專利名稱:高效表達(dá)腫瘤血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒及其構(gòu)建方法
本發(fā)明涉及生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，及其構(gòu)建和增殖的方法。
惡性腫瘤嚴(yán)重危及人類的生命健康。目前對(duì)惡性腫瘤的常規(guī)治療仍為手術(shù)及放、化療，這種常規(guī)治療對(duì)極大多數(shù)腫瘤的療效仍不十分理想，對(duì)于極大多數(shù)化療藥物而言，其治療指數(shù)仍較低，即其治療劑量與毒性劑量較為接近。故這種治療方案通常伴有明顯的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制等。因此，研究選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞的方法對(duì)腫瘤治療非常重要，這種選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞的方法主要依賴于腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)記，其療效也決定于該腫瘤標(biāo)記是否嚴(yán)格限制于腫瘤細(xì)胞內(nèi)。
近幾年來(lái)，關(guān)于腫瘤新生血管研究取得很大進(jìn)展，F(xiàn)olkkman的研究小組提出了在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的“血管生成開(kāi)關(guān)機(jī)制”，揭示了腫瘤微血管形成的分子機(jī)制。當(dāng)腫瘤的半徑＜2mm時(shí)，它主要依靠擴(kuò)散在細(xì)胞周圍的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣生存。隨著瘤體的增大，腫瘤本身或宿主組織將建立起新生血管網(wǎng)以供給瘤體營(yíng)養(yǎng)。腫瘤新生血管網(wǎng)的形成取決于腫瘤周圍的微環(huán)境中誘導(dǎo)與抑制新生血管形成的因子相互作用結(jié)果，在腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移灶形成過(guò)程中，誘導(dǎo)及促進(jìn)新生血管形成的因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(TGF-α)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血小板來(lái)源的內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(PDEGF)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、纖溶酶原激活因子(PA)及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等占主導(dǎo)地位，而抑制新生血管形成的因子如內(nèi)皮抑素(endostatin)、血管生成抑制(angiostatin)、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、血小板反應(yīng)蛋白(thrombospondin)、血小板因子4基因、纖溶酶原激活因子抑制劑(PAI)基因及纖維結(jié)合素(fibronectin)基因等處于劣勢(shì)。從而導(dǎo)致腫瘤新生血管的形成，新生血管輸送腫瘤細(xì)胞快速增殖所需的營(yíng)養(yǎng)，也使腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移得已實(shí)現(xiàn)。抑制腫瘤新生血管的形成，可阻斷腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)不足而死亡，腫瘤明顯萎縮乃至完全消褪。同時(shí)抑制腫瘤新生血管的形成，也達(dá)到阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的通路的目的。目前已有多種阻斷腫瘤新生血管生成抑制因子進(jìn)入臨床試驗(yàn)。但由于新生血管生成抑制因子需要半衰期均較短，需要每天給予治療。同時(shí)通常需要量也較多，如內(nèi)皮抑素(endostatin)及血管生成抑素(angiostatin)治療劑量10-20mg/Kg/天。常規(guī)生物工程方法難以達(dá)到。
腫瘤特異性增殖的病毒的根據(jù)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞某些生物學(xué)特性的差異，經(jīng)過(guò)改造的病毒只能特異性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖、裂解腫瘤細(xì)胞，然后釋放出病毒顆粒，再次感染其它腫瘤細(xì)胞，再次增殖、裂解，如此產(chǎn)生放大效應(yīng)，由于病毒能夠彌散到全身各個(gè)組織及臟器，因而能感染所有腫瘤細(xì)胞，從而殺滅局部及轉(zhuǎn)移的腫瘤，而不影響正常細(xì)胞。
但迄今為止，尚未見(jiàn)到應(yīng)用腫瘤特異性增殖的病毒系統(tǒng)高效表達(dá)血管生成抑制因子的報(bào)告。
本發(fā)明的目的在于提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒及其構(gòu)建方法。
本發(fā)明的目的在于提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒的復(fù)合物。
本發(fā)明的目的在于研究上述能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒的應(yīng)用。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，將編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列插入腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒基因組中的非增殖必需區(qū)域，該病毒選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，而在正常細(xì)胞內(nèi)不增殖，通過(guò)病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，導(dǎo)致編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列拷貝數(shù)增加，從而血管生成抑制因子基因表達(dá)量增加，該腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒可以是以下任何一種(1)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的野生型病毒；(2)病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間插入腫瘤細(xì)胞特異性激活的順式作用元件；(3)蛋白功能缺失重組后能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒。
上述重組病毒可以是腺病毒、單純皰疹病毒等，編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列可以是編碼內(nèi)皮抑素的核苷酸序列、編碼血管生成抑素的核苷酸序列等。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒的構(gòu)建方法，(1)將編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列直接插入腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒基因組中的非增殖必需區(qū)域；(2)病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間插入腫瘤細(xì)胞特異性激活的順式作用元件；順式作用元件可以是下述任何一種(a).甲胎蛋白(AFP)增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(b).癌胚抗原(CEA)增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(c).酪氨酸酶增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(d).ErbB2增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(e).ErbB3增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(f).ErbB4增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(g).DF3乳腺癌相關(guān)抗原(MUC1)增強(qiáng)子；(h).前列腺素特異性抗原增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(i).腺血管舒緩素增強(qiáng)子及啟動(dòng)子；(j).EB病毒愛(ài)潑斯坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus，按常規(guī)簡(jiǎn)稱為EB病毒)中的Orip；(k).EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(按常規(guī)簡(jiǎn)稱為FR)；(l)EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子；(m).EB病毒中的Orip聯(lián)合EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子；(n).EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動(dòng)子或SV40基本啟動(dòng)子；(3)蛋白功能缺失重組后能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，蛋白功能缺失可以是下述任何一種腺病毒E1B 55Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1B19Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1A蛋白功能缺失，單純皰疹病ICP6蛋白功能缺失，單純皰疹病ICP34.5蛋白功能缺失。
病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖及復(fù)制，而在正常細(xì)胞不增殖及復(fù)制，主要通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)(1)選擇性對(duì)病毒增殖必需基因的控制基因轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)受反式作用因子(如轉(zhuǎn)錄因子)與順式作用元件相互作用的影響。當(dāng)缺乏或出現(xiàn)某些轉(zhuǎn)錄因子會(huì)影響基因的轉(zhuǎn)錄水平。本發(fā)明應(yīng)用腫瘤組織特異性激活順式作用元件(包括啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)控制目的基因，使該目的基因特異性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而在正常的細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)或低水平表達(dá)。應(yīng)用控制腫瘤組織特異性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子病毒增殖及復(fù)制的必需基因，從而使病毒增殖必需基因只能在腫瘤的細(xì)胞中表達(dá)，導(dǎo)致病毒只能在腫瘤的細(xì)胞內(nèi)增殖，而在正常細(xì)胞內(nèi)不增殖。
本發(fā)明采用細(xì)胞專一的反應(yīng)元件是由腫瘤細(xì)胞特異性激活順式作用元件組成，其順式作用元件可以是下述任何一種甲胎蛋白(AFP)增強(qiáng)子及啟動(dòng)子為肝癌細(xì)胞特異性激活增強(qiáng)子及啟動(dòng)子。
癌胚抗原(CEA)增強(qiáng)子及啟動(dòng)子為胃癌及結(jié)腸癌細(xì)胞特異性激活增強(qiáng)子及啟動(dòng)子。
酪氨酸酶增強(qiáng)子及啟動(dòng)子為黑色素瘤細(xì)胞特異性激活增強(qiáng)子及啟動(dòng)子。
ErbB2增強(qiáng)子及啟動(dòng)子為乳腺癌細(xì)胞特異性激活增強(qiáng)子及啟動(dòng)子。
ErbB3增強(qiáng)子及啟動(dòng)子為乳腺癌細(xì)胞特異性激活增強(qiáng)子及啟動(dòng)子。
ErbB4增強(qiáng)子及啟動(dòng)子為乳腺癌及胃癌細(xì)胞特異性激活增強(qiáng)子及啟動(dòng)子。
DF3乳腺癌相關(guān)抗原(MUC1)增強(qiáng)子為乳腺癌細(xì)胞特異性激活增強(qiáng)子及啟動(dòng)子。
前列腺素特異性抗原增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，該前列腺素特異性抗原增強(qiáng)子位于前列腺素特異性抗原起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的nt-5322～nt-3739，啟動(dòng)子位于前列腺素特異性抗原起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的nt-540～nt+12，該增強(qiáng)子與啟動(dòng)子特異性激活于前列腺細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞。
腺血管舒緩素增強(qiáng)子及啟動(dòng)子特異性激活于前列腺細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞。
愛(ài)潑斯坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus，按常規(guī)簡(jiǎn)稱為EB病毒)中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子、EB病毒中的Orip聯(lián)合EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子、EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動(dòng)子或SV40基本啟動(dòng)子、在EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞中特異性激活的順式作用元件。
本發(fā)明提出的在于提供一類能特異性殺滅腫瘤細(xì)胞的增殖型重組病毒，它至少有一個(gè)病毒增殖所必需的基因的腫瘤細(xì)胞特異性激活的順式作用元件制。它由在病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域插入某種順式作用元件而構(gòu)成。該順式作用元件特異性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)激活，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性，而在正常細(xì)胞內(nèi)不激活，不能產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性。該順式作元件可以是下述順序之一甲胎蛋白(AFP)增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，癌胚抗原(CEA)增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，酪氨酸酶增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，ErbB2增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，ErbB3增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，ErbB4增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，DF3乳腺癌相關(guān)抗原(MUC1)增強(qiáng)子，前列腺素特異性抗原增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，腺血管舒緩素增強(qiáng)子及啟動(dòng)子，EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子、EB病毒中的Orip聯(lián)合EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子、EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動(dòng)子或SV40基本啟動(dòng)子、在EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞中特異性激活的順式作用元件。上述病毒增殖所必需的為病毒早期表達(dá)基因，如單純皰疹病毒早早期表達(dá)基因ICP4。
本發(fā)明中，上述病毒可以采用腺病毒。其病毒增殖必需基因至少含有以下一個(gè)腺病毒的早期表達(dá)基因E1A、E1B、E2、E4。
(2).病毒在正常細(xì)胞復(fù)制必需而在腫瘤細(xì)胞中非必需的基因編碼的蛋白功能選擇性地缺失正常細(xì)胞與腫瘤存在著某些基因表達(dá)上的差異，某些病毒在正常細(xì)胞內(nèi)復(fù)制所必需的基因，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)并不需要，因此，去除這些基因編碼的蛋白功能有望使在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性復(fù)制，而不能在正常細(xì)胞中復(fù)制。
病毒蛋白功能功失可以是以下任何一種腺病毒E1B 55kDa的基因點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變導(dǎo)致E1B 55kDa蛋白質(zhì)功能異常。腺病毒E1B 19kDa的基因點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變導(dǎo)致E1B 19kDa蛋白質(zhì)功能異常。腺病毒E1A的基因點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變導(dǎo)致E1A蛋白質(zhì)功能異常。單純皰疹病毒ICP6基因點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變導(dǎo)致ICP6的蛋白質(zhì)功能異常。單純皰疹病毒ICP34.5基因點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變導(dǎo)致ICP34.5的蛋白質(zhì)功能異常。
(3).依賴于腫瘤細(xì)胞某個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常而產(chǎn)生的病毒復(fù)制，呼吸道腸道過(guò)濾性病毒(Reovirus)感染后其早期病毒基因轉(zhuǎn)錄可激活雙鏈RNA依賴的蛋白激酶(PKR)，而該激酶可抑制該病毒的其它基因的轉(zhuǎn)錄，從而使病毒不能有效復(fù)制，而當(dāng)細(xì)胞中Ras處于激活狀態(tài)則可抑制該激酶，從而使該病毒活躍復(fù)制。Ras基因是一個(gè)癌基因，當(dāng)它被不正常激活時(shí)，即可能發(fā)生癌變。呼吸道腸道過(guò)濾性病毒復(fù)制及增殖依賴于Ras異常激活的信號(hào)途徑，即在Ras高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及增殖。
(4).選擇性進(jìn)入腫瘤細(xì)胞改變它們表面的結(jié)合蛋白可使其與某些特定的腫瘤組織結(jié)合，從而使病毒只能感染特定的腫瘤組織。目前這方面改造主要集中于腺病毒外殼蛋白--纖維蛋白(Fiber)、五鄰體(penton)及六鄰體蛋白(hexon)，尤其在纖維蛋白中頭部HI環(huán)中或C末端最常見(jiàn)，包括插入腫瘤膜表面具有高親和力的某種配體、短肽及抗體Fab區(qū)域。
本發(fā)明提供一類的能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼含有分泌型信號(hào)肽的內(nèi)皮抑素(endostatin)的核苷酸序列。內(nèi)皮抑素是一個(gè)膠原蛋白XVIII的20KDa的C-末端片段，它能特異性地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用，而不影響其它細(xì)胞。Folkman等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明內(nèi)皮抑素對(duì)腫瘤誘導(dǎo)的血管生成具有強(qiáng)烈的抑制活性，從而抑制腫瘤的形成與轉(zhuǎn)移，而且反復(fù)應(yīng)用內(nèi)皮抑素?zé)o抗性產(chǎn)生，即使數(shù)百倍治療劑量也無(wú)明顯毒性。由于內(nèi)皮抑素為膠原蛋白XVIII的C-末端片段，故無(wú)分泌性信號(hào)肽。在基因治療時(shí)需要加入分泌型信號(hào)肽，M-成瘤蛋白信號(hào)肽及免疫球蛋白K鏈信號(hào)肽均為強(qiáng)分泌型信號(hào)肽，在內(nèi)皮抑素加入M-成瘤蛋白信號(hào)肽或免疫球蛋白K鏈信號(hào)肽可將內(nèi)皮抑素分泌至細(xì)胞外。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血管生成抑素(angiostatin)的核苷酸序列。血管生成抑素是血漿纖維蛋白溶酶原(plasminogen)的內(nèi)部片段。血漿纖維蛋白溶酶原包含Kringle1-5結(jié)構(gòu)，Kringle位點(diǎn)是3個(gè)環(huán)狀相連的二硫鍵結(jié)構(gòu)，每個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)包含約80個(gè)氫基酸，各個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)有50％左右的序列相同。血管生成抑素具有強(qiáng)烈抑制血管生存和腫瘤生長(zhǎng)。通常的血管生成抑素是指血漿纖維蛋白溶酶原中含有Kringle1-4結(jié)構(gòu)的38kDa蛋白片段。最近有研究對(duì)人血漿纖維蛋白溶酶原水解片段Kringle1-4和Kringle1-3作抗血管內(nèi)皮細(xì)胞作用比較，Kringle1-3比Kringle1-4抗血管內(nèi)皮細(xì)胞作用更強(qiáng)，重組的人Kringle1、Kringle2、Kringle3及Kringle4抗血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的研究表明抗血管內(nèi)皮細(xì)胞作用依次Kringle1＞Kringle3＞Kringle2，而Kringle4幾乎無(wú)活性。Keingle5抗血管內(nèi)皮細(xì)胞作用活性與Kringle1-4相似或更強(qiáng)。
本發(fā)明中該編碼血管生成抑制因子(angiostatin)的核苷酸序列，其為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-4結(jié)構(gòu)的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-5結(jié)構(gòu)的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-3結(jié)構(gòu)的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-3加上Kringle5結(jié)構(gòu)的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1結(jié)構(gòu)的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle2結(jié)構(gòu)的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle3結(jié)構(gòu)的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle5結(jié)構(gòu)的核苷酸序列。
干擾素廣泛應(yīng)用于抗病毒治療，有研究表明干擾素在體內(nèi)有明顯抑制腫瘤的作用。實(shí)驗(yàn)表明干擾素是通過(guò)抑制腫瘤新生血管形成而抑制腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼干擾素-α的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼干擾素-β的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼干擾素-γ的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血小板反應(yīng)蛋白I(thrombospondin I)的核苷酸序列。血小板反應(yīng)蛋白I是一個(gè)由三個(gè)相同的180kDa亞單位組成的糖蛋白，它只少有兩個(gè)不同的作用區(qū)域抑制新生微血管的形成。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血小板因子4的核苷酸序列。血小板因子4是血小板α顆粒蛋白，其抑制新生微血管形成區(qū)位于C-末端、肝素結(jié)合區(qū)。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼纖溶酶原激活因子抑制劑(PAI)的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼白細(xì)胞介素-12的核苷酸序列。白細(xì)胞介素-12是一個(gè)具有多種功能的細(xì)胞因子，包括促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、增強(qiáng)抗腫瘤的細(xì)胞免疫、誘導(dǎo)大量干擾素γ的產(chǎn)生、增強(qiáng)NK細(xì)胞及LAK細(xì)胞活性。最近發(fā)現(xiàn)它具有抗新生血管形成作用。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼纖維結(jié)合素(fibronectin)的核苷酸序列。纖維結(jié)合素是很多正常細(xì)胞的表面的主要組成成分及潛在的細(xì)胞獼散因子。纖維結(jié)合素在體內(nèi)抑制新生血管生成。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列受啟動(dòng)子控制。該啟動(dòng)子可以為以下啟動(dòng)子之一猴病毒40(Simian virus40，按常規(guī)簡(jiǎn)稱為SV40)啟動(dòng)子、勞斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，按常規(guī)簡(jiǎn)稱為RSV)LTR啟動(dòng)子及人巨細(xì)胞病毒(按常規(guī)簡(jiǎn)稱為HCMV)IE啟動(dòng)子等。
本發(fā)明在上述這種修飾病毒基因組中非增殖必需區(qū)域插入編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列，本發(fā)明所述的編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為含有分泌型信號(hào)肽的內(nèi)皮抑素基因(endostatin)，該分泌信號(hào)肽為M-成瘤蛋白信號(hào)肽、免疫球蛋白K鏈信號(hào)肽，血管生成抑素基因(angiostatin)(血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-4結(jié)構(gòu))、血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-5結(jié)構(gòu)、血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-3結(jié)構(gòu)、血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-3加上Kringle5結(jié)構(gòu)、血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1結(jié)構(gòu)、血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle2、結(jié)構(gòu)血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle3、結(jié)構(gòu)血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle5結(jié)構(gòu)、干擾素-α基因、干擾素-β基因、干擾素-γ基因、血小板反應(yīng)蛋白(thrombospondin)基因、血小板因子4基因、纖溶酶原激活因子抑制劑(PAI)基因、白細(xì)胞介素-12及纖維結(jié)合素(fibronectin)基因。隨著病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，使編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列拷貝數(shù)增加，使腫瘤細(xì)胞高效表達(dá)血管生成抑制因子，從而抑制腫瘤血管形成，抑制腫瘤形成、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。同時(shí)，這種修飾后的病毒載體可被用于在某些細(xì)胞混合物中殺滅被某種殊靶細(xì)胞，通過(guò)給予修飾后的病毒能選擇性地在該種靶細(xì)胞中增殖，從而使這種靶細(xì)胞被增殖的病毒選擇性的殺滅；在體外培養(yǎng)或在動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)將修飾后的病毒與細(xì)胞復(fù)合物混合，病毒只能在靶細(xì)胞增殖，也就是說(shuō)除了靶細(xì)胞，其它細(xì)胞不能被這種病毒殺死。由于病毒在靶細(xì)胞內(nèi)增殖及擴(kuò)增，從而使混合細(xì)胞中的該靶細(xì)胞被殺滅，一旦靶細(xì)胞被破壞，病毒不再能夠再增殖。
本發(fā)明提出的高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒與化學(xué)治療藥物(如順鉑、5-氟脲嘧啶絲裂霉素C等)、生物毒素(如蛇毒素)、單克隆抗體一起可以組成復(fù)合物，其作為抗腫瘤藥物效果更好。與X-線聯(lián)合應(yīng)用可產(chǎn)生更為有效的抗腫瘤效應(yīng)。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，用于抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，用于體外感染腫瘤細(xì)胞，病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及增殖，導(dǎo)致編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列拷貝數(shù)增加及血管生成抑制因子表達(dá)量增加。
本發(fā)明提供一類能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，可用于體內(nèi)選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及增殖，導(dǎo)致編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列拷貝數(shù)增加及其表達(dá)量增加，抑制腫瘤血管形成，抑制腫瘤形成、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。同時(shí)該病毒能在而且僅限于腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，也能特異性直接殺滅腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明提供一類治療腫瘤的能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，這種重組病毒可用于治療腫瘤。
2.本發(fā)明提供一類高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒的構(gòu)建方法。該方法通常易行可用于構(gòu)建高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒。
3.本發(fā)明提供一種在體內(nèi)及體外殺滅腫瘤細(xì)胞、而不影響正常細(xì)胞，并在體內(nèi)及體外腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)血管生成抑制因子，與化學(xué)抗腫瘤藥物結(jié)合，更有效地殺滅腫瘤細(xì)胞，達(dá)到高效低毒應(yīng)用于治療腫瘤的目的。
人類腺病毒有6個(gè)不同亞屬，分為A、B、C、D、E及F。它們對(duì)宿主細(xì)胞的親嗜性、致瘤性及疾病史并不相同。本發(fā)明以腺病毒C亞屬中的5型(Ad5)作為例證對(duì)本發(fā)明加以進(jìn)一步具體說(shuō)明，本發(fā)明構(gòu)建手段均是現(xiàn)有技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)。
例一、攜帶人內(nèi)皮抑素(endostatin)基因的E1區(qū)缺失的腺載體的構(gòu)建pCA13載體購(gòu)于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pCA13含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1區(qū)342至3523bp片段，在E1缺失區(qū)插入了人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)及SV40 poly A加尾信號(hào)。應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)人內(nèi)皮抑素(endostatin)基因，自新鮮的正常人肝組織中抽提總RNA，以隨機(jī)引物作逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在擴(kuò)增人內(nèi)皮抑素(endostatin)基因，并用兩次多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)(方法參見(jiàn)PCRProtools Current Methods and Applications，White BA主編，HumanaPress Inc.1993年出版-文獻(xiàn)1)在基因前加入M-成瘤蛋白(Oncostatin-M)信號(hào)肽及信號(hào)肽前、基因結(jié)尾引入EcoR I和Xba I兩個(gè)酶切位點(diǎn)。
Primer1GGG GAA TTC ACC ATG GGG GTA CTG CTC ACA CAG AGG ACGCTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTCPrimer2CTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTC CTG TTT CCA AGC ATGGCG AGC CAC AGC CAC CGC GAC TTC CAGPrimer3GCT CTA GAC TAT TAC TTG GAG GCA GTC ATG AAG CTG TTCTCA ATG CAT AGC ACG ATG TAG GCG TGPrimer2與primer3進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，回收615bp片段，再用primer1與primer3對(duì)615bp片段進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，回收647bp片段，應(yīng)用EcoR I+Xba I對(duì)酶切，將該基因插入pbluescript IIKS(+)載體(購(gòu)于美國(guó)ATCC公司)中進(jìn)行測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果見(jiàn)下GAATTCACCATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTAACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTATGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAGTAATAGTCTAG將其EcoR I+Xba I切下，定向插入pCA13載體EcoR I+Xba I中，命名pCA13-human endostatin。
例二、攜帶血管生成抑素(angiostatin)基因的E1區(qū)缺失的腺載體的構(gòu)建應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)血管生成抑素(angiostatin)基因，自新鮮的正常人肝組織中抽提總RNA，以隨機(jī)引物作逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后進(jìn)行第一輪PCR，并用兩次多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)(方法參見(jiàn)PCR Protools Current Methods and Applications，White BA主編，Humana Press Inc.1993年出版-文獻(xiàn)1)在基因結(jié)尾引入EcoR I和Xho I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，primer4AGC GAA TTC CAA AAT GGA ACA TAA GGEcoR I血漿纖維蛋白溶酶原49-67primer5ACA CTT TTC CTT GAC CTG ATT TCA G血漿纖維蛋白溶酶原348-343+111-94primer6CTG AAA TCA GGT CAA GGA AAA GTG TAT CTC TCAGAG TGC血漿纖維蛋白溶酶原94-111+343-363primer75’-AGCCTCGAGCTATTACGCTTCTGTTCCTGAG-3’Xho I(2Stop)血漿纖維蛋白溶酶原1431-1416Primer4與primer5、primer6與primer7分別進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，將其反應(yīng)產(chǎn)物混合，用primer4與primer7進(jìn)行再次PCR反應(yīng)，回收1168bp片段。應(yīng)用EcoR I+Xho I對(duì)酶切，將該基因插入pbluescript IIKS(+)載體(購(gòu)于美國(guó)ATCC公司)中進(jìn)行測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果見(jiàn)下GAATTCCAAAATGGAACATAAGGAAGTGGTTCTTCTACTTCTTTTATTTCTGAAATCAGGTCAAGGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGA
GCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGTAATAGCTCGAG將其EcoR I+Xho I切下，定向插入pCA13載體EcoR I+Xho I中，命名pCA13-human angiostatin。
例三、腺病毒E1b 55Kda蛋白基因部分缺失及在缺失區(qū)插入終止密碼子載體的構(gòu)建pXC.1載體購(gòu)于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。應(yīng)用內(nèi)切酶Bgl II將該載體在3329bp中切開(kāi)，然后用內(nèi)切酶Hind III再作部分酶切，回收9372bp DNA片段，應(yīng)用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段對(duì)3’凹端補(bǔ)平，即為pXC.1載體中缺失2809bp-3329bp區(qū)域(具體方法參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)。
合成兩個(gè)DNA寡核苷酸片段做一個(gè)連接頭，其DNA寡核苷酸序列為primer8 TAATGAGTAACTAAprimer9 TTAGTTACTCATTA將兩個(gè)DNA寡核苷酸片段各0.1μg混合，100℃變性5分鐘，然后緩慢降溫復(fù)性，復(fù)性后應(yīng)用T4噬菌體多核苷酸激酸進(jìn)行磷酸化。將該磷酸化后的連接頭與缺失2809-3329bp區(qū)域的pXC.1載體片段進(jìn)行連接，命名為pXC-del E1b(方法參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)。在插入連接頭兩端附近位置中合成引物，分別為primer10 CTG GCC AAT ACC AAC CTT Aprimer11 ATA TGA GCT CAC AAT GCT TC對(duì)pXC-del E1b進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行體外擴(kuò)增(方法參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)，其PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示CTGGCCAATACCAACCTTATCCTACACGGTGTAAGCTTAATGAGTAACTAAGATCTGGAAGGTGCTGAGGTACGATGAGACCCGCACCAGGTGCAGACCCTGCGAGTGTGGCGGTAAACTATTAGGAACCAGCCTGTGATGCTGGATGTGACCGAGGAGCTGAGGCCCGATCACTTGGTGCTGGCCTGCACCCGCGCTGAGTTTGGCTCTAGCGATGAAGATACAGATTGAGGTACTGAAATGTGTGGGCGTGGCTTAAGGGTGGGAAAGAATATATAAGGTGGGGGTCTTATGTAGTTTTGTATCTGTTTTGCAGCAGCCGCCGCCGCCATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATAT，這表明pXC-del E1b為pXC.1載體中缺失了2809-3329區(qū)域并在該區(qū)域中插入TAATGAGTAACTAA，并在兩個(gè)終止密碼子后保留了Bgl II酶切位點(diǎn)。
例四、攜帶人內(nèi)皮抑素或血管生成抑素的E1b 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒載體的構(gòu)建應(yīng)用Bgl II分別酶切pCA13-human endostatin和pCA13-humanangiostatin，分別回收1237bp(含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40poly A加尾信號(hào))及1758bp(人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、人血管生成抑制及SV40 poly A加尾信號(hào))，將其插入pXC-delE1b Bgl II酶切位點(diǎn)，應(yīng)用PCR技術(shù)分別驗(yàn)證其插入的正反方向其Bgl II上游引物primer10CTG GCC AAT ACC AAC CTT A分別與人內(nèi)皮抑素5’及3’-primer進(jìn)行擴(kuò)增primer12人內(nèi)皮抑素5’-primer(位于M-成瘤蛋白信號(hào)肽及人內(nèi)皮抑素基因中110-131bp)TCC ACC TGG TTG CGC TCA ACA Gprimer13人內(nèi)皮抑素3’-primer(位于M-成瘤蛋白信號(hào)肽及人內(nèi)皮抑素基因中577-600bp)AGC ACG ATG TAG GCG TGA TGG C分別與人血管生成抑素5’及3’-primer進(jìn)行擴(kuò)增primer14人血管生成抑素5’-primer(位于人血管生成抑素11-32bp)ATG GAA CAT AAG GAA GTG GTT Cprimer15人血管生成抑素3’-primer(位于人血管生成抑素823-842bp)AGG AGT CAC AGG ACG GTA TC其primer10與primer13能擴(kuò)增到1056bp，表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號(hào)正向插入pXC-del E1b Bgl II酶切位點(diǎn)，命名為pXC-del E1b-endostatin1。其primer10與primer12能擴(kuò)增到752bp，表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號(hào)反向插入pXC-del E1b Bgl II酶切位點(diǎn)。命名為pXC-delE1b-endostatin2其primer10與primer15能擴(kuò)增到1298bp，表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40poly A加尾信號(hào)正向插入pXC-del E1b Bgl II酶切位點(diǎn)，命名為pXC-del E1b-angiostatin1。其primer10與primer14能擴(kuò)增到1374bp，表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信號(hào)反向插入pXC-del E1b Bgl II酶切位點(diǎn)，命名為pXC-del E1b-angiostatin2。
例五、攜帶人內(nèi)皮抑素或血管生成抑素的E1b 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒的重組將本發(fā)明的缺陷型病毒轉(zhuǎn)染至E1轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞株293或E1轉(zhuǎn)化的人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞株911細(xì)胞，本發(fā)明例將其轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，293細(xì)胞株購(gòu)于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞而成，它含有及表達(dá)5型腺病毒E1區(qū)，腺病毒DNA對(duì)其具有高轉(zhuǎn)染率。將含有5型腺病毒左臂的質(zhì)粒聯(lián)合含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過(guò)同源重組可產(chǎn)生具有感染力的腺病毒。我們將pXC-del E1b-endostatin1 pXC-del E1b-endostatin2、pXC-del E1b-angiostatin1或pXC-del E1b-angiostatin2分別與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHG10或pBHGE3通過(guò)Lipofectamine共轉(zhuǎn)染至293細(xì)株，其具體方法參見(jiàn)GIBCO BRL公司的操作說(shuō)明。pBHG10及pBHGE3購(gòu)于加拿大Microbix Biosystems Inc.(Ontario)，pBHG10含有5型腺病毒右臂，但缺失E3區(qū)；pBHGE3含有5型腺病毒右臂，含有E3區(qū)。共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過(guò)三次病毒空斑純化，該腺病毒命名為CNHK-ehdostatin1-1、CNHK-endostatin1-2、CNHK-endostatin2-1CNHK-endostatin2-2及CNHK-angiostatin1-1、CNHK-angiostatin1-2、CNHK-angiostatin2-1、CNHK-angiostatin2-2，具體方法參見(jiàn)GeneTransfer and Expression Protocols，Murray EJ主編，Humana Press1991出版。
病毒的產(chǎn)生及基因組結(jié)構(gòu)重組腺病毒方法參見(jiàn)例一內(nèi)容。其名稱見(jiàn)下病毒 名稱 含Ad5左臂質(zhì)粒 含Ad5右臂質(zhì)粒Ad5-del E1b- pXC-del E1b-CNHK-endostatin1-1 PBHGE3endostatin1 endostatin1Ad5-del E1b- pXC-del E1b-CNHK-ehdostatin1-2 PBHGE3endostatin2 endostatin2Ad5-del E1b E3- pXC-del E1b-CNHK-endostatin2-1 PBHG10endostatin1 endostatin1Ad5-del E1b E3- pXC-del E1b-CNHK-endostatin2-2 PBHG10endostatin2 endostatin2Ad5-del E1b- pXC-del E1b-CNHK-angiostatin1-1 PBHGE3angiostatin1 angiostatin1Ad5-del E1b- CNHK-angiostatin1-2 pXC-del E1b- PBHGE3
angiostatin2 angiostatin2Ad5-del E1b E3- pXC-del E1b-CNHK-angiostatin2-1 PBHG10angiostatin1 angiostatin1Ad5-del E1b E3- pXC-del E1b-CNHK-angiostatin2-2 PBHG10angiostatin2 angiostatin2腺病毒在293細(xì)胞中大量繁殖，應(yīng)用氯化銫梯度離心的方法大量純化腺病毒(具體方法參見(jiàn)Gene Transfer and ExpressionProtocols，Murray EJ主編，Humana Press 1991出版)。Ad5-del E1b-endostatin1(CNHK-endostatin-1-1)為5型腺病毒，在2809-3329bp區(qū)域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區(qū)域中插入含有兩個(gè)終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后Bgl II酶切位點(diǎn)中正向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40 polyA加尾信號(hào)基因序列，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。Ad5-delE1b-endostatin2(CNHK-endostatin-1-2)為5型腺病毒，在2809-3329bp區(qū)域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區(qū)域中插入含有兩個(gè)終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后Bgl II酶切位點(diǎn)中反向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號(hào)基因序列，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。Ad5-del E1b E3-endostatin1(CNHK-endostatin-2-1)為5型腺病毒，在2809-3329bp區(qū)域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區(qū)域中插入含有兩個(gè)終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后Bgl II酶切位點(diǎn)中正向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號(hào)基因序列，同時(shí)伴有28133-30818bp(E3區(qū)部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。Ad5-del E1b E3-endostatin2(CNHK-endostatin-2-2)為5型腺病毒，在2809-3329bp區(qū)域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區(qū)域中插入含有兩個(gè)終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后Bgl II酶切位點(diǎn)中反向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號(hào)基因序列，同時(shí)伴有28133-30818bp(E3區(qū)部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
Ad5-del E1b-angiostatin1(CNHK-angiostatin-1-1)為5型腺病毒，在2809-3329bp區(qū)域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區(qū)域中插入含有兩個(gè)終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后Bgl II酶切位點(diǎn)中正向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、人angiostatin及SV40 poly A加尾信號(hào)基因序列，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。Ad5-del E1b-angiostatin2(CNHK-angiostatin-1-2)為5型腺病毒，在2809-3329bp區(qū)域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區(qū)域中插入含有兩個(gè)終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后Bgl II酶切位點(diǎn)中反向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、人angiostatin及SV40 poly A加尾信號(hào)基因序列，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。Ad5-del E1b E3-angiostatin1(CNHK-angiostatin-2-1)為5型腺病毒，在2809-3329bp區(qū)域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區(qū)域中正向插入含有兩個(gè)終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后Bgl II酶切位點(diǎn)中正向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、人angiostatin及SV40 poly A加尾信號(hào)基因序列，同時(shí)伴有28133-30818bp(E3區(qū)部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。Ad5-del E1bE3-angiostatin2(CNHK-angiostatin-2-2)為5型腺病毒，在2809-3329bp區(qū)域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區(qū)域中插入含有兩個(gè)終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后Bgl II酶切位點(diǎn)中反向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、人angiostatin及SV40 poly A加尾信號(hào)基因序列，同時(shí)伴有28133-30818bp(E3區(qū)部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
例六、攜帶人內(nèi)皮抑素或血管生成抑素的E1b 55Kda蛋白基因部分缺失的重組腺病毒體外腫瘤細(xì)胞復(fù)制、增殖并高效表達(dá)人內(nèi)皮抑素或人血管生成抑素，并在體外特異性殺滅腫瘤細(xì)胞將CNHK-endostatin1-1、CNHK-endostatin1-2、CNHK-angiostatin1-1及CNHK-angiostatin1-2分別感染肝癌細(xì)胞株Hep3B、293及正常人成纖維細(xì)胞，細(xì)胞按2×105/孔接種6孔板，分別感染重組腺病毒CNHKEBV-endostatin1-1、CNHKEBV-endostatin1-2、CNHKEBV-angiostatin1-1、CNHKEBV-angiostatin1-2及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小時(shí)后應(yīng)用293細(xì)胞株測(cè)定其病毒滴度，具體方法參見(jiàn)前述文獻(xiàn)2，結(jié)果為正常成纖維細(xì)293 Hep 3B胞野生型5型腺病1×1057×1045×104毒CNHK-1×1053×1041×10endostatin1-1CNHK-1×1052×1042×10endostatin1-2CNHK-1×1052.5×1042.5×10angiostatin1-1CNHK-1×1052.1×1042.5×10angiostatin1-2將肝癌細(xì)胞株Hep3B及正常人成纖維細(xì)胞分別感染重組腺病毒CNHK-endostatin1-1、CNHK-endostatin1-2、CNHK-angiostatin1-1及CNHK-angiostatin1-2，MOI為1，37℃孵育1小時(shí)，感染后7天收集細(xì)胞，應(yīng)用QIAamp DNA Blood mini kit(德國(guó)QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法參見(jiàn)QIAGEN公司操作說(shuō)明。應(yīng)用Nhe I和Xho I雙酶切，用0.8％的瓊脂糖電泳，將其轉(zhuǎn)至尼龍膜，用32P標(biāo)記人5型腺病毒1178bp Bst XI加X(jué)ho I片段(位于腺病毒nt4611-5789)，進(jìn)行souther blot雜交，以pXC.1作為病毒拷貝數(shù)對(duì)照(方法參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)，CNHK-endostatin1-1、CNHK-endostatin1-2、CNHK-angiostatin1-1及CNHK-angiostatin1-2在肝癌細(xì)胞株Hep3B及正常人成纖維細(xì)胞的每個(gè)細(xì)胞病毒拷貝數(shù)分別為2×104、3×104、1×104、1×104及＜10、＜10、＜10、＜10。
將上述CNHK-endostatin1-1及CNHK-endostatin1-2提取的DNA分別應(yīng)用Bgl II酶切，用1％的瓊脂糖電泳，將其轉(zhuǎn)至尼龍膜，用32P分別標(biāo)記人內(nèi)皮抑素cDNA片段(EcoR I與Xba I雙酶切pCA13-humanendostatin，回收637bp)作為探針，進(jìn)行souther blot雜交，以pCA13-human endostatin作為病毒拷貝數(shù)對(duì)照(方法參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)，CNHK-endostatin1-1及CNHK-endostatin1-2在肝癌細(xì)胞株Hep3B及正常人成纖維細(xì)胞的每個(gè)細(xì)胞病毒拷貝數(shù)分別為2×104、3×104及＜10、＜10。
將上述CNHK-angiostatin1-1及CNHK-angiostatin1-2提取的DNA分別應(yīng)用Bgl II酶切，用1％的瓊脂糖電泳，將其轉(zhuǎn)至尼龍膜，用32P分別標(biāo)記人血管生成抑素cDNA片段(EcoR I與Xba I雙酶切pCA13-human angiostatin，回收1168bp)作為探針，進(jìn)行souther blot雜交，以pCA13-human angiostatin作為病毒拷貝數(shù)對(duì)照(方法參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)，CNHK-angiostatin1-1及CNHK-angiostatin1-2在肝癌細(xì)胞株Hep3B及正常人成纖維細(xì)胞的每個(gè)細(xì)胞病毒拷貝數(shù)分別為1×104、1×104及10、10。
例七、攜帶人內(nèi)皮抑素或血管生成抑素的E1b 55Kda蛋白基因部分缺失的重組腺病毒在裸鼠體內(nèi)治療移植腫瘤并高效表達(dá)人內(nèi)皮抑素或人血管生成抑素，抑制腫瘤新生血管形成，抑制腫瘤形成、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。同時(shí)該病毒能在而且僅限于腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，也能特異性直接殺滅腫瘤細(xì)胞。
將4-5周齡的SCID小鼠皮下接種肝癌細(xì)胞株Hep 3B細(xì)胞1×107，兩周后給予1×109pfu增殖型重組腺病毒CNHK101治療或用相同劑量的對(duì)照腺病毒Ad5-Lac Z，其未治療組及對(duì)照腺病毒治療組4周后腫瘤體增加4倍以上，而治療組則腫瘤明顯縮小，部分腫瘤完全消失。
例八含有EB病毒順式作用元件的載體的構(gòu)建以pCAT-Basic為基礎(chǔ)載體，在其多克隆位點(diǎn)中插入EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(FR，位于EB病毒7337-8190bp)聯(lián)合SV40基本啟動(dòng)子(mini-SV40)，pCAT-Basic購(gòu)自Promega公司。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增EB病毒Orip中的family of 30bp repeats及mini-SV40啟動(dòng)子。前者的模板EB病毒DNA從淋巴瘤細(xì)胞株B95-8中提取，其提取病毒DNA方法參見(jiàn)QIAGEN公司QIAamp Blood試劑盒的操作說(shuō)明。后者的模板為pCAT-Control(購(gòu)于Promega公司)。EB病毒Orip中的FR的引物為primer165’-引物(含有Hind III及Age I酶切位點(diǎn))GGG AAG CTTACC GGT GCA TGC AGG AAA AGG ACA AGCprimer173’-引物(含有部分mini-SV40啟動(dòng)子序列)GAG ATGCAG ATC AAT GGC ACC CCG GGG AAT ACCmini-SV40啟動(dòng)子的引物為primer185’-引物(含有部分Orip中的FR序列)GTG CCA TTG ATCTGC ATC TCA ATT AGT CAGprimer193’-引物(含有Sal I及Age I酶切位點(diǎn))GCT AAA GTCGAC ACC GGT AAG CTT TTT GCA AAA GCC TAG應(yīng)用兩次疊加PCR技術(shù)(方法同前)將EB病毒Orip中的FR序列和mini-SV40啟動(dòng)子產(chǎn)生融合啟動(dòng)子，將其融合啟動(dòng)子PCR片段應(yīng)用Hind III及Sal I雙酶切插入pCAT-Basic載體Hind III及SalI位點(diǎn)中(方法參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)。將該片段進(jìn)行DNA測(cè)序，其融合啟動(dòng)子序列完全正確，記為CHEB-FRSV40。
以pbluescript II KS(+)為基礎(chǔ)載體(購(gòu)于美國(guó)ATCC公司)，在其多克隆位點(diǎn)中插入EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(FR，位于EB病毒7337-8190bp)聯(lián)合HSV-TK基本啟動(dòng)子(mini-TK)，pbluescript II購(gòu)自Promega公司。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增EB病毒Orip中的family of 30bp repeats及mini-SV40啟動(dòng)子。前者的模板EB病毒DNA從淋巴瘤細(xì)胞株B95-8中提取，其提取病毒DNA方法參見(jiàn)QIAGEN公司QIAamp Blood試劑盒的操作說(shuō)明。后者的模板為(購(gòu)于Invitrogen公司)。
EB病毒Orip中的FR的引物為Primer205’-引物(含有Xho I酶切位點(diǎn))GGG CAT CTC GAG GCATGC AGG AAA AGG ACA AGCPrimer213’-引物(含有部分mini-HSV-TK啟動(dòng)子序列)AGT CGGGGC GGC AAT GGC ACC CCG GGG AAT ACCmini-HSV-TK啟動(dòng)子的引物為
Primer225’-引物(含有部分Orip中的FR序列)GGT GCC ATT GCCGCC CCG ACT GCA TCT GCPrimer233’-引物(含有Xba I酶切位點(diǎn))TTT TCT AGA CTT CTGCTT CAT CCC CGT G應(yīng)用兩次疊加PCR技術(shù)(方法同前)將EB病毒Orip中的FR序列和mini-TK啟動(dòng)子產(chǎn)生融合啟動(dòng)子，將其融合啟動(dòng)子PCR片段應(yīng)用Xho I及Xba I雙酶切插入pbluescript II KS(+)載體(購(gòu)于美國(guó)ATCC公司)Xho I及Xba I位點(diǎn)中(方法參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)。將該片段進(jìn)行DNA測(cè)序，其融合啟動(dòng)子序列完全正確，記為CHEB-FRTK。
例九攜帶內(nèi)皮抑素或血管生成抑素的EB病毒順式作用元件控制E1A及E1B表達(dá)的減毒增殖腺病毒載體的構(gòu)建。
pXC.1載體購(gòu)于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。在該載體中552bp處創(chuàng)立一個(gè)新的、唯一的Age I酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于E1A起始密碼前12bp，其方法采用定位突變雙次PCR技術(shù)(方法參見(jiàn)前述文獻(xiàn)1)。其引物分別為primer245’-引物(含有EcoR I酶切位點(diǎn))TTC AAG AAT TCT CATGTT TGprimer253’-引物(插入一個(gè)A，從而產(chǎn)生一個(gè)Age I酶切位點(diǎn))CAG TCA CCG GTG TCG GAG Cprimer265’-引物(插入一個(gè)T，從而產(chǎn)生一個(gè)Age I酶切位點(diǎn))GCT CCG ACA CCG GTG ACT GA
primer273’-引物(含有Xba I酶切位點(diǎn))TTC TCT AGA CAC AGG TGATG采用定位突變雙次PCR技術(shù)，PCR產(chǎn)物片段插入pGEM-T-easy載體中(方法參見(jiàn)Promega公司操作說(shuō)明書(shū))，命名為pGEM-T-E1a。將該片段進(jìn)行DNA測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果顯示在pXC.1質(zhì)粒bp552位點(diǎn)中插入T，從而產(chǎn)生一個(gè)新的Age I酶切位點(diǎn)，其它序列與pXC.1相同。應(yīng)用EcoR I與Xba I雙酶切pGEM-T-E1A及pXC.1質(zhì)粒，將pGEM-T-E1A中切出片段插入pXC.1質(zhì)粒中EcoR I及BamH I位點(diǎn)中，從而使pXC.1中552插入一個(gè)T，從而產(chǎn)生一個(gè)Age I酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于E1A起始密碼前12bp，將該質(zhì)粒命名為pXC.1-Age I。
CHEB分別用Age I酶切，其酶切片段分別插入pXC-Age I質(zhì)粒中Age I酶切位點(diǎn)中，分別應(yīng)用引物24及19進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)出2050bp，這表明EB病毒Orip中的family of 30bp repeats聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子已正向插入pXC-Age I質(zhì)粒Age I位點(diǎn)，即腺病毒5型E1A起始密碼子上游區(qū)12bp處，命名為pXC-FRSVE1A。為進(jìn)一步證實(shí)EB病毒Orip中的family of 30bp repeats聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子已正向插入pXC-Age I質(zhì)粒Age I位點(diǎn)，本研究將pXC-FRSVE1A載體應(yīng)用EcoR I加X(jué)ba I作雙酶切，回收2823bp片段，插入pBluescript II SK載體EcoR I及Xba I酶切位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果證實(shí)EB病毒Orip中的family of 30bp repeats聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子已正向插入pXC-Age I質(zhì)粒Age I位點(diǎn)，序列如下GAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCAC
AGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCGGGCCCCCATTTCCCCTCCCTTCCAGCTCTCTGCCCCTTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGGAGTTTGTGACGTGGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAGTAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGCAAGTGTGGCGGAACACATGTAAGCGACGGATGTGGCAAAAGTGACGTTTTTGGTGTGCGCCGGTGTACACAGGAAGTGACAATTTTCGCGCGGTTTTAGGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAGAGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGCGCGTAATATTTGTCTAGGGCCGCGGGGACTTTGACCGTTTACGTGGAGACTCGCCCAGGTGTTTTTCTCAGGTGTTTTCCGCGTTCCGGGTCAAAGTTGGCGTTTTATTATTATAGTCAGCTGACGTGTAGTGTATTTATACCCGGTGAGTTCCTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGTAGAGTTTTCTCCTCCGAGCCGCTCCGACACCGGTGCATGCAGGAAAAGGACAAGCAGCGAAAATTCACGCCCCCTTGGGAGGTGGCGGCATATGCAAAGGATAGCACTCCCACTCTACTACTGGGTATCATATGCTGACTGTATATGCATGAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATAT
ACTACCCTAATCTCTATTAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCATGGCAACATTAGCCCACCGTGCTCTCAGCGACCTCGTGAATATGAGGACCAACAACCCTGTGCTTGGCGCTCAGGCGCAAGTGTGTGTAATTTGTCCTCCAGATCGCAGCAATCGCGCCCCTATCTTGGCCCGCCCACCTACTTATGCAGGTATTCCCCGGGGTGCCATTGATCTGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTACCGGTGACTGAAAATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGT
GATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTpXC.1載體購(gòu)于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。在該載體中1686bp處創(chuàng)立多個(gè)酶切位點(diǎn)，包括Bgl II、BamH I、Xho I及Xba I，該酶切位點(diǎn)位于E1B轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)與起始密碼之間，其方法采用定位突變雙次PCR技術(shù)(方法參見(jiàn)上述文獻(xiàn)1)。其引物分別為primer285’-引物(含有Hind III及Hpa I酶切位點(diǎn))TTT TGCAAG CTT GTT AAC GCC TTT GTT TGC TGAprimer293’-引物(產(chǎn)生四個(gè)酶切位點(diǎn))CTC GAG GGA TCC AGA TCTGCG CAT TAT ATA CCC TTT AAGprimer305’-引物(產(chǎn)生四個(gè)酶切位點(diǎn))AGA TCT GGA TCC CTC GAGTGA TCT AGA GGG CTA ATC TTG GTT ACA TCprimer313’-引物(含有Kpa I酶切位點(diǎn))CCA GAA AAT CCA GCAGGT AAC采用定位突變雙次PCR技術(shù)，PCR產(chǎn)物片段經(jīng)Hind III和Kpn I酶切，插入pUC19載體中Hind III和Kpn I酶切點(diǎn)，pUC19購(gòu)于美國(guó)ATCC公司，命名為pUC-E1B。將該片段進(jìn)行DNA測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果顯示在E1b轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)中插入Bgl II、BamH I、Xho I及Xba I酶切位點(diǎn)，其它序列與pXC.1相同。
將CHEB-FRTK用Xho I和Xba I雙酶切，其片段插入pUC-E1B中XhoI和XbaI酶切位點(diǎn)，即在E1B轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)中正向插入EB病毒Orip中的family of 30bp repeats聯(lián)合mini-TK啟動(dòng)子，命名pUC-E1B-FRTK，應(yīng)用引物28及23進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)出1159bp，這表明EB病毒Orip中的FR聯(lián)合mini-TK啟動(dòng)子已正向插入pUC質(zhì)粒Xho I和XbaI位點(diǎn)。其測(cè)序結(jié)果如下GTTAACGCCTTTGTTTGCTGAATGAGTTGATGTAAGTTTAATAAAGGGTGAGATAATGTTTAACTTGCATGGCGTGTTAAATGGGGCGGGGCTTAAAGGGTATATAATGCGCAGATCTGGATCCCTCGAGGCATGCAGGAAAAGGACAAGCAGCGAAAATTCACGCCCCCTTGGGAGGTGGCGGCATATGCAAAGGATAGCACTCCCACTCTACTACTGGGTATCATATGCTGACTGTATATGCATGAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCTAATCTCTATTAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCATGGCAACATTAGCCCACCGTGCTCTCAGCGACCTCGTGAATATGAGGACCAACAACCCTGTGCTTGGCGCTCAGGCGCAAGTGTGTGTAATTTGTCCTCCAGATCGCAGCAATCGCGCCCCTATCTTGGCCCGCCCACCTACTTATGCAGGTATTCCCCGGGGTGCCATTGCCGCCCCGACTGCATC
TGCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGGGGATGAAGCAGAAGTCTAGAGGGCTAATCTTGGTTACATCTGACCTCATGGAGGCTTGGGAGTGTTTGGAAGATTTTTCTGCTGTGCGTAACTTGCTGGAACAGAGCTCTAACAGTACCTCTTGGTTTTGGAGGTTTCTGTGGGGCTCATCCCAGGCAAAGTTAGTCTGCAGAATTAAGGAGGATTACAAGTGGGAATTTGAAGAGCTTTTGAAATCCTGTGGTGAGCTGTTTGATTCTTTGAATCTGGGTCACCAGGCGCTTTTCCAAGAGAAGGTCATCAAGACTTTGGATTTTTCCACACCGGGGCGCGCTGCGGCTGCTGTTGCTTTTTTGAGTTTTATAAAGGATAAATGGAGCGAAGAAACCCATCTGAGCGGGGGGTACCTG應(yīng)用Bgl II分別酶切pCA13-human endostatin和pCA13-humanangiostatin，分別回收1237bp(含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40poly A加尾信號(hào))及1758bp(人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、人血管生成抑制及SV40 poly A加尾信號(hào))，將其插入pUC-E1B-FRTK中Bgl II酶切位點(diǎn)，應(yīng)用PCR技術(shù)分別驗(yàn)證其插入的正反方向其Bgl II上游引物primer32GTT AAC GCC TTT GTT TGC TGA分別與人內(nèi)皮抑素5’及3’-primer進(jìn)行擴(kuò)增primer12人內(nèi)皮抑素5’-primer(位于M-成瘤蛋白信號(hào)肽及人內(nèi)皮抑素基因中110-131bp)TCC ACC TGG TTG CGC TCA ACA Gprimer13人內(nèi)皮抑素3’-primer(位于M-成瘤蛋白信號(hào)肽及人內(nèi)皮抑素基因中577-600bp)AGC ACG ATG TAG GCG TGA TGG C
分別與人血管生成抑素5’及3’-primer進(jìn)行擴(kuò)增primer14人血管生成抑素5’-primer(位于人血管生成抑素11-32bp)ATG GAA CAT AAG GAA GTG GTT Cprimer15人血管生成抑素3’-primer(位于人血管生成抑素823-842bp)AGG AGT CAC AGG ACG GTA TC其primer32與primer13能擴(kuò)增到1122bp，表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40 polyA加尾信號(hào)正向插入pUC-E1B-FRTK Bgl II酶切位點(diǎn)，命名為pUC-E1B-FRTK-endostatin1。其primer32與primer12能擴(kuò)增到818bp，表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40 polyA加尾信號(hào)反向插入pUC-E1B-FRTK Bgl II酶切位點(diǎn)。命名為pUC-E1B-FRTK-endostatin2。
其primer32與primer15能擴(kuò)增到1364bp，表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40poly A加尾信號(hào)正向插入pUC-E1B-FRTK Bgl II酶切位點(diǎn)，命名為pUC-E1B-FRTK-angiostatin1。其primer32與primer14能擴(kuò)增到1440bp，表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信號(hào)反向插入pUC-E1B-FRTKBgl II酶切位點(diǎn)，命名為pUC-E1B-FRTK-angiostatin2。
應(yīng)用Hpa I和Kpn I雙酶切pUC-E1B-FRTK-endostatin1、pUC-E1B-FRTK-endostatin2、pUC-E1B-FRTK-angiostatin1及pUC-E1B-FRTK-angiostatin2，回收片段，分別插入pXC-FRSVE1A中Hpa I和Kpn I酶切位點(diǎn)，分別命名為pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin1、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin2、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angiostatin1及pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angiostatin2。
例十?dāng)y帶內(nèi)皮抑素或血管生成抑素的EB病毒順式作用元件控制E1A及E1B表達(dá)的減毒增殖腺病毒的重組。
293細(xì)胞株購(gòu)于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞而成，它含有及表達(dá)5型腺病毒E1區(qū)，腺病毒DNA對(duì)其具有高轉(zhuǎn)染率。將含有5型腺病毒左臂的質(zhì)粒聯(lián)合含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過(guò)同源重組可產(chǎn)生具有感染力的腺病毒。我們將pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin1、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin2、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angiostatin1及pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angiostatin2與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHG10通過(guò)Lipofectamine共轉(zhuǎn)染至293細(xì)株，其具體方法參見(jiàn)GIBCO BRL公司的操作說(shuō)明。PBHG10購(gòu)于加拿大Microbix BiosystemsInc.(Ontario)，含有5型腺病毒右臂，但缺失E3區(qū)。共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過(guò)三次病毒空斑純化，即得E1A及E1B受EB病毒順式作用元件Orip FR聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子及Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動(dòng)子控制的腺病毒，并攜帶人內(nèi)皮抑素或血管生成抑素，分別命名為EBV FRSVEIA-FRTKE1B-endostatin1、EBV FRSVEIA-FRTKE1B-endostatin2、EBV FRSVEIA-FRTKE1B-angiostatin1及FRSVEIA-FRTKE1B-angiostatin2，分別記為CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin2、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2。
由上述方法構(gòu)建的重組病毒的列表如下含Ad5右病毒 名稱 含Ad5左臂質(zhì)粒臂質(zhì)粒EBV FRSVEIA-FRTK CNHKEBV- pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-PBHG10E1B-endostatin1 endostatin1 endostatin1EBV FRSVEIA-FRTK CNHKEBV- pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-PBHG10E1B-endostatin2 endostatin2 endostatin2EBV FRSVEIA-FRTK CNHKEBV- PXC-FRSVE1A-FRTKE1B-PBHG10E1B-angiostatin1 angiostatin1 angiostatin1EBV FRSVEIA-FRTK CNHKEBV- PXC-FRSVE1A-FRTKE1B-PBHG10E1B-angiostatin2 angiostatin2 angiostatin2腺病毒在293細(xì)胞中大量繁殖，應(yīng)用氯化銫梯度離心的方法大量純化腺病毒(具體方法參見(jiàn)前述文獻(xiàn)2出版)。EBV FRSVEIA-FRTKE1B-endostatin1(CNHKEBV-endostatin1)為5型腺病毒，在E1A及E1B轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間分別插入EB病毒順式作用元件Orip FR聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子及Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動(dòng)子，并在E1A終止密碼子后與Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動(dòng)子上游區(qū)之間新建一個(gè)Bgl II酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)中正向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號(hào)基因序列，同時(shí)伴有28133-30818bp(E3區(qū)部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。EBV FRSVEIA-FRTK E1B-endostatin2(CNHKEBV-endostatin2)為5型腺病毒，在E1A及E1B轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間分別插入EB病毒順式作用元件Orip FR聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子及Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動(dòng)子，并在E1A終止密碼子后與Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動(dòng)子上游區(qū)之間新建一個(gè)Bgl II酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)中反向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40poly A加尾信號(hào)基因序列，同時(shí)伴有28133-30818bp(E3區(qū)部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
EBV FRSVEIA-FRTK E1B-angiostatin1(CNHKEBV-angiostatin1)為5型腺病毒，在E1A及E1B轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間分別插入EB病毒順式作用元件Orip FR聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子及OripFR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動(dòng)子，并在E1A終止密碼子后與Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動(dòng)子上游區(qū)之間新建一個(gè)Bgl II酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)中正向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信號(hào)基因序列，同時(shí)伴有28133-30818bp(E3區(qū)部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。EBV FRSVEIA-FRTK E1B-angiostatin2(CNHKEBV-angiostatin2)為5型腺病毒，在E1A及E1B轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間分別插入EB病毒順式作用元件Orip FR聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子及Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動(dòng)子，并在E1A終止密碼子后與Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動(dòng)子上游區(qū)之間新建一個(gè)Bgl II酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)中反向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動(dòng)子(-299--+72)、含有人血管生成抑素基因及SV40poly A加尾信號(hào)基因序列，同時(shí)伴有28133-30818bp(E3區(qū)部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
例十一攜帶人內(nèi)皮抑素或人血管生成抑素的EB病毒順式作用元件控制E1A及E1B表達(dá)的減毒增殖腺病毒的體外在EB感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞增殖、復(fù)制及高效表達(dá)人內(nèi)皮抑素或人血管生成抑素因子并特異性殺滅腫瘤細(xì)胞。
將CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2分別感染EB病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞株Jijoye、293及正常人成纖維細(xì)胞，細(xì)胞按2×105/孔接種6孔板，分別感染重組腺病毒CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-angiostatin1、CNHKEBV-angiostatin2及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小時(shí)后應(yīng)用293細(xì)胞株測(cè)定其病毒滴度，具體方法參見(jiàn)前述文獻(xiàn)2，結(jié)果為正常成纖維細(xì)293 Jijoye胞野生型5型腺1×1057×1045×104病毒CNHKEBV-1×1054×1053×10endostatin1CNHKEBV-1×1054×1054×10endostatin2
CNHKEBV-1×1052.5×1052×10angiostatin1CNHKEBV-1×1052.5×1052×102angiostatin1將感染EB病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞株Jijoye及正常人成纖維細(xì)胞分別感染重組腺病毒CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin2、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2，MOI為1，37℃孵育1小時(shí)，感染后7天收集細(xì)胞，應(yīng)用QIAamp DNA Bloodmini kit(德國(guó)QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法參見(jiàn)QIAGEN公司操作說(shuō)明。應(yīng)用Nhe I和Xho I雙酶切，用0.8％的瓊脂糖電泳，將其轉(zhuǎn)至尼龍膜，用32P標(biāo)記人5型腺病毒1178bp Bst XI加X(jué)ho I片段(位于腺病毒nt4611-5789)，進(jìn)行souther blot雜交，以pXC.1作為病毒拷貝數(shù)對(duì)照(方法參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)，CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin2、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2在Jijoye及正常人成纖維細(xì)胞的每個(gè)細(xì)胞病毒拷貝數(shù)分別為5×104、5×104、4×104、4×104及＜10、＜10、＜10、＜10。將上述CNHKEBV-endostatin1及CNHKEBV-endostatin2提取的DNA分別應(yīng)用Bgl II酶切，用1％的瓊脂糖電泳，將其轉(zhuǎn)至尼龍膜，用32P分別標(biāo)記人內(nèi)皮抑素cDNA片段(EcoR I與XbaI雙酶切pCA13-human endostatin，回收637bp)作為探針，進(jìn)行souther blot雜交，以pCA13-human endostatin作為病毒拷貝數(shù)對(duì)照(方法參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)，CNHKEBV-endostatin1及CNHKEBV-endostatin2在Jijoye及正常人成纖維細(xì)胞的每個(gè)細(xì)胞病毒拷貝數(shù)分別為5×104、5×104及＜10、＜10。
將上述CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2提取的DNA分別應(yīng)用Bgl II酶切，用1％的瓊脂糖電泳，將其轉(zhuǎn)至尼龍膜，用32P分別標(biāo)記人血管生成抑素cDNA片段(EcoR I與Xba I雙酶切pCA13-human angiostatin，回收1168bp)作為探針，進(jìn)行southerblot雜交，以pCA13-human angiostatin作為病毒拷貝數(shù)對(duì)照(方法參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)，CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2在Jijoye及正常人成纖維細(xì)胞的每個(gè)細(xì)胞病毒拷貝數(shù)分別為4×104、4×104及＜10、＜10。
例十一攜帶人內(nèi)皮抑素或人血管生成抑素的EB病毒順式作用元件控制E1A及E1B表達(dá)的減毒增殖腺病毒的在SCID小鼠體內(nèi)治療EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞移植瘤將4-5周齡的SCID小鼠皮下接種EB病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞株Jijoye細(xì)胞5×107，兩周后給予5×108pfu增殖型重組腺病毒CNHK101治療或用相同劑量的對(duì)照腺病毒Ad5-Lac Z，其未治療組及對(duì)照腺病毒治療組4周后腫瘤體增加3倍以上，而治療組則腫瘤明顯縮小，部分腫瘤完全消失。
權(quán)利要求
1.一種能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其特征在于將編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列插入腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒基因組中的非增殖必需區(qū)域，該病毒選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，而在正常細(xì)胞內(nèi)不增殖，通過(guò)病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，導(dǎo)致編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列拷貝數(shù)增加，從而血管生成抑制因子基因表達(dá)量增加，該腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒是以下任何一種(1)病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間插入腫瘤細(xì)胞特異性激活的順式作用元件；(2)蛋白功能缺失重組后能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒的構(gòu)建方法，其特征在于(1)將編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列直接插入腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒基因組中的非增殖必需區(qū)域；(2)病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間插入腫瘤細(xì)胞特異性激活的順式作用元件；順式作用元件是EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動(dòng)子或SV40基本啟動(dòng)子；(3)蛋白功能缺失重組后能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒；蛋白功能缺失是腺病毒E1B 55Kda蛋白功能缺失。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其特征在于它由要病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域插入某種腫瘤細(xì)胞特異性激活的順式作用元件構(gòu)成，該種順式作用元件是EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動(dòng)子或SV40基本啟動(dòng)子，病毒增殖必需基因?yàn)椴《驹缙诨颉?br>4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其特征在于所述病毒為腺病毒，該腺病毒增殖必需基因至少含有以下一個(gè)腺病毒的早期表達(dá)基因E1A、E1B、E2、E4。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其特征在于所述病毒是腺病毒時(shí)，該腺病毒E1B55Kda通過(guò)基因點(diǎn)突變、缺失突變及插入突變導(dǎo)致E1B55Kda蛋白功能缺失。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼含有分泌型信號(hào)肽的內(nèi)皮抑素的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其特征在于所述分泌型信號(hào)肽為M-成瘤蛋白信號(hào)肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其特征在于所述分泌型信號(hào)肽為免疫球蛋白K鏈信號(hào)肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血管生成抑素的核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列受啟動(dòng)子控制。
11.根據(jù)權(quán)利要求
10所述的能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其特征在于所述啟動(dòng)子為SV40啟動(dòng)子。
12.根據(jù)權(quán)利要求
10所述的能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其特征在于所述啟動(dòng)子為RSV LTR啟動(dòng)子。
13.根據(jù)權(quán)利要求
10所述的能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其特征在于所述啟動(dòng)子為人巨細(xì)胞病毒IE啟動(dòng)子。
14.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒，其特征在于該病毒與化學(xué)抗腫瘤藥物組成復(fù)合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的能高效表達(dá)血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒的應(yīng)用，其特征在于將該重組病毒用于體外感染腫瘤細(xì)胞，病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及增殖，導(dǎo)致編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列拷貝數(shù)增加及血管生成抑制因子表達(dá)量增加。
專利摘要
本發(fā)明提供一類高效表達(dá)腫瘤血管生成抑制因子的腫瘤細(xì)胞特異性增殖的病毒及其構(gòu)建方法。該病毒選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，而在正常細(xì)胞內(nèi)不增殖，通過(guò)將編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列插入腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖的病毒基因組中的非增殖必需區(qū)域，隨著病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，使編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列拷貝數(shù)增加，從而在腫瘤細(xì)胞高效表達(dá)血管生成抑制因子，抑制腫瘤血管形成，抑制腫瘤形成、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。同時(shí)該病毒能在而且僅限于腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，也能特異性直接殺滅腫瘤細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K45/00GKCN1183250SQ00127680
公開(kāi)日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2000年12月1日
發(fā)明者錢其軍, 車小燕, 岑信棠, 吳孟超 申請(qǐng)人:衛(wèi)健生物科技有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan