專利名稱:用于疫苗接種的組合物的制作方法
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于經(jīng)皮遞送至少一種免疫原的新型組合物和包括這些組合物的構(gòu)建體，制備該組合物的方法以及產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方法，治療或預(yù)防疾病狀態(tài)的方法和免疫接種的方法以及免疫原在所述組合物中的用途。
發(fā)明背景對很多藥物而言，諸如吸煙戒斷治療中的尼古丁、心絞痛治療中的異山梨醇或硝酸甘油以及激素代替治療中的雌二醇，經(jīng)皮遞送(TDD)是眾所周知的、非常經(jīng)濟的、重要且引入注目的遞送途徑。經(jīng)皮遞送典型地包括針對藥物通過角質(zhì)層(horny layer)的經(jīng)皮通道的藥物遞送，其經(jīng)過皮膚的表皮和真皮或經(jīng)過粘膜而進入患者的體循環(huán)。經(jīng)皮遞送可通過將藥物暴露于患者的皮膚或粘膜來實施，以便持續(xù)釋放藥物。實際使用時，可將包括藥物的TDD貼片粘附于皮膚表面。TDD遞送還可通過將藥物以乳膏劑、軟膏劑、洗劑等施用于皮膚來實施。
經(jīng)皮遞送包括使用針對藥物的載體，該載體優(yōu)選但非必須地具有皮膚粘附特性。大量粘合劑系統(tǒng)(也被稱為壓力敏感粘合劑系統(tǒng))已被廣泛地使用，諸如硅酮，聚氨基甲酸酯，丙烯酸酯和聚異丁烯粘合劑。這些粘合劑一般是非吸收性的，其具有高度堵塞性和高度皮膚粘合性，由此可導(dǎo)致患者不順應(yīng)性。具有水吸收能力的其它粘合劑系統(tǒng)(其具有更佳的患者耐受性)，是諸如水膠體粘合劑，水凝膠粘合劑，交聯(lián)的水凝膠粘合劑等。
美國專利序號4 367 732公開了一種水膠體粘合劑，其包括作為基質(zhì)分子的苯乙烯-鏈烯烴-苯乙烯嵌段共聚物，其與多種樹脂增粘劑和增塑劑混合，分散于水膠體中，以便用于皮膚屏障，其適用于例如繃帶的目的。美國專利序號6 153 215公開了水膠體粘合劑用于將藥物遞送至皮膚或傷口的用途。
英國專利申請序號2 115 431公開了一種親水性彈性體壓力敏感粘合劑，其包括至少一種水不溶性、交聯(lián)的聚合物作為基質(zhì)和附加的增塑劑。該粘合劑可用于多種方面，諸如繃帶和造口裝置。WO 93/00076公開了一種用于藥物的載體系統(tǒng)，其包括球狀顆粒和任選的一種或多種生物粘合劑聚合物。
美國專利序號5 410 016公開了聚合的和交聯(lián)的大分子的水凝膠，其包括具有可降解的單體或寡聚體延伸的親水寡聚體，其可用于例如控釋藥物或形成粘合。美國專利序號6 410 645公開了形成凝膠的大分子，其包括至少四個共價連接的聚合嵌段。該大分子可交聯(lián)而在組織表面上形成凝膠，其可用于多種醫(yī)學(xué)用途，包括藥物遞送和組織覆蓋。
迄今為止，本領(lǐng)域中極少有公開經(jīng)皮遞送用于免疫接種。而且，藥物的經(jīng)皮遞送會受到多種不同參數(shù)的影響，其中包括要被遞送的分子的大小。經(jīng)皮遞送通常僅用于大小小于1納米的非常小的分子。例如，分子大小為約1.5-2納米的胰島素已被報道非常難于透過皮膚膜。
如果能夠提供經(jīng)皮免疫接種途徑，將為非侵入性藥物施用(例如提供肌內(nèi)、皮內(nèi)或皮下注射)提供重要的可選方案。所述注射具有多種缺陷。其可導(dǎo)致應(yīng)激、疼痛和刺激，尤其是在重復(fù)注射的情況下，包括感染的危險-或耐受性差。此外，未經(jīng)訓(xùn)練的或無執(zhí)照人員無法實施注射。此外，當向管理機構(gòu)申請注冊疫苗時，對于用于侵入性施用的疫苗來說，關(guān)于無副作用所需要的描述文件明顯地多于用于經(jīng)皮施用的疫苗。
本文中的疫苗接種是這樣的過程，通過該過程，將疫苗施用于個體，可在處于非病原性狀態(tài)下的所述個體中導(dǎo)致免疫反應(yīng)。
迄今為止已經(jīng)公開的經(jīng)皮免疫接種途徑優(yōu)選地包括如下步驟，其中(i)采用機械處理(刮除)去除皮膚的上層部分，即角質(zhì)層和(ii)在施用疫苗前使皮膚濕潤或可選地(iii)將疫苗吸附在紗布墊中，并用普通膏劑施用于皮膚，這些技術(shù)被進一步公開于例如“經(jīng)皮免疫接種”，Glenn GM，Kenney RT.New Generation Vaccines，3rd Ed.Vol.(待出版)和“and inAdvances in vaccine deliverytranscutaneous immunization”，Glenn GM，Scharton-Kersten T，和Alving CR.Expert Opinion in Investigational Drugs.Vol.8(6)(1999)797-805，WO99/43350和US 2001/0006645 A1中。
WO 02/074325公開了一種用于經(jīng)皮免疫接種的貼片，其包括壓力敏感粘合劑層，置于壓力敏感粘合劑層的和/或摻入壓力敏感粘合劑層的免疫原性制劑的至少一種免疫學(xué)活性蛋白質(zhì)和穩(wěn)定劑。該制劑可包括具有佐劑活性的蛋白質(zhì)。
WO 99/11247公開了一種用于經(jīng)皮施用免疫原的組合物，其包括雙相脂質(zhì)載體的混懸物和包埋(inclusion)在雙相脂質(zhì)載體中的免疫原。
WO 00/07621公開了一種佐劑組合物，其包括甾醇和皂苷，其中佐劑的形式為ISCOM。該佐劑組合物適用于經(jīng)皮給藥。
本發(fā)明的一個目的是提供新型組合物和更佳的、更簡便和安全的將包埋的免疫原經(jīng)皮遞送至個體的方法，由此避免與侵入性施用諸如注射相關(guān)的不良作用。
本發(fā)明的其它目的是提供這樣的組合物和方法，其中遞送提供使用遞送系統(tǒng)來完成，所述遞送系統(tǒng)為諸如PCT/DK02/00229中描述的Posintro或例如WO 98/36772，WO 92/06710和WO 98/56420中描述的ISCOMs。
已令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，使用根據(jù)本發(fā)明的包埋載體和原理可介導(dǎo)增強的免疫原遞送，且可作為免疫原的增效因子對沉于粘膜、角質(zhì)層下或內(nèi)皮細胞膜下的免疫活性細胞(通常被稱為專門的抗原呈遞細胞)發(fā)揮作用。由于施用的遞送系統(tǒng)和/或佐劑可假定其微粒形狀的平均大小為約5-50，例如最常見為10-40納米(nm)或更大，故下述發(fā)現(xiàn)是意料之外的，即所述相對較大的顆粒能夠表現(xiàn)出該增強特性。根據(jù)關(guān)于藥物、激素和蛋白質(zhì)遞送的發(fā)現(xiàn)，一般可以預(yù)期大于1或數(shù)納米的化合物不能透過所述細胞膜。
發(fā)明概述本發(fā)明第一方面涉及用于將至少一種免疫原經(jīng)皮遞送于個體的組合物，其包括a)所述至少一種免疫原b)包埋載體和c)PosIntro或ISCOM形式的免疫原遞送系統(tǒng)。
在本發(fā)明中，術(shù)語經(jīng)皮遞送包括經(jīng)過皮膚表面以及經(jīng)過粘膜組織的遞送。
本發(fā)明在第二方面涉及用于將至少一種免疫原經(jīng)皮遞送于個體的組合物，其包括a)所述至少一種免疫原b)壓力敏感粘合劑形式的包埋載體和c)包括至少一種皂苷和至少一種甾醇的免疫原遞送系統(tǒng)。
本發(fā)明所使用的術(shù)語包埋或包埋載體是指皮膚或粘膜的任何覆蓋層，該覆蓋層在倒置Paddington杯(British Pharmacopoeia 1993，附錄1996，1943頁)的實驗室檢測中，將水與該覆蓋層接觸，在37℃和環(huán)境相對濕度為15％時，能使水蒸發(fā)傳送小于15000g/m2×24小時。實際應(yīng)用中，將使用非常低的值，例如小于12.000g/m2×24小時，優(yōu)選小于10.000g/m2×24小時，更優(yōu)選小于6.000g/m2×24小時，或小于3.000g/m2×24小時，甚或更為優(yōu)選小于1.000g/m2×24小時，或小于800g/m2×24小時，小于500g/m2×24小時，小于300g/m2×24小時或小于200g/m2×24小時。完全包埋是指通過所述時間測定的值小于100g/m2×24小時。
包埋可用任何形式的覆蓋層(例如輕微或不能透過水的膜或箔材料)來實現(xiàn)。當用粘合劑將所述覆蓋層固定于皮膚時，可達到最佳性能。
優(yōu)選的粘合劑能夠吸收水分并將其保持在基質(zhì)中。這使得材料具有增加皮膚或粘膜中水分含量的能力。皮膚中水分水平的升高將增加藥物透過的能力。這在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)得到描述，參見例如Henning GjelstrupKristensenAlmen farmaci，Institut for Farmaci，Danmarks FarmaceutiskeHjskole，3.udgave(2000)，page 332-333。而在粘合劑制劑中進一步加入增強劑可增加藥物的透過率。在粘膜遞送的情況下，增強劑可不發(fā)揮任何作用，因為內(nèi)皮層的透過阻力比皮膚中角質(zhì)層的小。另一方面，即使是對于粘膜遞送，也可適宜地加入增強劑。
可使用包括本發(fā)明的組合物的大量構(gòu)建體。如附圖中所述，其中
圖1顯示了簡單的單片系統(tǒng)，其中疫苗被局部地或均勻地在載體中施用，此時載體是壓力敏感粘合劑(2)，和其中所述粘合劑被層壓至位于外面一側(cè)的覆蓋膜(1)和位于對側(cè)的剝離襯層(3)。
圖2顯示了與圖1非常相似的貯器系統(tǒng)，但其中包括疫苗的載體(2)被粘合劑邊(4)所環(huán)繞。(1)是覆蓋膜而(3)是剝離襯層。
圖3顯示了與圖1的原理相同的層壓控制系統(tǒng)，與之不同的是將薄控釋屏蔽層(5)(優(yōu)選多孔和壓力敏感粘合劑)置于剝離襯層(3)和載體(2)之間。
圖4顯示了圖2和圖3之間的混合形式。在該系統(tǒng)中，用于疫苗的載體(2)通常應(yīng)是液體(水)。
圖5顯示了一種系統(tǒng)，其中包括疫苗的載體(2)與意在單獨用于將產(chǎn)品固定于人類組織的粘合劑(6)分離。通過輕壓剝離襯層(3)的中心凹入?yún)^(qū)，可在從剝離襯層上除去以及隨后使用之前即刻將載體(2)施加在粘合劑部分上。(1)是覆蓋膜。
圖6顯示了水貯器系統(tǒng)。其中，包括疫苗的載體(2)是凍干的墊片，該墊片通過固定于剝離襯層(3)上而與支持性粘合劑(6)分離。所述襯層具有可破裂的位于中心的薄弱點(虛線)。此外，含水(7)的容器(8)被接合至或附著于剝離襯層(3)的上表面。通過擠壓該構(gòu)建體，在第一步中，載體將粘附于粘合劑(6)，而隨著第二步中襯片中的薄弱點(虛線)(3)的破裂，使得水進入具有凍干載體的隔室，通過這樣的過程將載體轉(zhuǎn)變?yōu)槟z。
圖7顯示了原理與圖6相同的等效形式，與之不同的是包括水的隔室(7和8)被密封鄰接于仍具有薄弱剝離襯層(3)的載體(2)而用于將水導(dǎo)入載體中。
圖8進一步顯示了原理與圖6相同的等效形式，其中載體(2)被固定于支持粘合劑(6)上。膜(10)被密閉至剝離襯層(3)和包括水的隔室(8)的外膜，且將隔室與載體分開，形成了薄弱區(qū)而用于通過位于虛線處的外部壓力來導(dǎo)致破裂。膜和剝離襯層(3)可以經(jīng)過剝離襯層凹入?yún)^(qū)的同一層。
圖9顯示了用于上述圖1至5中原理任一項的雙組分包裝。一個組分由膜(1)和在剝離襯層(3)上的粘合劑支持層(6)組成，而第二組分由囊袋(10)中的載體(2)組成。
圖10顯示了原理等效于圖9的雙組分，其中含水構(gòu)建體如圖6至圖8。此時，囊袋材料(10)被密封在一起，在載體和含水容器之間形成如虛線所示的薄弱區(qū)，以便引導(dǎo)來自外部壓力的破裂和水遞送。
第三方面，本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明的組合物的方法，包括通過分散或浸在載體溶液中或通過施加于其表面，而將免疫原和免疫原遞送系統(tǒng)(其任選地包括在疫苗制劑中)導(dǎo)入包埋載體的基質(zhì)中或其表面的步驟，和任選地對組合物滅菌和/或干燥和/或密封包裝。
第四方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的組合物的構(gòu)建體。
在其它方面中，本發(fā)明提供了在個體中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方法，治療或預(yù)防個體中疾病狀態(tài)的方法以及免疫接種個體的方法，其中將本發(fā)明的組合物施用于所述個體。
最后，本發(fā)明提供了免疫原在制備用于所述免疫原經(jīng)皮遞送的組合物中的用途，所述組合物包括包埋載體。
發(fā)明詳述本發(fā)明的組合物中的包埋載體優(yōu)選為壓力敏感粘合劑而更優(yōu)選為吸收性壓力敏感粘合劑。所述粘合劑尤其見于但不限于水膠體粘合劑、水凝膠粘合劑或交聯(lián)的水凝膠。對這些粘合劑系統(tǒng)的進一步描述如下。
水膠體粘合劑水膠體粘合劑是一類在醫(yī)療裝置中被廣泛用于固定于人體的粘合劑。粘合劑是一種兩相物質(zhì)，其由粘合劑基質(zhì)組成，其中包埋了所謂水膠體的親水聚合物的吸附性顆粒。其原則非常靈活，這是因為顆粒水膠體的量和類型可根據(jù)預(yù)期應(yīng)用而進行定制，基底粘合劑可具有攻擊性或可易于除去，并可進一步負載適宜的增強劑。還有大量多種類型的粘合劑原料可用于水膠體粘合劑。所述粘合劑原料可以是化合物或混合物，其包括本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的聚丙烯酸酯、聚異丁烯、含有苯乙烯末端嵌段的嵌段共聚物、聚氨基甲酸酯、聚乙酸乙烯酯等。
水凝膠粘合劑與水膠體粘合劑相反，水凝膠粘合劑是幾乎完全的潮濕敏感性。這意味著在該粘合劑特性改變下，該粘合劑將持續(xù)吸收環(huán)境中存在的水分。具體而言，起始吸收將導(dǎo)致與潮濕表面的良好粘附。這對于其應(yīng)用的多種目的來說是有害的。然而，對于單一應(yīng)用和不需要攜帶重量而言，該粘合劑可以是良好的可選方式，即使是在潮濕環(huán)境中。
粘合劑可被分類為傳統(tǒng)粘合劑，其中將常規(guī)的疏水性基質(zhì)變?yōu)橛H水性的。這可通過使用親水聚合物的支架結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)，其確保粘合劑與親水性增塑劑(如多價醇和增粘性親水寡聚物)組合的充分粘合力。此外，在粘合劑中可導(dǎo)入某些物理上或化學(xué)上的交聯(lián)，以改善材料的粘合力。該粘合劑特別適用于粘附在粘膜上。
水凝膠用于藥物遞送的粘合劑的第三個主要類別是基于水凝膠，優(yōu)選但非必須是交聯(lián)的。該類別在某些程度上對應(yīng)于水凝膠粘合劑。然而，本質(zhì)上，水凝膠的增塑劑唯一地或主要地為水，但其還可包括例如多元醇諸如甘油、聚乙二醇和聚丙二醇。而且，分子骨架優(yōu)選是化學(xué)交聯(lián)的。
水凝膠的骨架聚合物可基本上是任何親水聚合物，優(yōu)選所述聚合物可適合于交聯(lián)。優(yōu)選以下類別的聚合物，丙烯酸類如丙烯酸或異丁烯酸鹽、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮的衍生物和其共聚物。然而，聚乙二醇和聚氧乙烯是在交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中通常使用的其它親水聚合物。
水凝膠遞送系統(tǒng)的優(yōu)勢在于經(jīng)皮遞送的化合物的高可溶性，且從水凝膠中導(dǎo)入皮膚中的高含水量可導(dǎo)致經(jīng)皮透過的增加。其在當經(jīng)皮遞送的化合物為親水化合物時應(yīng)被考慮。
在本發(fā)明的一個實施方案中，免疫原和免疫原遞送系統(tǒng)被分布在包埋載體中，且該分布優(yōu)選是均質(zhì)的。這示于圖1中，其顯示了“單片”系統(tǒng)。
在另一實施方案中，免疫原和免疫原遞送系統(tǒng)還可被分布在包埋載體的表面上。這將更加有效，并能導(dǎo)致最大經(jīng)皮遞送，因為包埋將導(dǎo)致皮膚屏障功能的降低且包埋載體表面上的高濃度免疫原和免疫原遞送系統(tǒng)可導(dǎo)致更為瞬時的免疫原遞送。
由于本發(fā)明的組合物必須具有長時間的穩(wěn)定性，故可優(yōu)選將免疫原和免疫原遞送系統(tǒng)與粘合劑材料分離，由此避免組合物中組分的交換。在該實施方案中，還可避免組合物中粘合劑殘留，諸如增塑劑，并避免親水性或疏水性免疫原/抗原擴散到整個粘合劑中。
在可克服穩(wěn)定性問題的該實施方案中，免疫原和免疫原遞送系統(tǒng)可被包埋在非粘合性載體中，例如干燥或凍干的親水聚合物材料或在動物脂樣組合物中，其可能在使用前即被活化。該活化可通過在系統(tǒng)中加入水溶液或其它適宜的溶劑/稀釋劑而發(fā)生。該系統(tǒng)在任何情況下應(yīng)通過覆蓋層，優(yōu)選壓力敏感粘合劑而被固定于皮膚。由此，在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物包括非粘合性包埋載體和用于皮膚固定第二粘合劑，其與所述載體分離。
克服穩(wěn)定性問題的另一方法可以是在疫苗載體和第二粘合劑之間放置屏蔽膜。
該組合物還可包括控速膜，優(yōu)選多孔和壓力敏感性材料，諸如網(wǎng)狀膜、開放網(wǎng)狀物等。屏蔽層可將整個系統(tǒng)與患者皮膚或粘膜分隔，如圖3中所示。
包埋載體或用于皮膚固定第二粘合劑可構(gòu)成為覆蓋物，例如墊片、敷料或貼片，或任何本領(lǐng)域已知的其它常用覆蓋物。
本發(fā)明的組合物還可包括用于經(jīng)皮藥物遞送的增強劑。透過皮膚和粘膜所涉及的增強劑是能夠促進藥物或疫苗透過皮膚或粘膜的轉(zhuǎn)運的化合物類型。對于皮膚而言，與透過相關(guān)的速率決定層是指角質(zhì)層(strateumcorneum)，其是皮膚的最外層。無論藥物或疫苗的靶點是在皮膚本身或是全身，都必須通過該層。這還提示出，當皮膚是選擇的屏障時，將增強劑用于促進透過是尤為重要的。
用于經(jīng)皮藥物遞送的典型增強劑是乙醇、醇胺、磷脂、脂肪酸、表面活性劑和多元醇。某些特別令人感興趣的化合物是低分子量的聚乙二醇、丙二醇、月桂酸、油酸、甲基月桂酸酯、油酸乙酯、N-甲基-吡咯烷酮、己二酸二辛酯和甘油或其低分子量衍生物。對增強劑的需求應(yīng)與所有存在的組分(即粘合劑基質(zhì)或水凝膠和疫苗組分)相適應(yīng)。
而在另一實施方案中，免疫原和免疫原遞送系統(tǒng)彼此分離。
疫苗的施用和免疫接種本發(fā)明文中的免疫接種是這樣的過程，通過該過程將疫苗施用于個體，可在非病原性狀態(tài)下的所述個體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
免疫原和抗原本發(fā)明的組合物可包括若干組分，但總有至少一種免疫原。優(yōu)選地，該免疫原以如下方式進行選擇，即誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)直接針對例如源于病原微生物的一種或多種抗原。然而，免疫反應(yīng)針對的抗原可以是任何非微生物來源；所述抗原的實例是合成抗原，來源于所述個體的抗原或來源于任何物種的抗原。
優(yōu)選地，誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)在所述個體中提供針對病原微生物的保護，所述抗原是所述病原微生物的一部分。優(yōu)選地，誘導(dǎo)的生物保護可通過隨后將所述治療的個體暴露于所述病原微生物而發(fā)揮作用。然而，所述接受免疫接種的個體在施用疫苗之前已經(jīng)感染了所述病原微生物。在該情況下，保護性免疫反應(yīng)可立即具有功能性。
術(shù)語“誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)”意指保護性反應(yīng)，其中所提供的免疫反應(yīng)可以是完全保護，導(dǎo)致所述病原微生物的完全清除，但是包括可以是部分和僅降低所述病原微生物的繁殖。而且，由于術(shù)語“保護”僅涉及降低或消除由所述病原微生物導(dǎo)致的不健康狀態(tài)，即根據(jù)本發(fā)明要治療的病癥和/或要預(yù)防的病癥，故保護可不僅限于完全或部分清除所述病原體。所述作用模式的實例是保護性免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)針對由所述病原微生物在感染所述個體期間產(chǎn)生的病原性組分。所述病原性組分的實例包括(但不限于)細菌毒素例如破傷風毒素。
在本發(fā)明中，免疫原是針對可在個體中引起免疫反應(yīng)組分，或其中所述組分的產(chǎn)品可引起免疫反應(yīng)的組分。為了獲得免疫反應(yīng)，需要在疫苗制劑中包括免疫原。
如本發(fā)明所使用的，抗原是可被免疫反應(yīng)識別的組分，其片段可被免疫反應(yīng)識別的組分，或所述組分的產(chǎn)品或所述組分的產(chǎn)品的片段可被免疫反應(yīng)識別的組分。
本發(fā)明相關(guān)的免疫原或抗原是優(yōu)選來源于與需要根據(jù)本發(fā)明進行治療或預(yù)防的病癥天然相關(guān)的組分的免疫原或抗原。因此，正常情況下細胞中不存在的，或不與要治療的個體的細胞相關(guān)的，以及需要靶向以便治療和預(yù)防特定病癥的免疫原或抗原被認為是關(guān)于特定病癥的免疫原或抗原。
優(yōu)選地，免疫原或抗原是非來源于要被治療的物種的免疫原或抗原。然而，在本發(fā)明特定的實施方案中，外源免疫原或外源抗原可來源于要被治療的物種。在這些實施方案中，免疫原或抗原應(yīng)在正常情況下不由所述個體細胞呈遞或不與之相關(guān)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，免疫原和/或抗原并非來源于人類，以便當將其施用于人類時，免疫原或抗原不會作為自體免疫原而被識別。
在本發(fā)明的一個實施方案中，免疫原和/或抗原包括多肽或肽，例如免疫原和/或抗原可基本上由或由多肽或肽組成。免疫原或抗原還可包括一種以上的不同多肽和/或肽，諸如2種、例如3種、諸如4種、例如5種、諸如6種、例如7種、諸如8種、例如9、諸如10、諸如大于10種不同多肽。
在本發(fā)明的某些實施方案中，免疫原和/或抗原包括或基本上由生物體組成，優(yōu)選是微生物體或部分生物體，優(yōu)選是微生物體，由此免疫原或抗原可包括非常大量的不同多肽，諸如大于100，諸如大于500，諸如大于1000，諸如大于2500。
本發(fā)明中還包括免疫原或抗原可基本上由或由一種或多種多肽和/或肽組成。
為了引發(fā)免疫反應(yīng)或產(chǎn)生免疫反應(yīng)，多肽可被處理為片段，而多肽的片段可以是由免疫反應(yīng)事實上識別的化合物。
根據(jù)本發(fā)明使用的多肽可進一步包括翻譯后修飾，諸如，例如磷酸化、乙?；⒓谆?、糖基化或任何其它翻譯后修飾。具體而言，在本發(fā)明的一個實施方案中，免疫原和/或抗原可包括葡萄糖基化多肽和/或肽。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，免疫原和/或抗原包括脂肽，諸如化學(xué)性連接于脂質(zhì)部分的肽或多肽，例如免疫原和/或抗原可基本上由或由化學(xué)性連接于脂質(zhì)部分的肽或多肽組成。
在本發(fā)明的另一實施方案中，免疫原或抗原包括核酸序列，例如免疫原或抗原可基本上由或由核酸序列組成。免疫原或抗原可包括多于一種不同的核酸序列，諸如2種、例如3種、諸如4種、例如5種、諸如6種、例如7種、諸如8種、例如9、諸如10、例如多于10種不同的核酸序列。在某些實施方案中，免疫原或抗原可基本上由或由一種或多種核酸序列組成。
優(yōu)選地，核酸序列可編碼多肽和/或肽。當核酸序列編碼多肽和/或肽時，優(yōu)選地，多肽和/或肽和/或其片段構(gòu)成被免疫反應(yīng)識別的化合物。
因此，可出現(xiàn)下述情況i)核酸序列被靶向靶細胞ii)核酸序列被靶細胞內(nèi)在化iii)靶細胞中生成多肽和/或肽iv)在細胞表面上呈現(xiàn)多肽和/或肽和/或其片段。
優(yōu)選地，免疫原中所包括的或由免疫原中包括的核酸序列編碼的多肽和/或肽對人體來說是外源性的。優(yōu)選地，抗原中所包括的或由抗原中包括的核酸序列編碼的多肽和/或肽對人體來說是外源性的。
而在本發(fā)明的另一實施方案中，免疫原和/或抗原包括多糖和/或寡糖。多糖和寡糖包括至少兩個單糖，其可以是相同的或不同的。寡糖的經(jīng)驗式為(CH2O)n，大小范圍為三糖(n＝3)至庚糖(n＝7)。本發(fā)明范圍內(nèi)的多糖還可以是分支多糖。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，免疫原或抗原來源于病毒。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，免疫原或抗原來源于細菌。而在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，免疫原或抗原來源于寄生蟲。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，免疫原或抗原來源于真菌。然而，免疫原或抗原還可包括選自病毒、細菌、真菌和寄生蟲的一種或多種免疫原和/或抗原的混合物。
免疫原和/或抗原例如可以是減毒病毒、減毒細菌、減毒真菌或減毒寄生蟲?？蛇x地，免疫原或抗原可以是選自病毒、細菌、真菌和寄生蟲的滅活或被殺死的微生物。其混合物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
減毒例如可以是通過以下方法實現(xiàn)的，在非天然宿主中培養(yǎng)數(shù)代后或在誘變后或通過重組DNA技術(shù)對微生物進行操作后選擇喪失病原性的突變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知其它任何適宜方法也可用于減毒。
微生物的滅活和/或殺死可通過多種方法實現(xiàn)，例如熱滅活，輻射，化學(xué)滅活或本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知其它任何方法。
免疫原或抗原可進一步包括選擇以下的微生物的僅僅一部分病毒、細菌和寄生蟲。例如，所述部分可以是病毒衣殼、病毒顆粒或細菌連接或酵母細胞膜?？蛇x地，免疫原或抗原可僅包括已來源于病毒、細菌、真菌和寄生蟲的一種或多種分子，諸如多肽、肽或核酸序列。
而且，免疫原或抗原可包括分子，例如多肽、肽或核酸序列，其僅包括病毒性、細菌性、真菌性和寄生蟲性來源的多肽、肽或核酸序列的片段。所述分子可包括多于一個片段。所述分子還可以是嵌合的，諸如，其還包括非來源于病毒、細菌、真菌和/或寄生蟲的，或來源于另一病毒、細菌、真菌和/或寄生蟲的片段。
此外，來源于病毒、細菌、真菌和寄生蟲的多肽、肽或核酸序列可以是已被操作的，例如采用重組DNA技術(shù)，諸如為非天然存在分子，而是其衍生物或突變體的多肽、肽或核酸序列。突變體包括如下突變體，其包括根據(jù)分子特性的氨基酸或核酸的置換、缺失和/或添加。
根據(jù)本發(fā)明的病毒例如可選自腺伴隨病毒、腺病毒、鳥傳染性支氣管炎病毒、桿狀病毒、禽痘病毒、猴痘病毒、Avi痘病毒、冠狀病毒、細胞巨化病毒、瘟熱病毒、腸道病毒、EB病毒、貓白血病病毒、黃病毒、口蹄病病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、皰疹種病毒、單純皰疹病毒、流感病毒、HIV-1、HIV-2、HTLV 1、流感A和B病毒、庫京病毒、拉沙熱病毒、LCMV(淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒)、慢病毒、麻疹病毒(Measles)、門戈病毒、麻疹病毒(Morbillivirus)、粘病毒、乳頭瘤病毒、腮腺炎病毒、副流行性感冒、副粘病毒、細小病毒、Poko病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、多瘤腫瘤病毒、偽狂犬病病毒、狂犬病病毒、呼腸病毒、呼吸道合胞病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、鼻病毒、牛疫病毒、輪狀病毒、塞姆利基森林病毒、仙臺病毒、猿猴病毒40、辛德比斯病毒、SV5、蜱生腦炎病毒、披蓋病毒(風疹、黃熱病、登革熱)、常見正痘病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒和皰口腔炎病毒。
優(yōu)選地，病毒選自流感病毒、皰疹病毒、麻疹病毒(Morbiliviruse)、粘液和副粘液病毒、黃病毒、乳頭瘤病毒和肝炎病毒。
根據(jù)本發(fā)明的細菌例如可選自氧化木糖無色桿菌、醋酸鈣不動桿菌，優(yōu)選硝酸鹽陰性不動桿菌、溶血性不動桿菌、產(chǎn)堿性不動桿菌和魯氏不動桿菌、以色列放線菌、親水性氣單胞菌、產(chǎn)堿桿菌屬，優(yōu)選糞產(chǎn)堿桿菌、臭味產(chǎn)堿菌、反硝化產(chǎn)堿菌、亞利桑那沙門菌、炭疽桿菌、蠟樣芽胞桿菌、脆弱擬桿菌、產(chǎn)黑素擬桿菌、百日咳桿菌、博氏疏螺旋體、回歸熱螺旋體、布魯氏桿菌屬，優(yōu)選流產(chǎn)布魯氏桿菌、豬流產(chǎn)布氏桿菌、羊流產(chǎn)布氏桿菌、犬布魯氏菌、肉芽腫鞘桿菌、胚胎彎曲桿菌腸某種、胚胎彎曲桿菌空腸亞種、衣原體屬，優(yōu)選鸚鵡熱衣原體、沙眼衣原體、青紫色素桿菌、檸檬酸細菌屬，優(yōu)選弗羅因德氏枸櫞酸桿菌、差異檸檬酸桿菌、肉毒梭狀芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌、艱難梭狀芽胞桿菌、破傷風梭狀芽胞桿菌白喉棒狀桿菌、棒狀桿菌，優(yōu)選潰瘍棒狀桿菌、溶血棒狀桿菌和假結(jié)核棒狀桿菌、伯納特氏立克次氏體、遲鈍愛德華菌、嚙蝕艾肯氏菌、腸道細菌屬，優(yōu)選陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、哈夫尼亞腸桿菌(也稱為蜂房哈夫尼菌)和聚團腸桿菌、豬紅斑丹毒絲菌、大腸桿菌、腦膜膿毒性黃桿菌、土拉熱弗朗西絲氏菌、具核梭桿菌、陰道加德菌、杜克雷氏嗜血桿菌、流感嗜血桿菌、纏繞桿菌屬，克雷伯氏菌屬，優(yōu)選肺炎克雷伯氏桿菌、臭鼻克雷白氏桿菌、鼻硬結(jié)克雷伯氏桿菌、軍團桿菌屬、問號鉤端螺旋體、單核細胞增多性李司忒氏菌、摩拉克氏菌屬，優(yōu)選結(jié)膜炎摩拉克氏菌和奧斯陸摩拉克菌、鳥分枝桿菌、麻風分枝桿菌、結(jié)核分支桿菌、支原體屬，優(yōu)選肺炎支原體、淋病雙球菌、腦膜炎雙球菌、諾卡氏菌屬，優(yōu)選星形諾卡菌和巴西諾卡菌、溶血性巴斯德氏菌、出血敗血性巴斯德氏菌、大消化球菌、類志賀氏毗鄰單胞菌、肺炎球菌、變形菌屬，優(yōu)選奇異變形菌、普通變形桿菌、雷氏變形菌、摩氏變形菌(也分別稱為雷氏普羅威登斯菌和摩根氏菌)、普羅威登斯菌屬，優(yōu)選產(chǎn)堿普羅威登斯菌、斯氏普羅威登斯菌和雷氏普羅威登斯菌(也稱為雷氏變形菌)、綠膿假單胞菌、綠膿假單胞菌、類鼻疽假單胞菌、立克次氏體、漢氏巴爾通氏體、沙門氏菌屬，優(yōu)選腸炎沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、德比沙門氏菌，最優(yōu)選的沙門氏菌DT104型沙門氏菌屬，優(yōu)選Salmonella marcescens、志賀氏痢疾菌、弗氏志賀氏菌、波伊德志賀氏菌和索氏志賀氏菌、小螺菌、金黃色化膿性葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、念珠狀鏈桿菌、鏈球菌屬，優(yōu)選糞鏈球菌、糞鏈球菌(Streptococcus faecium)和堅忍鏈球菌、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、品他病密螺旋體、梅毒螺旋體、細弱密螺旋體，優(yōu)選密螺旋體、尿素分解尿素原體、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和鼠疫耶爾森氏菌。
根據(jù)本發(fā)明的寄生蟲例如可以選自瘧原蟲(鐮狀瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲)、血吸蟲、錐蟲、利什曼原蟲、絲狀線蟲、滴蟲、肉孢子蟲、絳蟲(牛肉絳蟲、豬肉絳蟲)、利什曼原蟲、鼠弓形體、旋毛蟲(旋毛線蟲)或球蟲(艾美球蟲屬)。
免疫原和/或抗原還可來源于選自新型隱球菌、白念珠菌、煙曲霉和球孢子菌的真菌。
然而，免疫原和/或抗原也可能來源于任何動物，包括例如脊椎動物。例如免疫原和/或抗原可包括組分來源于或基本上由選自卵清蛋白、鑰孔蟲戚血蘭蛋白和抹香鯨肌球蛋白的蛋白組成。其它實例包括，但不限于，來源于蜂和蛇毒的免疫原和/或抗原，和由吸血動物，尤其是昆蟲產(chǎn)生的生物活性例如抑制凝血的組分。
一個實施方案中的免疫原和/或抗原可包括與載體分子連接的半抗原，例如免疫原和/或抗原可基本上由或由與載體分子連接的半抗原組成?？蛇x地，免疫原和/或抗原的產(chǎn)品可包括或可基本上由或由與載體分子連接的半抗原組成。半抗原是小型化學(xué)確定的化合物，其經(jīng)過與載體分子結(jié)合而具有免疫原性，然而單獨時僅具有微弱免疫原性，半抗原的實例是(但不限于)與蛋白質(zhì)載體連接的細菌細胞壁組分，例如細菌毒素或去毒的細菌毒素。
另一實施方案中的免疫原和/或抗原可以是多價免疫原和/或抗原。多價抗原和/或免疫原例如可選自T非依賴型2抗原、合成聚合物和多聚肽抗原。然而，免疫原和/或抗原還可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它多價抗原和/或免疫原。
優(yōu)選地，免疫原和/或抗原包括能夠由MHC分子呈遞的肽，例如外源免疫原和/或外源抗原可基本上由或由能夠由MHC分子呈遞的肽組成?？蛇x地，免疫原和/或抗原的產(chǎn)品包括能夠由MHC分子呈遞的肽，例如免疫原和/或抗原的產(chǎn)品可基本上由或由能夠由MHC分子呈遞的肽組成。
能夠由MHC分子呈遞的肽可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何肽。所述肽的優(yōu)選實例如以下數(shù)據(jù)庫所示“MHC結(jié)合肽的MHCPEP-A數(shù)據(jù)庫(v.1.3)”，Brusic編譯(V.Brusic，G.Rudy，A.P.Kyne和L.C.Harrison；MHCPEP，MHC結(jié)合肽的數(shù)據(jù)庫1997更新；Nucleic Acids Research，1998，Vol.26，No.1，pp.368-371)。
此外，抗原和/或免疫原可包括兩種或多種上述免疫原和抗原的混合物。
優(yōu)選地，抗原可被針對免疫原而生成的免疫反應(yīng)識別。由此，抗原和免疫原優(yōu)選彼此相似。
更優(yōu)選地，它們彼此相似從而它們包括這樣的化合物，其單獨或與其它分子一起能夠與相同的相互作用分子相關(guān)。可選地，它們包括組分，其中組分的片段單獨或與一種或多種其它分子一起能夠與相同的相互作用分子相關(guān)。本文中相互作用分子優(yōu)選是免疫系統(tǒng)的組分。例如，相互作用分子選自抗體和和T細胞受體。
在本發(fā)明的一個實施方案中，抗原和免疫原是相同的，即意味著免疫原和抗原是同一的。在本發(fā)明的另一實施方案中，抗原是免疫原的片段。而在本發(fā)明的另一實施方案中，免疫原是抗原的片段。在本發(fā)明的其它實施方案中，抗原模擬免疫原。
免疫反應(yīng)針對免疫原和/或抗原的免疫反應(yīng)在對治療的個體施用根據(jù)本發(fā)明的組合物或疫苗制劑之前即可存在于個體中。例如，所述免疫反應(yīng)可在所述個體感染后產(chǎn)生。由此，根據(jù)本發(fā)明的方法包括增強現(xiàn)存免疫反應(yīng)的方法和/或偏移現(xiàn)存免疫反應(yīng)的方法，按照現(xiàn)有或?qū)淼淖饔媚Ｊ?例如細胞性對體液性反應(yīng))，組合物(例如抗體類型，抗體亞型等)，特異性(例如識別新的或不同的免疫原和/或抗原的亞部分)和/或親和力。
然而，在很多情況下，在對治療的個體施用根據(jù)本發(fā)明的組合物或疫苗制劑之前，個體并不存在針對免疫原和/或抗原的免疫。由此，根據(jù)本發(fā)明的方法包括在個體中產(chǎn)生針對免疫原和/或抗原的免疫反應(yīng)的方法。
優(yōu)選地，該方法包括如下步驟i)用免疫原免疫個體；和ii)在所述個體中產(chǎn)生針對免疫原的免疫反應(yīng)。
在優(yōu)選的實施方案中，免疫原被施用于個體，被所述個體的細胞內(nèi)在化，在所述細胞中進行處理并呈現(xiàn)在所述細胞的表面上。
免疫原性決定子表示能夠引起免疫反應(yīng)(包括特異性抗體反應(yīng))的任何物質(zhì)。由此，在本文所使用的這些術(shù)語的含義之下，任何抗原性決定子也是免疫原性決定子，但并非所有免疫原性決定子都是抗原性決定子。免疫原可包括于本文所述的疫苗制劑中。
根據(jù)本發(fā)明的免疫反應(yīng)(通常被稱為炎性反應(yīng))可由治療的個體的免疫系統(tǒng)的任何組分進行介導(dǎo)。
免疫系統(tǒng)可表現(xiàn)出特異性和非特異性的免疫性(Klein，J.，等，Immunology(2nd)，Blackwell Science Inc.，Boston(1997))。
一般地，B和T淋巴細胞(其細胞表面呈現(xiàn)針對特定抗原的特異性受體)產(chǎn)生特異性免疫。免疫系統(tǒng)對不同抗原的反應(yīng)的兩種方式如下1)體液介導(dǎo)的免疫，其包括B細胞刺激和抗體或免疫球蛋白的產(chǎn)生[抗體反應(yīng)產(chǎn)生還包括其它細胞，例如抗原呈遞細胞(APCs；包括巨噬細胞)，和輔助T細胞(Th1和Th2)]，和2)細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)，其包括T細胞(包括細胞毒性T淋巴細胞(CTLs))，但CTL反應(yīng)產(chǎn)生中還包括其它細胞(例如，Th1和/或Th2細胞和APCs)。
非特異性免疫包括多種細胞和機制，其中包括諸如由巨噬細胞或粒細胞的吞噬作用(外源顆?；蚩乖膬?nèi)吞)，和天然殺傷(NK)細胞活性。
非特異性免疫依賴于進化得不是很高等的機制(例如，吞噬作用，其是一種重要的宿主防御機制)且不會表現(xiàn)出特異性和記憶(特異性免疫反應(yīng)的標志)的獲得性特性。非特異性免疫對脊椎動物系統(tǒng)來說是更為先天的。此外，非特異性免疫中包括的細胞以重要的方式與B和T細胞發(fā)生相互作用以產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
特異性和非特異性免疫之間的關(guān)鍵性區(qū)別在于B和T細胞的特異性。這些細胞主要在用特異性抗原激活后獲得其反應(yīng)性且具有在未來發(fā)生暴露于該特異性抗原的事件時表現(xiàn)出記憶的機制。結(jié)果，免疫接種(包括特異性和記憶)是針對有害病原體進行保護的有效方式。
細胞介導(dǎo)的可以是細胞溶解過程或包括細胞溶解過程。然而，優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的細胞毒性和/或炎性反應(yīng)由細胞毒性T細胞介導(dǎo)。所述細胞毒性T細胞優(yōu)選表達T細胞受體，其與根據(jù)本發(fā)明的抗原或抗原片段或抗原產(chǎn)品或抗原產(chǎn)品片段相關(guān)。
然而，細胞毒性和/或炎性反應(yīng)也可由天然殺傷細胞介導(dǎo)。此外，細胞毒性和/或炎性反應(yīng)例如可由中性粒細胞介導(dǎo)，或細胞毒性和/或炎性反應(yīng)可由嗜酸性粒細胞介導(dǎo)。
而且，細胞毒性和/或炎性反應(yīng)可由抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)機制介導(dǎo)。所述機制優(yōu)選包括與根據(jù)本發(fā)明的抗原或抗原片段或抗原產(chǎn)品或抗原產(chǎn)品片段相關(guān)的抗體。
在本發(fā)明的一個實施方案中，細胞毒性和/或炎性反應(yīng)可由先天免疫系統(tǒng)介導(dǎo)。例如，細胞毒性和/或炎性反應(yīng)可由補體級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)。例如，細胞毒性和/或炎性反應(yīng)可由抗體的調(diào)理作用過程介導(dǎo)。例如，細胞毒性和/或炎性反應(yīng)可由補體系統(tǒng)的一種或多種組分的調(diào)理作用過程介導(dǎo)。
特別地，細胞毒性和/或炎性反應(yīng)可由靶細胞細胞性表面上的抗體的調(diào)理作用通過經(jīng)典補體途徑而介導(dǎo)，或細胞毒性和/或炎性反應(yīng)可由補體因子的活化(補體旁路)而直接起動。
一種或兩種補體途徑被活化后，可形成終末膜攻擊復(fù)合體，靶細胞可被所述復(fù)合物溶解和清除。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，細胞溶解過程可由膜攻擊復(fù)合體的形成而導(dǎo)致。
根據(jù)本發(fā)明的可激活補體途徑的抗體，例如可以是選自IgG1、IgG2、IgG3和IgM抗體同種型的抗體。
抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)機制可包括補體途徑以外的其它抗細胞性效應(yīng)子。例如與靶細胞結(jié)合的抗體可引導(dǎo)嗜酸性粒細胞針對靶細胞的細胞溶解作用。在該實施方案中，抗體優(yōu)選是IgE。
此外，細胞毒性和/或炎性反應(yīng)可由本文上述兩種或多種機制的組合進行介導(dǎo)。例如，其可由選自細胞毒性T細胞、天然殺傷細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒性和細胞溶解機制的兩種或多種而進行介導(dǎo)。
免疫原遞送系統(tǒng)根據(jù)本發(fā)明的免疫原遞送系統(tǒng)可以是能夠被靶向個體的靶細胞的任何免疫原遞送靶向系統(tǒng)，其中靶細胞是需要靶向的和/或需要清除的。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知大量不同的免疫原遞送系統(tǒng)，根據(jù)具體需要可選自適宜的免疫原遞送靶向系統(tǒng)。
在優(yōu)選的實施方案中，免疫原和免疫原遞送系統(tǒng)被包括在疫苗制劑中。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何疫苗制劑均可被用于本發(fā)明的相關(guān)內(nèi)容中。
在本發(fā)明的一個實施方案中，免疫原遞送系統(tǒng)是陽離子性ISCOM。
Posintros或ISCOMS例如可以是未決WO專利申請?zhí)朠CT/DK02/00229所述的任何化合物，該專利申請由此全文引入作為參考。
本發(fā)明范圍內(nèi)的PosIntros是復(fù)合物，其包括i)至少一種第一甾醇和/或至少一種第二甾醇，其中至少一種第二甾醇能夠通過選自靜電作用和疏水作用的相互作用方式而接觸外源抗原，優(yōu)選核酸，其中至少一種第一甾醇和/或至少一種第二甾醇能夠與至少一種第一皂苷和/或至少一種第二皂苷形成復(fù)合物，和ii)至少一種第一皂苷和/或至少一種第二皂苷，其中至少一種第二皂苷能夠通過選自靜電作用和疏水作用的相互作用方式而接觸遺傳決定子，其中至少一種第一皂苷和/或至少一種第二皂苷能夠與至少一種第一甾醇和/或至少一種第二甾醇形成復(fù)合物，和任選地iii)至少一種用于通過選自靜電作用和疏水作用的相互作用方式接觸遺傳決定子的接觸基團，條件是復(fù)合物中不存在第二甾醇時，至少存在一種接觸基團，以及進一步任選地i)至少一種親脂部分。
在一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的Posintros可采用微粒結(jié)構(gòu)，其形式為與已知的免疫刺激復(fù)合物(iscom)相似的籠狀基質(zhì)。除iscom結(jié)構(gòu)外，甾醇和皂苷間的相互作用已被報道可導(dǎo)致多種不同的結(jié)構(gòu)形式，包括例如晶格、蜂窩、桿和無定形顆粒的形式，所有這些結(jié)構(gòu)形式均包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在一個實施方案中，免疫原遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)體。本發(fā)明意義上的脂質(zhì)體一般是兩親化合物(包括親脂部分)的球狀或球型集簇體或聚集體，其通常是一種或多種同心層的形式，例如，單層、雙層或多層。其還可被優(yōu)選地作為本文中的脂質(zhì)載體。脂質(zhì)體可由，例如，離子性脂質(zhì)和/或非離子性脂質(zhì)制備。由非離子性脂質(zhì)制備的脂質(zhì)體可被優(yōu)選地作為聚乙二醇脂肪酸脂體(niosomes)。由陽離子脂質(zhì)或陰離子脂質(zhì)制成的(至少部分)脂質(zhì)體可被優(yōu)選地作為共螯合物。
脂質(zhì)體可例如按照Lipford和Wagner(1994)，Vaccine，vol.12，no.1，p.73-80中所述進行制備，該文件引入此處作為參考。適用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的一般脂質(zhì)體制備技術(shù)已被公開于，例如美國專利序號4,728,578、4,728,575、4,737,323、4,533,254、4,162,282、4,310,505和4,921,706；英國專利申請GB 2193095A；國際專利申請序號PCT/US85/01161和PCT/US89/05040；Mayer等，Biochimica et BiophysicaActa，858161-168(1986)；Hope等，Biochimica et Biophysica Acta，81255-65(1985)；Mayhew等，Methods in Enzymology，14964-77(1987)；Mayhew等，Biochimica et Biophysica Acta，755169-74(1984)；Cheng等，Investigative Radiology，2247-55(1987)；以及Liposome Technology，Gregoriadis，G.，ed.，Vol.l，pp.29-31，51-67 and 79-108(CRC PressInc.，BocaRaton，F(xiàn)la.1984)中，上述各文件的公開內(nèi)容由此引入此處作為參考。
由此，脂質(zhì)體組合物可采用多種常規(guī)脂質(zhì)體制備技術(shù)中的任一項進行制備，所述技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是很明顯的，其包括，例如，溶劑透析，弗氏擠壓、擠壓(有或無凍融)、反相蒸發(fā)法、單純凍融、聲裂法、鰲合物透析、勻漿化、溶劑浸潤、微乳化、自發(fā)形成、溶劑蒸發(fā)、溶劑透析、弗氏細胞壓碎技術(shù)、受控去污劑透析，及其它，每種均包括制備多種形式的組合物。參見例如，Madden等，Chemistry and Physics ofLipids，5337-46(1990)，其公開內(nèi)容由此引入此處作為參考。
WO申請?zhí)朠CT/US89/05040(提交于1989年11月8日)中公開了適宜的凍融技術(shù)，該申請的內(nèi)容由此全文引入此處作為參考。包括凍融技術(shù)的方法優(yōu)選用于制備脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的制備可在諸如鹽水溶液、磷酸鹽緩沖水溶液或無菌水的溶液中進行。脂質(zhì)體還可通過多種方法制備，包括搖動或渦旋，其可通過如下方法實現(xiàn)，例如，通過使用進機械性搖動裝置，諸如Wig-L Bug.TM.(Crescent Dental，Lyons，III.)，Mixomat(DegussaAG Frankfurt，Germany)，Capmix(Espe Fabrik Pharmazeutischer PraeparateGMBH&Co.，Seefeld，Oberay Germany)，Silamat Plus(Vivadent，Lechtenstein)或Vibros(Quayle Dental，Sussex，England)。還可使用常規(guī)微乳化設(shè)備，諸如Microfluidizer.TM.(Microfluidics，Woburn，Mass.)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，免疫原遞送系統(tǒng)包括生物可降解的微球。在另一實施方案中，免疫原遞送系統(tǒng)包括膠囊化系統(tǒng)。在一個優(yōu)選的實施方案中，免疫原遞送系統(tǒng)包括共螯合物。而在另一實施方案中，免疫原遞送系統(tǒng)包括毫微粒。而在其它實施方案中，免疫原遞送系統(tǒng)包括水凝膠。而在其它實施方案中，免疫原遞送系統(tǒng)包括微晶體。
組合物和疫苗制劑可包括一種以上免疫原或抗原，諸如2種、諸如3種、諸如4、諸如5種、諸如大于5種不同抗原。免疫原和抗原可選自上述免疫原和抗原。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可常規(guī)地包括無毒的藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑可包括佐劑、穿透佐劑、乳化劑、抗氧化劑、緩沖劑、防腐劑、濕潤劑、螯合劑、膠凝劑等，且均可根據(jù)常規(guī)藥學(xué)實踐，以藥物制劑領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的方式進行選擇。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物和疫苗制劑進一步包括佐劑。根據(jù)本發(fā)明的疫苗制劑可進一步包括載體。載體或佐劑可以是本領(lǐng)域已知的任何載體或佐劑包括其功能等效物。功能等效的載體在相似條件下使用時能夠以基本上相同的立體構(gòu)型呈遞的相同抗原。功能等效的佐劑在相似條件下使用時對組合物功效的增加相似。
優(yōu)選地，所述制劑包括有效的、無毒的佐劑，該佐劑應(yīng)能增強和/或調(diào)節(jié)包括抗原決定簇的免疫原決定基的免疫原性，所述抗原決定簇包括由一類優(yōu)選佐劑代表的半抗原決定簇，此外，所述佐劑優(yōu)選還能引發(fā)更早期、更有效的或時間更長的免疫反應(yīng)。所述佐劑還可在免疫原供應(yīng)受限或制備昂貴的情況下應(yīng)用。
本發(fā)明包括的佐劑可根據(jù)其來源進行分組，可以是礦物的、細菌的、植物的、合成的，或宿主產(chǎn)品。該分類中的第一組是礦物佐劑，諸如鋁化合物。用鋁鹽沉淀的抗原或與完成的鋁化合物混合或吸附于完成的鋁化合物的抗原已被廣泛用于增加動物和人類中的免疫反應(yīng)。鋁粒子已在免疫后7日的兔局部淋巴結(jié)中得到證實，其另一主要功能是將抗原引導(dǎo)至淋巴結(jié)自身中包括T細胞的區(qū)域。佐劑效能已被證實與引流淋巴結(jié)密切相關(guān)。很多研究已經(jīng)證實抗原與鋁鹽一起施用可導(dǎo)致體液免疫增加，而細胞介導(dǎo)的免疫僅輕微增加，如通過遲發(fā)型超敏反應(yīng)所檢測的。氫氧化鋁也已被證實可激活補體途徑。該機制可在局部炎性反應(yīng)以及免疫球蛋白生成和B細胞記憶中發(fā)揮作用。而且，氫氧化鋁可保護抗原免于快速分解代謝。主要因為其優(yōu)良的安全記錄，鋁化合物是目前唯一用于人類的佐劑。
另一大類佐劑是細菌來源的佐劑。細菌來源的佐劑可被純化和合成(例如胞壁酰二肽，脂質(zhì)A)且宿主介導(dǎo)子(mediator)已被克隆(白細胞介素1和2)。近十年來，在細菌來源的活性組分的某些佐劑的化學(xué)純化方面已經(jīng)取得限制性進展百日咳博德特氏菌、結(jié)核分枝桿菌、脂多糖、弗氏完全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐劑(Difco Laboratories，Detroit，Mich.)和Merck佐劑65(Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)。其它適用于本發(fā)明的佐劑是Titermax經(jīng)典佐劑(SIGMA-ALDRICH)、ISCOMS、QuilA、ALUN(參見US 58767和5,554,372)、脂質(zhì)A衍生物、霍亂毒素衍生物、HSP衍生物、LPS衍生物、合成肽基質(zhì)、GMDP和其它佐劑以及與免疫刺激劑的組合(US 5,876,735)。
百日咳博德特氏菌是本發(fā)明中感興趣的佐劑，這是因為其具有通過作用于T淋巴細胞群而調(diào)節(jié)細胞介導(dǎo)的免疫的能力。對于脂多糖和弗氏完全佐劑而言，佐劑活性部分已得到被鑒定和合成，這可以進行結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的研究。其也被考慮包含在根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物中。
脂多糖和其多種衍生物(包括脂質(zhì)A)已被證實是與脂質(zhì)體或其它脂質(zhì)乳劑組合的有效佐劑。但尚未確定釋放可制備出毒性充分低而可普遍用于人類的衍生物。弗氏完全佐劑是大多數(shù)試驗研究中的標準物。
在疫苗制劑中加入礦物油以便保護抗原免于快速代謝。
多種其它類型的物質(zhì)可用作根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物中的佐劑。其包括植物產(chǎn)品諸如皂苷，動物產(chǎn)品諸如殼多糖和多種合成化學(xué)物。
本發(fā)明的佐劑，還可按其作用機制進行分類。該分類法必然在某種程度上是隨意的，因為大多數(shù)佐劑表現(xiàn)出多于一種機制的功能。佐劑可通過抗原定位和遞送而發(fā)揮作用，和通過直接作用于構(gòu)成免疫系統(tǒng)的細胞，諸如巨噬細胞和淋巴細胞。佐劑根據(jù)本發(fā)明增強免疫反應(yīng)的另一機制是通過生成抗原庫。這可以促成鋁化合物、油乳劑、脂質(zhì)體和合成化合物的佐劑活性。脂多糖和胞壁酰二肽的佐劑活性主要通過巨噬細胞的活化來介導(dǎo)，而百日咳博德特氏菌作用于巨噬細胞和淋巴細胞。US5,554,372中公開了，當被摻入根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物中時，可使用的佐劑的其它實例。
在一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的佐劑選自鋁化合物、弗氏不完全佐劑、Titermax經(jīng)典佐劑和油乳劑。
本發(fā)明還提供了一個實施方案，其中組合物或疫苗制劑還包括載體。載體可獨立地以佐劑存在?？乖洼d體的結(jié)合和/或共施用的目的可以是例如增加抗原的分子量，以便增加抗原的活性或免疫原性、賦予抗原穩(wěn)定性，增強其決定子的生物活性，或增加其血清半衰期。載體蛋白可以是包括適用于呈遞抗原的蛋白的任何常規(guī)載體。常規(guī)的載體蛋白包括，但不限于鑰孔蟲戚血蘭蛋白、血清蛋白諸如轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白或人血清白蛋白、卵清蛋白、免疫球蛋白或激素，諸如胰島素。
根據(jù)本發(fā)明的組合物或疫苗制劑還可包括生物活性組分。生物活性組分可以是能夠直接或間接影響個體的免疫反應(yīng)的任何組分。優(yōu)選地，生物活性組分選自細胞因子和趨化因子。
細胞因子可以是例如選自IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-γ、IFN-α、GM-CSF、C-CSF。本發(fā)明的組合物可用多種方式進行制備。
對于粘合劑的單片使用，可將任選地包括在疫苗制劑中的免疫原和免疫原遞送系統(tǒng)導(dǎo)入粘合劑的基質(zhì)中，以便在其于粘合劑基質(zhì)中混合前，通過將該分散體噴霧在特定水膠體上形成均質(zhì)分布。在噴霧期間，應(yīng)混混合和攪拌水膠體顆粒以確保免疫原及其遞送系統(tǒng)的平均分布。在第二步中，在相對低的溫度下，將水膠體混合至熱塑性融合的粘合劑中，而在第三步中，通過常規(guī)覆蓋技術(shù)，以優(yōu)選的厚度覆蓋最終混合物。
關(guān)于水膠體粘合劑，從所述均質(zhì)分布免疫原或疫苗組分中的釋放率非常低。對于包括均質(zhì)分布的免疫原/免疫原遞送系統(tǒng)或疫苗組分的交聯(lián)的水凝膠，釋放率較快。當免疫原遞送系統(tǒng)是PosIntros，即納米微粒時，優(yōu)選將其施用于粘合劑的表面。這優(yōu)選由水分散系完成，并導(dǎo)致具有PosIntros不均勻分布的均質(zhì)材料。具有高含量PosIntros的表面被預(yù)計為物質(zhì)的釋放側(cè)。
在其它實施方案中，免疫原遞送系統(tǒng)和免疫原以干燥狀態(tài)使用。其可通過單純地干燥和凍干這些組分而獲得。但是，優(yōu)選地，過程輔助劑如親水聚合物被用于獲得更好的堆積性能。所述輔助劑可以是多糖和纖維素材料或合成聚合物如聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇，但并不限于這些材料。溶液干燥根據(jù)過程的類型可導(dǎo)致脆性墊片或多孔結(jié)構(gòu)。通過加入增塑劑和/或用于經(jīng)皮藥物遞送的適宜增強劑可獲得更好的特性。免疫原和遞送系統(tǒng)還可浸入多孔交聯(lián)的材料中并在第二步中干燥。
最終產(chǎn)物通常是無菌的。這提示可根據(jù)所選擇的滅菌方法選擇密封包裝方法。優(yōu)選的滅菌方法是β或γ輻射。然而，對應(yīng)水凝膠可采用高壓滅菌，而對于水膠體和水凝膠粘合劑在使用環(huán)氧乙烷滅菌或等離子滅菌。高壓滅菌是唯一不適用于凍干的或其它基于親水聚合物的干片(drypads)的方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建體包括一種以上隔室，而在另一實施方案中，包括至少兩個隔室，其中第一隔室包括凍干墊片，其包括免疫原和免疫原遞送系統(tǒng)，而第二隔室包括水溶液。
膜和剝離襯層為了實際使用，本發(fā)明的構(gòu)建體應(yīng)包括覆蓋膜和/或剝離襯層。包含免疫原或疫苗組分的覆蓋膜，例如貼片、墊片或敷料在不與組織接觸的一側(cè)包括屏蔽層。所述屏蔽層可以是類似聚氨基甲酸酯、聚乙烯、聚酰胺、聚酯、聚乙烯醇等的聚合材料的薄膜，但并不限于此。該屏蔽層可以是金屬箔或薄陶瓷。由此，對本發(fā)明來說，屏蔽膜的選擇并不嚴格。所述屏蔽層的典型必要條件應(yīng)是柔性和舒適性，為此原因，聚合物膜是優(yōu)選的。
為了保護貼片的對側(cè)，基于例如硅酮等的剝離襯層應(yīng)是優(yōu)選的，但也可使用其它材料。其可基于紙片或塑料膜。關(guān)于交聯(lián)的水凝膠，塑料膜是有效的且通常不需要硅化處理。
其它薄膜(根據(jù)本發(fā)明適用的于例如包括兩個組分的構(gòu)建體或包含含有水的隔室的構(gòu)建體)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是很常見的；優(yōu)選使用來自塑料的多層屏蔽膜。
通過本發(fā)明的組合物治療的病癥或預(yù)防的病癥是個體的疾病狀態(tài)，其中疾病過程可在所述個體中特異性誘導(dǎo)免疫反應(yīng)后，經(jīng)由所述個體自身的免疫系統(tǒng)，通過致病因子的識別而被降低或消除。
典型地，病癥是(但不限于)有病原微生物感染所述個體而導(dǎo)致的疾病。
實施例實施例1制備疫苗(免疫原/免疫原遞送系統(tǒng))(實驗性破傷風疫苗)Mega 10(N-癸?；?N-甲基葡胺)購自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，并以20％儲備溶液進行使用。將膽固醇，DC-膽固醇(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和磷脂酰膽堿(Epikuron 200S，Lucas Meyer Gmbh，Germany)溶于20％Mega 10中，各組分濃度為1％w/v，然后保存于-20℃。Quil A皂苷獲自Superfos Biosector，F(xiàn)rederikssund，Denmark。將Quil A溶于Milli-Q水中(15mg/ml)，過濾滅菌，然后保存于-20℃溶液中備用。
通過將Quil A，膽固醇/DC-膽固醇和磷脂酰膽堿與破傷風毒素(ListBiological Laboratories，Inc.)組合來制備Tetanus-PosIntroTM。在35℃下攪拌4小時以形成PosIntroTM微粒，然后用磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7.2)在Slide-A-Lyzer盒(Pierce，Rockford，IL)或透析袋(Visking，London，UK)中透析，MW截止值為10,000。Quil A的反應(yīng)混合液的濃度為1.1mg/ml，而膽固醇，DC-膽固醇和磷脂酰膽堿的濃度為0.03％w/v。除非另有所述，Mega 10的終濃度為4％w/v。根據(jù)實驗，反應(yīng)混合液中破傷風毒素的濃度為0.1-0.5mg/ml。
實施例2Tetanus-PosIntroTM的純化通過磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中25％(w/v)的蔗糖(pH 7.2)來產(chǎn)生蔗糖梯度。用4.5ml蔗糖溶液注滿PolyallomerTM離心管(規(guī)格13×51mm，Beckmann Instruments)，然后保存于-20℃。通過使用需要數(shù)量的試管使其在4℃下(典型地過夜)緩慢溶解，由此產(chǎn)生梯度。置于室溫下至少1小時，使梯度平衡，然后以0.5ml或更少的體積施用Tetanus-PosIntroTM-制劑。在Beckmann Instruments SW55Ti型離心機中，于20℃，以50,000rpm離心3小時。通過二極管陣列UV檢測器(Perkin Elmer)收集完整的微粒，并于210nm進行監(jiān)測。
純化的Tetanus-PosIntroTM微粒首先用磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.2)在Slide-A-Lyzer盒(Pierce，Rockford，IL)中進行透析，以便除去蔗糖。采用Slide-A-Lyzer Concentrating SolutionTM(Pierce，Rockford，IL)通過反滲透進一步濃縮疫苗制劑。所選擇的液體免疫制劑包括破傷風毒素，該毒素被包埋在大小為35-50nm的PosIntroTM微粒中，如透射電子顯微術(shù)所示。破傷風毒素的濃度為4.2mg/ml，而Quil A的濃度為12mg/ml。
實施例3氨基酸分析獲自Waters Corporation的Pico-Tag System被用于測定PosIntroTM微粒的蛋白質(zhì)含量。采用6N HCl和酚，在Pico-Tag工作站上在150℃下實施水解1小時，然后用異硫氰酸苯酯，根據(jù)(PITC)Pico-Tag操作規(guī)程進行衍生化。為了獲得定量檢測，通過用1∶1的二氯甲烷(DCM)和乙腈(ACN)在室溫下處理10分鐘來裂解PosIntroTM構(gòu)建體，然后將溶劑/稀釋劑在真空中蒸發(fā)干燥。
實施例4水膠體粘合劑作為疫苗(免疫原和遞送系統(tǒng))的載體水膠體載體的制備如下將45g增粘樹脂(Arkon P90，Arakawa)在140℃下加入曲拐型(Z-blade)攪拌器中?；旌?分鐘后，加入32.5g嵌段共聚物Styrene-Isoprene高彈體(Kraton TR 1107，Shell)和5g己二酸二辛酯。10分鐘后，再加入7g己二酸二辛酯，將混合液進行混合直至均質(zhì)化。最后加入30g羥基甲基纖維素(Aquasorb，Hercules)。在涂覆于硅酮紙上的聚氨基甲酸酯膜(30μm)上，用熱融涂覆層，以0.5mm的厚度對混合液進行涂覆。
在干燥前，將按實施例所述制備的疫苗溶液(疫苗等價于0.100mg/cm2)平坦地施加于粘合劑表面的15mm的圓形面積上，然后用剝離襯層層壓。最終，由粘合劑模截出圓片形的貼片，其中心具有疫苗區(qū)，直徑為30mm。
將貼片獨立包裝，并用電子束輻射滅菌。
實施例5水膠體粘合劑作為疫苗的載體。
除了己二酸二辛酯按以下進行替換外水膠體粘合劑按實施例4中所述進行制備己二酸酯的第一次加入被10g石蠟油替換，而第二次被15g石蠟油替換。均質(zhì)塊在被層壓為離型紙的聚氨基甲酸酯膜上以400μm的厚度進行熱融涂覆。按實施例1中所述制備的疫苗溶液，將其平坦地噴涂在粘合劑開放表面的10mm的圓形面積上，其量等于0.100mg/cm2。
干燥后，剝離襯層被層壓至開放表面上，從層壓體上以30mm的大小模切出最終的貼片，其中心具有疫苗區(qū)。最后，包裝貼片，并用30kGyγ輻射滅菌。
實施例6交聯(lián)的水凝膠作為疫苗的載體將聚乙烯吡咯烷酮(Plasdone K 120，ISP)15g，聚乙二醇5g和脫礦物質(zhì)80g的均質(zhì)化混合液注入盤中，層厚為0.5mm。將開放結(jié)構(gòu)的非織造型聚酯置于該層的頂部，加入另一層0.5mm的均質(zhì)混合液。最后，將30μm厚的聚氨基甲酸酯薄膜層置于構(gòu)建體的頂層。然后以30kGy對盤進行β放射處理，以進行交聯(lián)。
交聯(lián)后，從盤上取下構(gòu)建體，并倒置。在與聚氨基甲酸酯薄膜相對的新頂部表面上，以0.050mg/cm2的濃度噴涂按照實施例1制備的疫苗層。
將完成的構(gòu)建體模切為貼片，包裝于金屬載體層壓膜的密封包裝內(nèi)。
實施例7交聯(lián)的水凝膠作為疫苗的載體在PVP K 90(Plasdone)，丙三醇和水以20/15/65比例的均質(zhì)混合物中進一步加入1.0部分的乙氧基化(4)季戊四醇四丙烯酸酯(獲自Sartomer)和交聯(lián)的光敏引發(fā)劑(Darocure 1173，獲自CIBA)，其量為0.5％。在混合物中進一步加入，按實施例1中所述制備的疫苗，對應(yīng)于按干重計的0.05％。
將混合物以1mm的厚度涂覆在聚乙烯薄膜(屏蔽膜)上，在涂覆層的頂部層壓厚度為25μm的聚氨基甲酸酯膜。覆蓋的和層壓的材料在下面的步驟中用紫外光(Fusion UV Systems，Inc)處理60秒。
將層壓板模切為貼片，并包裝。
實施例8凍干的交聯(lián)水凝膠作為疫苗的載體在標準實驗室裝置中，將按實施例4制備的貼片冷凍(-40℃)和凍干(24小時)。將得到的多孔墊片置于水膠體粘合劑中心，該中心不含如實施例1的疫苗，留出至少5mm的無粘合劑周邊。所述貼片應(yīng)位于用聚氨基甲酸酯膜覆蓋的一個外側(cè)表面，而在另一側(cè)為剝離襯層。
將該片獨立包裝于氣密袋中，并用β輻射滅菌。
實施例9凍干纖維素衍生物作為疫苗的載體將按實施例1中所述制備的疫苗(0.025％)與5％羥乙基纖維素的水溶液(Natrosol 250M，pharm，Hercules Inc)和0.5％PEG 300以及0.1％丙三醇混合。將得到的混合物注入直徑為15mm的孔中，層厚為0.5mm。將孔和注入物的支架移至冰箱中(-20℃)，冷凍后(24小時)，將支架移至冷凍干燥器中冷凍干燥。
將孔的墊片移至基于水膠體粘合劑的模切粘合劑貼片的中心，如實施例8所示。該粘合劑具有不含粘合劑的0.5cm的外部邊緣。最后，將剝離襯層置于貼片的頂部。
將該貼片包裝于氣密袋中，并用β輻射滅菌。使用時，中心墊片用水濕潤，以增強疫苗的釋放。
實施例10凍干纖維素衍生物作為與水容器包裝的疫苗的載體將如實施例9中所述的貼片包裝在具有兩個隔室的構(gòu)建體中。第一隔室隔室包括具有剝離襯層的貼片，但在此情況下，剝離襯層不覆蓋具有包括疫苗的凍干墊片的中心區(qū)域。第二隔室是水的容器。該兩個隔室被密封在一起，密封方式為分離覆膜包括位于隔室間的可破的按壓部。當水隔室由于按壓部被破壞而受到壓力時，水將分散至凍干墊片中。
密封應(yīng)在使用貼片前被破壞。
實施例11水凝膠粘合劑作為疫苗載體水凝膠粘合劑的制備如下。將100g PVP K-90溶于400g乙醇中。于加熱下，在溶液中進一步加入20g丙二醇和60g普通干燥的馬鈴薯淀粉和另外的40g水。當混合物呈現(xiàn)均質(zhì)化時，將其以1mm層厚在涂覆聚乙烯醇(50μm)的膜背層。所得膜為300μm。
在第二步中，將按實施例1中所述制備的疫苗以相應(yīng)于0.05mg/cm2的濃度進行噴霧。將產(chǎn)品干燥，并模切成片。
實施例12水凝膠粘合劑作為疫苗載體根據(jù)熱融混合原則制備水凝膠粘合劑。將30g PVP K 25，4，0gPVA(來自Du Pont de Nemours & Co的Elvanol HV)和36g丙三醇在曲拐型攪拌器中，在100℃下混合。當化合物呈現(xiàn)均質(zhì)時，進一步加入30g脫礦質(zhì)水。在離型紙和50μm聚乙烯薄膜之間，將最終的混合物壓為300μm的厚度。
實施例13水凝膠粘合劑作為疫苗載體在75g 0.1M檸檬酸/檸檬酸鹽緩沖液pH 6.0中混合20g聚乙烯吡咯烷酮(PVP K90)與4g聚乙二醇二甲基丙烯酸1000(PEG-DMA 1000)(交聯(lián)劑)和1g重硫酸過氧化鈉(NaPS)(光敏引發(fā)劑)。丙二醇可被用作增塑劑(參見以下組合物表)。
將聚合物溶液分散于適宜的模體中，其中厚度可以在0.5-5mm厚度間改變。如果需要背層，在將聚合物溶液分散于覆蓋模體底部的背襯膜上。
然后將聚合物溶液在紫外光下處理。在單紫外線燈下，對水凝膠進行紫外線處理(規(guī)格200W/cm，微波動力的“D”光譜型燈，傳送速度為0.4m/min)。得到片狀水凝膠，具有所需直徑的水凝膠可從其中切出。
表1水凝膠組合物和尺寸
*30μm厚的聚氨基甲酸酯膜將最終的粘合劑噴霧在具有按實施例1中所述制備的疫苗的粘合劑側(cè)，噴霧水平為0.05mg/cm2。干燥材料，施以新剝離襯層，然后制備貼片。
實施例14PosIntro透過角質(zhì)層的熒光顯微術(shù)成像在征得患者同意后，從接受縮乳術(shù)的37歲女性取得人類皮膚(得到地方倫理委員會的批準)。采用活檢穿孔器將該皮膚切成8mm活檢片。將各外植體置于細胞培養(yǎng)物中瓊脂糖凝膠中直徑8mm的孔中，共12孔。吖啶染色的Posintro顆粒(10μl，300μg/ml)被小心地以球形微滴而施用于表皮層的頂部(角質(zhì)層)。將外植體培養(yǎng)3日，37℃，5％CO2，具有Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)和10％FCS的氣液界面。將活檢樣品在OCT(TissueTek)中冷凍固定，然后在低溫切片儀(Leica，Germany)中切成4μM的切片。采用UMWIB2寬帶干擾屏障濾器，在Olympus B×60熒光顯微鏡中檢測熒光信號(綠色)。
圖11A顯示了Posintro顆粒的施用位點的切片(100×)?；啄び镁€表示。
圖11B顯示的與圖11相同(200×)。箭頭表示熒光密度較高的區(qū)域，其可能歸因于朗格漢斯細胞。
圖11C顯示了對照切片，其來自于圖11A和B的相同玻片，但遠離PosIntro顆粒的施用位點。上面的線表示角質(zhì)層的開始而下面的線表示基底膜。
實施例15PosIntro導(dǎo)向表皮中朗格漢斯細胞的成像按上述重復(fù)實驗，朗格漢斯細胞通過TRITC標記的CD1a抗體(Dako，Denmark)進行成像。如圖12中所示，朗格漢斯細胞在表皮中的位置與Posintro累積的區(qū)域非常良好的相關(guān)。
圖12A顯示了吖啶染色的Posintro顆粒透過角質(zhì)層。更強烈的染色區(qū)域用箭頭指示。
圖12B顯示了與圖12A相同的切片，其中TRITC-CD1a指示朗格漢斯細胞的存在位點，如圖12A中箭頭所示。
實施例16采用共聚焦顯微術(shù)對PosIntro透過角質(zhì)層的成像孵育1日后，將置于上皮側(cè)的具有熒光標記的PosIntros的外植體在冰冷異戊烷中于干冰上于99％乙醇內(nèi)冷凍固定。將冷凍的外植體切片，然后將其在冷凍模中包埋在O.C.T.化合物中(TissueTek，Sakura)。
將外植體冷凍切為20μm厚的切片，用第一小鼠抗人膠原IVa.b.(DAKO，M0785)標記基底膜，4℃過夜。次日早晨，用第二Alexa Flour488山羊抗小鼠a.b(Molecular Probes，A-11001)實施第二標記。最后，用Meyers酸性蘇木素對玻片染色1分鐘。
用備有488nm和543nm激光的Zeis LSM 310共焦顯微鏡對切片進行顯微鏡下評估。以488nm激光激發(fā)用Alexa Flour 488第二標記的基底膜和吖啶橙標記的Posintros。以采用543nm激光的透射非共焦圖像來收集蘇木素對照。
所有共聚焦圖像均以20-30μm冷凍切片的表面底部的8-15μm單光學(xué)切面進行收集，其中采用40×干物鏡，平均×2，乘8，采用自動亮度和對比度以及另外的手動對比增強。每一圖像均代表兩個共焦單光學(xué)切面與一個透射非共焦圖像的合并。
圖13A顯示了皮膚活檢組織與吖啶PosIntro一起孵育24小時后的共聚焦顯微鏡成像(40×)。通過FITC標記的膠原IV抗體來指示基底膜的存在。
圖13B所顯示的與圖13A相同，但為80×，顯示出角質(zhì)層的透過和Posintro顆粒聚集物穿過表皮的分布。
圖13C顯示了無吖啶PosIntro的如圖13A和B中活檢組織。
實施例17GFP-PosIntro轉(zhuǎn)染成纖維細胞培養(yǎng)物將L929成纖維細胞鋪于2孔分室玻片中(Nunc，Roskilde，Denmark)，然后在包含90％Dulbecco氏改良Eagles培養(yǎng)基和10％胎牛血清的培養(yǎng)基中生長。在包含2,5μg/ml GFP質(zhì)粒(gW1Z)和10μg/ml DC-PosIntro的無血清轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(Optimem-1，Gibco BRL，nitrogen，UK)中，對半融合細胞轉(zhuǎn)染3小時。單獨用GFP質(zhì)?；蛴肎FP質(zhì)粒和10μg/ml脂轉(zhuǎn)染試劑(Gibco，Invitrogen，UK)轉(zhuǎn)染對照培養(yǎng)物。在用熒光顯微鏡評估前，將轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)24小時。
如圖14所示，在用DC-PosIntro和GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，得到明亮熒光表達GFP的培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)染率為約1％(與之相比，脂轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物為10-20％)。然而，用DC-PosIntro轉(zhuǎn)染后的細胞表觀遠比用脂轉(zhuǎn)染試劑處理的培養(yǎng)物的健康。
實施例18經(jīng)皮乙型肝炎表面抗原疫苗接種。
三只兔子接受Poslintro制備的重組乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。免疫接種三周后，通過基于bioMerieux，Vidas HBs抗原在體外診斷系統(tǒng)中修飾的競爭測定法，對靜脈血樣品檢測HBsAg特異性抗體。
重組HBs抗原獲自Aldevron，USA。通過采用與美國臨時申請序列號60/308,609中所述相似的方法，將抗原包埋在Posintro中。然而，在包埋前，將HBs抗原與棕櫚酸以5∶1的摩爾比率偶聯(lián)。每只動物接受30μg抗原，所述抗原已被分為按照實施例13制備的三個水凝膠2貼片，其厚度為2mm和直徑為1cm。
免疫接種后24小時，對動物充分去毛，清洗免疫接種位點。將免疫接種貼片置于每一動物后背的三個不同的位置，并用另外的層Comfeel透明敷料(Coloplast，Denmark)支持。僅可能長地使貼片在位點上留置24小時，但由于動物的活動，在此期間，貼片會部分從皮膚上脫落。
免疫接種三周，取靜脈血樣，檢測特異性針對HBsAg的抗體滴度。通過將連續(xù)稀釋的兔血清與恒定量的重組HBsAg在正常人血漿(S1標準，獲自bioMerieux，Vidas HBs抗原試劑盒)中混合來檢測抗體。10分鐘后檢測化合物，bioMerieux(Vidas系統(tǒng)中HBs抗原診斷試劑盒)孵育。抗體滴度以稀釋度的最高點給出，其中HBsAg的檢測水平與加入正常陰性血清相比降至小于50％。所有動物在免疫接種前，對特異性針對HBsAg的抗體均檢測為陰性。
表2
表2乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的滴度?？贵w滴度按血清的最高稀釋度(100倍稀釋度)給出，此時HBs抗原的特異性檢測被抑制至少50％。試驗值是任意單位，最大值為1.14。
實施例19經(jīng)皮破傷風疫苗接種兔子組(5只動物)接受經(jīng)皮破傷風疫苗，所述疫苗分別是用皂苷制備或包埋在Posintro顆粒中的(如實施例2只所述)以及如實施例13給出尺寸的水凝膠2貼片。在免疫接種后3周，通過ELISA檢測血樣，并測定抗體滴度。圖15中顯示了按最高稀釋度(5倍)的滴度，此時吸光度倍降至低于50倍稀釋度時滴度的50％。
權(quán)利要求
1.一種將至少一種免疫原經(jīng)皮遞藥于個體的組合物，其包括a)所述至少一種免疫原b)包埋載體和c)Posintro或ISCOM形式的免疫原遞藥系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的組合物，其中包埋載體是壓力敏感粘合劑。
3.一種將至少一種免疫原經(jīng)皮遞藥于個體的組合物，其包括a)所述至少一種免疫原b)壓力敏感粘合劑形式的包埋載體和c)包括至少一種皂苷和至少一種甾醇的免疫原遞藥系統(tǒng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1-3任一項的組合物，其中經(jīng)皮遞藥包括經(jīng)過皮膚表面或經(jīng)過粘膜組織的遞藥。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1-4任一項的組合物，其中包埋載體是吸收性壓力敏感粘合劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1-5任一項的組合物，其中包埋載體是水膠體粘合劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1-5任一項的組合物，其中包埋載體是水凝膠粘合劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1-5任一項的組合物，其中包埋載體是交聯(lián)的水凝膠粘合劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1-8任一項的組合物，其中免疫原和免疫原遞藥系統(tǒng)優(yōu)選均質(zhì)地分布在包埋載體中。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1-8任一項的組合物，其中免疫原和免疫原遞藥系統(tǒng)分布在包埋載體的表面上。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1的組合物，其中包埋載體是非粘合性包埋載體，并進一步包括第二粘合劑，其與載體分離，以用于皮膚固定。
12.根據(jù)權(quán)利要求
11的組合物，其中包埋載體被干燥或冷凍干燥，并包括含有親水聚合物物質(zhì)或動物脂肪樣組合物的載體。
13.根據(jù)權(quán)利要求
1-12任一項的組合物，其中包埋載體或第二粘合劑是覆蓋層，諸如墊片、貼片、敷料等。
14.根據(jù)權(quán)利要求
12或13任一項的組合物，其進一步包括水或其它適宜溶劑/稀釋劑的貯器。
15.根據(jù)權(quán)利要求
14的組合物，其中水貯器可被破裂，而水或溶劑/稀釋劑可被吸收至包埋載體中。
16.根據(jù)權(quán)利要求
1-15任一項的組合物，其進一步包括速率控制膜。
17.根據(jù)權(quán)利要求
1-16任一項的組合物，其中免疫原和/或免疫原遞藥系統(tǒng)彼此分離。
18.根據(jù)權(quán)利要求
1-17任一項的組合物，其進一步包括用于經(jīng)皮遞藥的增強劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求
1-18任一項的組合物，其中至少一種免疫原以如下方式選擇，即誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)針對一種或多種抗原。
20.根據(jù)權(quán)利要19的組合物，其中所述一種或多種抗原來源于微生物，優(yōu)選病原微生物，諸如病毒、細菌、寄生蟲和/或真菌，或來源于非微生物性生物體，例如來源于動物，諸如脊椎動物。
21.根據(jù)權(quán)利要求
19或20任一項的組合物，其中免疫原和/或抗原來源于病毒。
22.根據(jù)權(quán)利要求
21的組合物，其中所述一種或多種抗原是合成抗原、來源于所述個體的抗原或來源于任何物種的抗原。
23.根據(jù)權(quán)利要求
19或20任一項的組合物，其中所述誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)為所述個體提供抵抗病原微生物的保護，所述抗原或多個抗原是所述病原微生物的一部分。
24.根據(jù)權(quán)利要求
19-20或23任一項的組合物，其中所述誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)可通過隨后將個體暴露于所述病原微生物而發(fā)揮作用。
25.根據(jù)權(quán)利要求
19-20或23-24任一項的組合物，其中所述誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)針對由所述病原微生物在所述個體感染期間產(chǎn)生的病原性成分，例如細菌毒素，諸如破傷風毒素。
26.根據(jù)權(quán)利要求
1-25任一項的組合物，其中免疫原和/或抗原包括或由以下組成i)一種或多種相同或不同的多肽和/或肽，其中多肽和/或肽任選地包括翻譯后修飾，ii)一種或多種相同或不同的脂肽，諸如與脂質(zhì)基團化學(xué)連接的多肽和/或肽，iii)一種或多種相同或不同的核酸序列或多個序列，其可編碼多肽和/或肽，或iv)一種或多種相同或不同的多糖和/或寡糖，或其組合，其中免疫原和/或抗原可被進一步處理為片段。
27.根據(jù)權(quán)利要求
1-26任一項的組合物，其中免疫原和免疫原遞藥系統(tǒng)被包括在疫苗制劑中。
28.根據(jù)權(quán)利要求
3的組合物，其中免疫原遞藥系統(tǒng)是PosIntro或ISCOM。
29.根據(jù)權(quán)利要求
1-28任一項的組合物，其中免疫原遞藥系統(tǒng)是一種復(fù)合物，該復(fù)合物包括i)至少一種第一甾醇和/或至少一種第二甾醇，其中至少一種第二甾醇能夠通過選自靜電作用和疏水作用的相互作用方式接觸外源蛋白質(zhì)，優(yōu)選核酸，其中至少一種第一甾醇和/或至少一種第二甾醇能夠與至少一種第一皂苷和/或至少一種第二皂苷形成復(fù)合物，和ii)至少一種第一皂苷和/或至少一種第二皂苷，其中至少一種第二皂苷能夠通過選自靜電作用和疏水作用的相互作用方式接觸遺傳決定子，其中至少一種第一皂苷和/或至少一種第二皂苷能夠與至少一種第一甾醇和/或至少一種第二甾醇形成復(fù)合物，和任選地iii)至少一種通過選自靜電作用和疏水作用的相互作用方式而用于接觸遺傳決定子的接觸基團，條件是在復(fù)合物中不存在第二甾醇時存在至少一種接觸基團和進一步任選地iv)至少一種親脂部分。
30.制備根據(jù)權(quán)利要求
1-29任一項的組合物的方法，包括如下步驟，將被任選地包括在疫苗制劑中的免疫原和免疫原遞藥系統(tǒng)，通過在載體溶液中分散或浸泡或通過施加于其表面而導(dǎo)入包埋載體的基質(zhì)中或其表面上，和任選地對組合物滅菌和/或干燥和/或密封包裝。
31.根據(jù)權(quán)利要求
30的方法，其進一步包括在導(dǎo)入載體前，對免疫原和免疫原遞藥系統(tǒng)的干燥或凍干步驟。
32.根據(jù)權(quán)利要求
30或31任一項的方法，其進一步包括添加一種或多種用于經(jīng)皮遞藥的增強劑和/或一種或多種增塑劑的步驟。
33.包括根據(jù)權(quán)利要求
1-29任一項的組合物的構(gòu)建體。
34.根據(jù)權(quán)利要求
33的構(gòu)建體，其含有一種或多種隔室。
35.根據(jù)權(quán)利要求
33或34任一項的構(gòu)建體，其包括至少兩種隔室，其中第一隔室包括凍干的墊片，其包括免疫原和免疫原遞藥系統(tǒng)，而第二隔室包括水或其它適宜的溶劑/稀釋劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求
33-35任一項的構(gòu)建體，其包括至少兩種分離的組分。
37.在個體中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方法，其中將根據(jù)權(quán)利要求
1-29任一項的組合物施用于所述個體。
38.治療或預(yù)防個體中疾病狀態(tài)，例如由病原微生物感染所述個體而導(dǎo)致的疾病的方法，其中將根據(jù)權(quán)利要求
1-29任一項的組合物施用于所述個體。
39.用于對個體免疫接種的方法，其中將根據(jù)權(quán)利要求
1-29任一項的組合物施用于所述個體。
40.免疫原用于制備包括包埋載體的組合物的用途，所述組合物用于所述免疫原的經(jīng)皮遞送。
專利摘要
本發(fā)明提供了將至少一種免疫原經(jīng)皮遞藥于個體的新型組合物，所述組合物包括(a)所述至少一種免疫原(b)包埋載體和(c)形式為PosIntro或陽離子ISCOM或包括至少一種皂苷的免疫原遞藥系統(tǒng)，以及制備該組合物的方法。本發(fā)明還提供了包括這些組合物的構(gòu)建體。所述組合物和構(gòu)建體可被用于產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方法，治療或預(yù)防疾病狀態(tài)的方法和免疫接種的方法。包埋載體是，例如壓力敏感粘合劑，諸如水膠體粘合劑或水凝膠粘合劑，其可以是交聯(lián)的，或包埋載體可以是非粘合性的。
文檔編號A61L15/16GKCN1735432SQ200380104811
公開日2006年2月15日 申請日期2003年10月2日
發(fā)明者N·S·柯克比, P·B·薩米爾森 申請人:諾迪克疫苗科技公司, 科洛普拉斯特公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan