建立樣品溶液的濃度與DPPH清除率的回歸方程或關系曲線，并計算半數有效濃度(EC5tl值)。
所述鹽酸化氯仿萃取法，具體如下稱取約20g靈芝雙超提取物。以70%乙醇50ml浸泡Ih后超聲提取30min，過濾，提取液減壓旋轉蒸發(fā)除去乙醇后加適量蒸餾水溶解，用6mol/L鹽酸調節(jié)pH 2 3，移至分液漏斗中，以氯仿按l:l(v/v)萃取3次，合并氯仿液，揮去氯仿用甲醇溶解定容至5ml，濾膜過濾即得總三萜酸粗制品，稱重計算平均得率(n=3)。
所述的HPLC分析，具體方法條件為
分析儀器Waters 2695型高效液相色譜儀，采用Xtimate_C18色譜柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m ;美國 Welch Material Inc.公司)。
色譜條件流動相為1%醋酸水溶液㈧和乙腈(B)，梯度洗脫程序(Tl0min，70% 65%A ;l(T58min，65% 60%A，58 60min，60% 45%A，60 115min 45% 30%A。 流速0.9ml 1^11-1，柱溫251，進樣量1(^1^。選取254nm檢測波長。
所述的LC-MS分析，具體方法條件為
分析儀器Agilent 1100型高效液相色譜-離子講串聯質譜儀(LC-MSD Trap),配有二極管陣列(DAD)檢測器，和電噴霧電離源(ESI)。
色譜柱及色譜條件與HPLC —致，經DAD檢測選取特征波長254nm。質譜條件液相出口分流20%進入質譜檢測器(O. 2mL/min)；電噴霧離子化，極性檢出模式正離子模式(MS+)，毛細管電壓4000V ;霧化氣壓力20psi ;干燥氣(N2)流速8L/min，溫度300°C ;檢測方式一級全掃描，掃描范圍m/z=100-1000。
實施例I
如圖I所示，本發(fā)明常溫提取靈芝子實體天然活性物質的操作步驟如下
I)靈芝子實體預處理取如圖2中所示的靈芝子實體，采用手工切片或中藥飲片機將其切制成f 2mm的薄片，切片后的效果如圖3所示，然后采用錘式中藥粉碎機或旋片式高速粉碎機將薄片粉碎成松散的2(Γ40目的粉末，效果如圖4所示；
2)超微粉碎采用超細粉碎機或超低溫磨粉機將2(Γ40目的粉末粉碎至粉末粒度為20(Γ300目，得靈芝子實體微粉末，如圖5中所示為靈芝子實體微粉末的掃描電子顯微鏡相片，在掃描電鏡下可見靈芝的超細粉呈纖維狀，以分散的菌絲片段形態(tài)存在圖5，長度范圍為10 50μπι，直徑I. 2 4· 5μπι不等。
如圖6所示為靈芝子實體微粉末的激光粒度分布圖，由圖可看出靈芝子實體微粉末D50. O的粒徑在10. 92 11. 75 μ m，D75. O的粒徑在26. 73 30. 96 μ m。靈芝子實體300目超細粉的粒徑超過《中國藥典》中規(guī)定的極細粉(不少于95%的粉末能通過R40/3國標系列200目九號藥篩一平均篩孔內徑為75±4. Ιμπι)的粒徑范圍。
3)超聲波循環(huán)提取取靈芝子實體微粉末與水按質量比I :12. 5混合，得靈芝子實體微粉末混合液，在提取溫度48°C，超聲功率670w，間歇比1/5. 5s/s的條件下，用超聲波循環(huán)提取設備對靈芝子實體微粉末混合液提取45min，提取液經離心后，取上清液，即得提取液；
4)真空濃縮分段進行真空濃縮，第一階段濃縮，將上清液在真空度0.06 0.0810^，溫度60 701條件下濃縮至波美度15.7° Be’ ；第二階段濃縮，將第一階段濃縮后的濃縮液在真空度O. 085 O. 09MPa或大于O. 09MPa，溫度45°C左右的條件下濃縮至波美度23. 8。Be’，得膏狀提取物；
5)真空冷凍干燥將膏狀提取物于-50°C下預凍8h后，在真空度彡30Pa下干燥23h，即得雙超提取物。
對上述步驟3)所得的提取液中進行檢測，測定結果為粗多糖濃度為47. 87mg/mL，抗氧化活性DPPH清除率為53. 62%，表明本發(fā)明所用方法提取率較高，提取物中活性物質的活性較高。
對本發(fā)明的雙超提取物與采用熱水提取法得到的靈芝提取物進行可溶性粗多糖含量的分析比較。結果表明本發(fā)明的雙超提取物中的可溶性粗多糖(40.0%)較熱水提取法得到靈芝提取物中的可溶性粗多糖含量(29. 45%)高出許多。
針對本發(fā)明的雙超提取物，采用經典的鹽酸化氯仿萃取法，從中提取分離獲得總三萜酸類成分，平均得率為9. 37%。LC-MS分析結果表明本發(fā)明的雙超提取物(干膏)中含有豐富的靈芝三萜酸成分，其總離子流色譜圖和液相色譜圖如圖7所示。共檢出56個分子離子峰，如表I所示解析得到至少31個母分子離子峰，其分子質荷比為m/z :418. 3飛78. 5，與已知靈芝三職類成分的分子量信息相匹配。其中，分子量較小如ganoderic acidZ (C30H48O3, m/z :456. 3)，分子量最大是一種三萜皂苷(C30H44O7-C6H12O5, m/z :678. 5);大多數為C30結構的四環(huán)三萜酸(m/z :456 530)。
權利要求
1.一種常溫提取靈芝子實體天然活性物質新工藝，其特征在于其包括如下步驟 1)靈芝子實體預處理將靈芝子實體切片后粉碎成2(Γ40目的粉末； 2)超微粉碎采用超微粉碎裝置將2(Γ40目的粉末粉碎至粉末粒度為20(Γ300目，得靈芝子實體微粉末； 3)超聲波循環(huán)提取取靈芝子實體微粉末與水按質量比I:1(Γ50混合，得靈芝子實體微粉末混合液，在提取溫度36 48°C，超聲功率54(T720w，間歇比1/4. 5 1/5. 5s/s的條件下，用超聲波循環(huán)提取設備對靈芝子實體微粉末混合液提取4(T54min，提取后的靈芝子實體微粉末混合液經離心后，對料液進行分離，取上清液，得提取液； 4)真空濃縮將提取液真空濃縮至2(Γ30°Be’，得膏狀提取物； 5)真空冷凍干燥將膏狀提取物于-45'60°C下預凍4 12h后，在真空度彡30Pa下干燥22 24h，即得靈芝子實體天然活性物質。
2.根據權利要求
I所述的一種常溫提取靈芝子實體天然活性物質新工藝，其特征在于所述的靈芝子實體天然活性物質包括粗多糖、三萜酸。
3.根據權利要求
I所述的一種常溫提取靈芝子實體天然活性物質新工藝，其特征在于所述的步驟3)中的提取條件設置為提取溫度48°C，超聲功率670w，間歇比l/5.5s/s，提取時間45min。
4.根據權利要求
3所述的一種常溫提取靈芝子實體天然活性物質新工藝，其特征在于所述的步驟3)中得到的提取液中的粗多糖濃度不低于42mg/mL。
5.根據權利要求
3所述的一種常溫提取靈芝子實體天然活性物質新工藝，其特征在于所述的靈芝子實體天然活性物質中的粗多糖含量不低于28%，含有三萜酸種類不低于30種。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種常溫提取靈芝子實體天然活性物質新工藝，其包括如下步驟靈芝子實體預處理、超微粉碎、超聲波循環(huán)提取、真空濃縮、真空冷凍干燥后即得靈芝子實體天然活性物質。本發(fā)明通過將超微粉碎和超聲波循環(huán)提取技術有效的結合，使靈芝子實體的天然活性物質溶解性好，能在常溫下進行提取，對靈芝中的有效成分影響小，提取的有效成分含量高，提取效率高，能耗低。超聲波循環(huán)提取設備在超聲波循環(huán)提取中，超聲場固定分布，物料循環(huán)，因而超聲場均勻地作用于流動狀態(tài)的物料，從而最大限度地提高了超聲場作用的物料處理量。
文檔編號A23L1/29GKCN102885861SQ201210429414
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月29日
發(fā)明者陳體強, 吳錦忠, 黃啟東, 吳巖斌, 吳建國 申請人:福建省農業(yè)科學院食用菌研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan