專利名稱:基于印記位點(diǎn)調(diào)節(jié)物兄弟(boris)的預(yù)防性癌癥疫苗的制作方法
基于印記位點(diǎn)調(diào)節(jié)物兄弟(BORIS)的預(yù)防性癌癥疫苗
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生腫瘤疫苗的組合物和方法。
背景
脊椎動物能夠產(chǎn)生作為針對來自環(huán)境的病原體以及針對內(nèi)部產(chǎn)生的異常細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞的防御的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答是多種細(xì)胞和因子之間復(fù)雜相互作用的結(jié)果，但是通常包含兩個主要方面。一個方面是細(xì)胞組分，其中特化細(xì)胞直接攻擊觸犯物(具有抗原)，而另一方面是體液組分，其中抗體分子特異結(jié)合抗原并且?guī)椭那宄?。個體成分一致地相互作用可以十分有效地限制入侵病原體的最初攻擊和從宿主清除它們。
涉及提供免疫應(yīng)答的初級細(xì)胞是淋巴細(xì)胞，其通常包含兩種主要類別。第一種稱作B細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞，通常在骨髓中產(chǎn)生，并且負(fù)責(zé)產(chǎn)生和分泌抗體等。B細(xì)胞抗體產(chǎn)物傾向于與外來抗原直接作用并且中和它們或活化免疫系統(tǒng)的其他組分來消除外來抗原。具體地，調(diào)理性抗體結(jié)合細(xì)胞外外來物，從而使得它們易受吞噬和隨后的細(xì)胞內(nèi)殺死。另一方面，T細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞通常在胸腺中產(chǎn)生或成熟，負(fù)責(zé)介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。這些細(xì)胞不識別完整抗原，而是應(yīng)答其短肽片段，該短肽片段結(jié)合到出現(xiàn)在靶細(xì)胞以及抗原呈遞細(xì)胞的表面上的特化蛋白質(zhì)。更具體地，似乎細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或者細(xì)胞從胞外環(huán)境攝入的蛋白質(zhì)被正常代謝途徑連續(xù)地降解成肽。所得短片段與細(xì)胞內(nèi)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子結(jié)合并且MHC-肽復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面上以被T細(xì)胞識別。從而，細(xì)胞免疫系統(tǒng)不斷監(jiān)視細(xì)胞產(chǎn)生或攝入的全范圍的蛋白質(zhì)并且將消除呈遞外來抗原或腫瘤抗原的任何細(xì)胞，即，受病毒感染的細(xì)胞或癌細(xì)胞。
免疫球蛋白G(IgG)的結(jié)構(gòu)是四聚體蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)，其包含兩條相同的重(H)鏈和兩條相同的免疫球蛋白輕(L)鏈。這些鏈通過二硫鍵連接在一起形成Y形抗體復(fù)合體。然而，在溶液中，所述分子呈現(xiàn)更球狀形狀并且易于結(jié)合生物體液中存在的外來抗原。免疫球蛋白的氨基酸序列分析已經(jīng)導(dǎo)致在鏈內(nèi)具有多種功能活性的特定區(qū)域的限定。每條輕鏈和每條重鏈具有在前110個氨基末端殘基內(nèi)限定的可變區(qū)(分別為/和Vh)。/和Vh區(qū)的三維配對構(gòu)成了免疫球蛋白分子的抗原識別部分或者“抗原結(jié)合部位”(“ACS”)。因為免疫球蛋白的四聚體性質(zhì)，每個分子有兩個相同的抗原結(jié)合部位。這些鏈的可變結(jié)構(gòu)域在序列中高度異質(zhì)并且提供了抗原結(jié)合部位對許多抗原結(jié)構(gòu)高度特異的多樣性。可變結(jié)構(gòu)域的異質(zhì)性在整個可變區(qū)中不是均勻分布，而是位于三個片段中，所述三個片段稱作互補(bǔ)性決定區(qū)(“⑶R”)，稱作CDR1、⑶R2和⑶R3。關(guān)于這些結(jié)構(gòu)的更多信息，見Watson等人，1987,Molecular Biology of the Gene,第四版,Benjamin/Cummings Publishing C0.,Inc.Menlo Park, Calif.，此處將其引用作為參考。
每條重鏈還包括限定特定同種型的恒定區(qū)并且將免疫球蛋白分配到免疫球蛋白類別和亞類之一。恒定區(qū)含有稱作結(jié)構(gòu)域的單位(即，Cm、Ch2等等)，其在單一類別的抗體中不顯著不同。恒定區(qū)不參與抗原結(jié)合，但是可以與稱作“效應(yīng)子功能”的許多生物活性相關(guān)，所述效應(yīng)子功能為諸如結(jié)合細(xì)胞表面上的Fe受體以及結(jié)合補(bǔ)體蛋白質(zhì)。抗原呈遞細(xì)胞如樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的特征通常通過Fe受體的存在來區(qū)別。因此，如果抗體結(jié)合病原體，那么它可以通過Fe部分連接巨噬細(xì)胞。這允許病原體被巨噬細(xì)胞攝入和破壞一一種稱作調(diào)理作用的過程。此外，如將在下面更詳細(xì)討論的，多種病原性抗原可以被APC加工和展示以進(jìn)一步刺激免疫應(yīng)答。
不像重鏈，輕鏈具有一個恒定結(jié)構(gòu)域(CJ。輕鏈通過二硫鍵與重鏈配對，所述二硫鍵連接重鏈恒定區(qū)Chi與Q。此外，重鏈具有鉸鏈區(qū)，其將恒定區(qū)Chi和Ch2與分子的剩余部分分開。該鉸鏈區(qū)主要造成四聚體的柔性。分子的兩條重鏈通過鉸鏈區(qū)和Ch2之間接頭處的二硫鍵配對在一起。
為了提供這種廣泛所有組成成分，免疫球蛋白基因已經(jīng)進(jìn)化成允許從有限數(shù)目的基因產(chǎn)生許多種不同的免疫球蛋白蛋白質(zhì)，即固有多態(tài)性。由于固有多態(tài)性，哺乳動物能夠產(chǎn)生針對似乎無數(shù)種抗原的抗體。關(guān)于免疫球蛋白遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的綜述見Lewin, " Genes III" , John Wiley andSons, N.Y.(1987)和 Benjamini 和 Leskowitz,1988, Immunology, AlanR.Liss, Ine., New York,將其并入本文作為參考。
在過去幾年里，抗體由于它們的多樣性和特異性已經(jīng)在診斷和治療應(yīng)用中變得非常重要。分子生物學(xué)技術(shù)越來越多地用于擴(kuò)大用于科學(xué)應(yīng)用的抗體的種類和可用性。例如，產(chǎn)生一種抗體的B細(xì)胞可以與 腫瘤細(xì)胞融合永生化并擴(kuò)大以提供具有單一特異性的抗體的體外來源，所述抗體稱作“單克隆抗體”(mAb)。此類永生化B細(xì)胞系稱作“雜交瘤”。
直到最近，多數(shù)mAb的來源是體外培養(yǎng)的鼠(小鼠)雜交瘤。即，通常用所選抗原或者免疫原注射小鼠。隨后，處死動物并將從其脾臟除去的細(xì)胞與永生化骨髓瘤細(xì)胞融合。盡管它們已經(jīng)廣泛用于診斷方法，但是鼠mAb不能很好地適于包括人的多數(shù)哺乳動物中的治療應(yīng)用。這部分是由于鼠抗體被其他哺乳動物物種識別為外來的并且引起免疫應(yīng)答，其本身可以導(dǎo)致疾病。
為了克服至少一些外來mAb產(chǎn)生的免疫應(yīng)答和缺少適宜的人mAb的問題，已經(jīng)用基因工程構(gòu)建人源化嵌合免疫球蛋白分子，其含有鼠抗體的抗原結(jié)合互補(bǔ)性決定區(qū)，但是其中該分子的剩余部分由不被識別為外來物的人抗體序列組成。此類抗體已經(jīng)用于治療腫瘤，因為小鼠可變區(qū)識別腫瘤抗原并且分子的人源化部分能夠介導(dǎo)免疫應(yīng)答而不被身體快速清除。見，例如，Jones等人，Nature，321:522-525 (1986)，將其并入本文作為參考。
此類抗體的其他用途在PCT公開號WO 94/14847中詳細(xì)描述，將W094/14847也并入本文作為參考。在這些情況中，將外來抗原的表位，如病毒或者細(xì)菌表位嫁接到免疫球蛋白的高變區(qū)以誘導(dǎo)應(yīng)答。即，工程化抗體用作疫苗引起免疫應(yīng)答和賦予長期免疫原性記憶，從而允許受試者擊退隨后的感染。
這些和更常規(guī)的疫苗是有效的，因為它們刺激免疫系統(tǒng)的兩個叉。盡管與免疫應(yīng)答的體液組分相關(guān)的復(fù)雜性，但是它將不會自身能夠有效保護(hù)動物免于受試者每天受到的無數(shù)病原性攻擊。相反地，只有高度進(jìn)化的細(xì)胞應(yīng)答的存在才允許高級生物幸存和繁殖。
如上面指出的，從骨髓中前體細(xì)胞產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞或者T細(xì)胞是針對入侵病毒和其他微生物的免疫應(yīng)答中的主要成員。祖先干細(xì)胞遷移到胸腺，在胸腺中，作為所稱作的胸腺細(xì)胞，它們變得特化。具體地，它們開始展示受體分子，所述受體分子后來使得成熟T細(xì)胞檢測感染。為了有益，T細(xì)胞必須通過它們的受體附著到抗原(蛋白質(zhì)標(biāo)記物信令入侵物的存在)。同時，它們將對身體產(chǎn)生的物質(zhì)不反應(yīng)(blind)，因為自身反應(yīng)性T細(xì)胞可以破壞正常組織。通常，僅僅產(chǎn)生有用受體的那些胸腺細(xì)胞將完全成熟并且進(jìn)入血流以巡視身體。健康個體中將無效或者將攻擊身體的自身組織的其他胸腺細(xì)胞在離開胸腺前通過程序性細(xì)胞死亡清除。
最后進(jìn)入循環(huán)作為溶細(xì)胞T淋巴細(xì)胞或者T輔助細(xì)胞的成熟T細(xì)胞保持靜止，除非它們遇到它們的受體可以識別的抗原。當(dāng)遇到淋巴細(xì)胞對其具有親和性的特異抗原時，它們增殖并進(jìn)行效應(yīng)子功能，其結(jié)果是外來抗原的清除。
已經(jīng)將T細(xì)胞基于它們執(zhí)行的不同任務(wù)分類成一些亞群。這些亞群包括輔助T細(xì)胞(Th)，其是促進(jìn)或增強(qiáng)T和B細(xì)胞應(yīng)答所需的；細(xì)胞毒性(或者溶細(xì)胞)T淋巴細(xì)胞(CTL)，其通過細(xì)胞裂解直接殺死它們的靶細(xì)胞；和抑制性或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Ts或者Tr)，其下調(diào)免疫應(yīng)答。在每種情況中，T細(xì)胞識別抗原，但是僅僅當(dāng)通過附著到抗原呈遞細(xì)胞表面的特化蛋白質(zhì)復(fù)合體呈遞在細(xì)胞的表面上時，T細(xì)胞才會識別所述抗原。更具體地，T細(xì)胞使用稱作T細(xì)胞抗原受體(TCR)的特異受體，TCR是跨膜蛋白質(zhì)復(fù)合體，其能夠與共同稱作主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的一組蛋白質(zhì)結(jié)合識別抗原。數(shù)千相同TCR在每個細(xì)胞上表達(dá)。TCR在功能和結(jié)構(gòu)上與表面抗體(非分泌的)有關(guān)，B細(xì)胞將所述表面抗體用作它們的抗原受體。此外，T細(xì)胞的不同亞群還表達(dá)許多細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，它們的一些稱作“標(biāo)記蛋白質(zhì)”，因為它們是特定亞群特征性的。例如多數(shù)Th細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面CD4蛋白質(zhì)，而多數(shù)CTL細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面⑶8蛋白質(zhì)，Tr細(xì)胞表達(dá)⑶25和⑶4分子。這些表面蛋白質(zhì)在免疫應(yīng)答的啟動和維持中是重要的，所述免疫應(yīng)答取決于APC表面上具體蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合體之間的識別和相互作用。
一段時間以來已知主要組織相容性復(fù)合體或者M(jìn)HC實際上包含一系列糖基化蛋白質(zhì)，其包含不同的四級結(jié)構(gòu)。通常，所述結(jié)構(gòu)為兩種類型:1類MHC，其展示來自細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(如自身蛋白質(zhì)或者病毒復(fù)制隨后產(chǎn)生的蛋白質(zhì))的肽，和II類MHC，其通常展示來自從外面進(jìn)入細(xì)胞的蛋白質(zhì)(可溶性抗原，如細(xì)菌毒素)的肽。通過固有多態(tài)性確保多種抗原的識別，所述固有多態(tài)性提供了能夠結(jié)合可能產(chǎn)生的任何病原性肽的MHC分子的多樣庫。基本上，所有有核細(xì)胞都產(chǎn)生和表達(dá)I類MHC，其可以顯示天然發(fā)生的肽、腫瘤結(jié)合的肽或者病毒入侵者產(chǎn)生的肽。相反地，一些其他有核細(xì)胞和其中的特化淋巴樣細(xì)胞(通常稱作抗原呈遞細(xì)胞)產(chǎn)生和表達(dá)II類MHC蛋白質(zhì)。不管細(xì)胞類型，兩種MHC類別都將肽攜帶到細(xì)胞表面并將它們呈遞給靜息T淋巴細(xì)胞。通常，Th細(xì)胞識別II類MHC抗原復(fù)合體，而CTL傾向于識別I類MHC抗原復(fù)合體，盡管也發(fā)生抗原的交叉呈遞。
當(dāng)具有適當(dāng)TCR的靜息T細(xì)胞遇到在它的表面展示肽的APC時，TCR結(jié)合肽-MHC復(fù)合體。更具體地，數(shù)百TCR結(jié)合許多肽-MHC復(fù)合體。當(dāng)接觸足夠TCR時，累積效應(yīng)激活T細(xì)胞。負(fù)責(zé)MHC-抗原復(fù)合體的特異識別和應(yīng)答的T細(xì)胞上的受體由一些整合血漿膜蛋白質(zhì)的復(fù)合體組成。如同前面討論的MHC復(fù)合體，通過固有多態(tài)性導(dǎo)致體細(xì)胞重排確保TCR的多樣化庫。將強(qiáng)調(diào)盡管TCR的庫可以是多樣的，但是每個T細(xì)胞僅表達(dá)一種特定TCR。然而，每個T細(xì)胞通常在每個細(xì)胞表面上顯示對僅一種肽特異的該受體的數(shù)千拷貝。此外，一些其他類型的膜結(jié)合的蛋白質(zhì)參與T細(xì)胞結(jié)合和活化。
T細(xì)胞的活化使得產(chǎn)生一系列化學(xué)信號(主要是細(xì)胞因子)，其導(dǎo)致細(xì)胞采取直接行動或者刺激免疫系統(tǒng)的其他細(xì)胞采取行動。對于I類MHC抗原激活，CTL增殖并破壞呈遞相同抗原的受感染細(xì)胞。殺死受感染的細(xì)胞剝奪了病毒的生命支持并且使得它易受抗體接近，所述抗體最終清除該病毒。相比，II類MHC抗原復(fù)合體對Th細(xì)胞的活化不破壞抗原呈遞細(xì)胞(其是宿主防御系統(tǒng)的部分)，而是刺激Th細(xì)胞增殖和產(chǎn)生影響多種細(xì)胞的信號(再次主要是細(xì)胞因子)。結(jié)果，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致B細(xì)胞刺激、巨噬細(xì)胞活化、CTL分化和炎癥的啟動，等等。該協(xié)同應(yīng)答是相對特異的并且針對具有II類MHC系統(tǒng)呈遞的所述肽的外來成分。
免疫系統(tǒng)可以接近的身體中那些結(jié)構(gòu)中表位的不斷監(jiān)視提供了非常有效的方式用以識別和保持“自身”和破壞侵入身體或者病理性產(chǎn)生的表位和它們的載體。當(dāng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)時，免疫應(yīng)答在清除微觀病原體和認(rèn)為在身體中不斷產(chǎn)生的瘤(腫瘤)細(xì)胞中令人驚奇地有效并且在極大程度上它們在變得可檢測之前就被免疫系統(tǒng)清除。身體的某些區(qū)域，如腦、眼和睪丸受到保護(hù)而免于免疫監(jiān)視，這些部位稱作免疫特權(quán)的。通常，自身識別的復(fù)雜機(jī)制非常有效并且允許強(qiáng)烈應(yīng)答僅針對外來抗原。不幸的是，免疫系統(tǒng)偶然功能失常并且針對宿主的細(xì)胞，引起自身免疫應(yīng)答。通常，當(dāng)免疫細(xì)胞上的抗原受體識別健康細(xì)胞上的特異抗原時，自身免疫將發(fā)生并且導(dǎo)致具有那些特定物質(zhì)的細(xì)胞死亡。在許多情況中，自身免疫反應(yīng)是自限的，因為當(dāng)引起自身免疫反應(yīng)的抗原被清除時，自身免疫反應(yīng)消失。然而，在一些情況中，自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞比它們所應(yīng)該的存活地更長并且繼續(xù)誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡或者消滅正常細(xì)胞。
當(dāng)前數(shù)據(jù)表明針對所有癌癥的免疫保護(hù)需要產(chǎn)生針對惡性細(xì)胞表達(dá)的獨(dú)特腫瘤抗原的強(qiáng)烈細(xì)胞免疫應(yīng)答。結(jié)果，成功的免疫保護(hù)首先需要腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的獨(dú)特抗原(腫瘤特異抗原)和其次，靶定該腫瘤抗原的強(qiáng)烈T細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。
一些腫瘤相關(guān)的抗原是當(dāng)前已知的，并且已經(jīng)用于產(chǎn)生疫苗的臨床前和臨床研究。例如，PSMA, PAP和PSA是前列腺腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的抗原。Her2/neu和MUCl是乳腺癌細(xì)胞和其他癌(包括肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和胰腺癌)表達(dá)的抗原。MAGEs和MART-1是黑素瘤腫瘤細(xì)胞相關(guān)的抗原，CEA是與胰腺癌或結(jié)腸直腸癌相關(guān)的抗原。還已經(jīng)描述了其他組織和/或腫瘤特異抗原。然而，盡管所 有這些抗原以正常或異常形式在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，但是它們也在多種正常細(xì)胞中表達(dá)，并且從而不能用于預(yù)防接種。換句話說，這些腫瘤相關(guān)的抗原仍然被免疫細(xì)胞識別為自身分子并且因此不發(fā)生免疫系統(tǒng)的真實活化。這造成了靶定這些腫瘤相關(guān)分子作為疫苗基礎(chǔ)的至少兩個障礙。第一個障礙是免疫系統(tǒng)對自身分子的無應(yīng)答性(耐受性)，其限制了免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有效細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。第二個障礙是所產(chǎn)生的任意有效細(xì)胞免疫應(yīng)答不應(yīng)該針對表達(dá)所述祀抗原的正常細(xì)胞。這是建議上面討論的所有腫瘤相關(guān)的抗原僅用作治療性疫苗接種的靶標(biāo)的原因。
最近已經(jīng)描述了一種新的蛋白質(zhì)，其能夠克服與已知腫瘤相關(guān)抗原相關(guān)的問題。印記位點(diǎn)調(diào)節(jié)物兄弟(BORIS)首次被描述為在睪丸中發(fā)現(xiàn)的DNA結(jié)合蛋白。該蛋白質(zhì)與CCTCC結(jié)合因子(CTCF)共有11個鋅指(ZF)結(jié)構(gòu)域，CCTCC結(jié)合因子是多價11_鋅指核因子。CTCF是涉及基因調(diào)節(jié)的多個方面的保守的、普遍的且高度通用的因子并且形成甲基化敏感絕緣體，其調(diào)節(jié)X染色體失活和印記基因的表達(dá)。然而，BORIS在N和C末端與CTCF不同，并且在雄性生殖細(xì)胞發(fā)育期間與CTCF以相互排斥的方式表達(dá)。BORIS表達(dá)局限于睪丸并且僅在精母細(xì)胞的所選細(xì)胞亞群內(nèi)，所述精母細(xì)胞在雄性生殖細(xì)胞發(fā)育期間參與甲基化標(biāo)記的復(fù)原。該睪丸細(xì)胞亞群也是已知不表達(dá)CTCF的唯一正常細(xì)胞類型。因為所培養(yǎng)細(xì)胞中CTCF表達(dá)的抑制導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡，所以有理由假定BORIS受到活化而保持睪丸細(xì)胞中一些重要 CTCF 功能(Loukinov 等人(2002) Proc.Natl.Acad.Sc1.99 (10):6806-6811 ；將其并入本文作為參考)。
最近，闡明盡管CTCF過表達(dá)也阻斷細(xì)胞增殖，但是正常BORIS陰性細(xì)胞中BORIS的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞生長，其可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)化(Klenova等人(2002)Cancer Biol.12:399-414 ;將其并入本文作為參考)。人BORIS定位于20ql3區(qū)，公知其在許多相同類型腫瘤中觀察到的頻繁擴(kuò)大和/或擴(kuò)增，所述腫瘤還通常顯示出在CTCF存在的16q22上共生同源基因座上雜合性的喪失(L0H)。這些區(qū)域與“熱點(diǎn)”區(qū)相關(guān)，所述熱點(diǎn)區(qū)與乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸和食管癌以及腎胚細(xì)胞瘤有關(guān)。重要的是，BORIS表達(dá)的異?；罨坪踉诤艽蟊壤亩喾N癌中發(fā)現(xiàn)。使用RNA印跡或者RT-PCR，Klenova等人(2002)分析了代表多數(shù)主要形式的人類腫瘤的超過200種癌細(xì)胞系中BORIS mRNA水平并檢測了所測試的一半以上細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄物。對乳腺癌樣品，對于原發(fā)癌的隨后分析證實了用所述細(xì)胞系得到的結(jié)果。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及編碼印記位點(diǎn)調(diào)節(jié)物兄弟(BORIS)腫瘤抗原的無功能突變多核苷酸和此類多核苷酸用于原發(fā)和轉(zhuǎn)移癌癥的預(yù)防性疫苗接種和免疫治療的用途。多核苷酸可以是DNA或者RNA。在一個優(yōu)選實施方案中，腫瘤抗原是缺少DNA結(jié)合能力的BORIS分子的無功能突變形式。在另一優(yōu)選實施方案中，至少一個鋅指(ZF)結(jié)構(gòu)域由于突變或缺失是無功能的并且BORIS的功能被消除。在另一優(yōu)選實施方案中，突變或缺失鋅指結(jié)構(gòu)域的任意組合并且除去BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽的功能。在再一優(yōu)選實施方案中，缺失所有ZF結(jié)合位點(diǎn)。在再一優(yōu)選實施方案中，編碼BORIS的突變形式的多核苷酸與分子佐劑融合。在再一優(yōu)選實施方案中，編碼BORIS的無功能突變形式的多核苷酸與至少一種編碼分子佐劑的其他多核苷酸混合。可以使用增加細(xì)胞免疫應(yīng)答的任意分子佐劑。尤其優(yōu)選細(xì)胞因子、趨化因子和共同刺激分子。尤其優(yōu)選的趨化因子、細(xì)胞因子和共刺激分子為防衛(wèi)素2、1112、IL18、MIPa 3、IFNy 和 CD80/86。
本發(fā)明還涉及包含編碼BORIS的無功能突變形式的多核苷酸的載體。在優(yōu)選實施方案中，所述載體指導(dǎo)細(xì)菌、哺乳動物、酵母細(xì)胞或者病毒系統(tǒng)中的表達(dá)。
本發(fā)明還涉及BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽的無功能修飾(突變)形式。使用在序列中導(dǎo)入產(chǎn)生無功能蛋白質(zhì)的缺失、替代或者加入的任意方法可以產(chǎn)生無功能突變體。在優(yōu)選實施方案中，所述突變的BORIS蛋白質(zhì)、多肽或者肽缺少DNA結(jié)合能力。在另一優(yōu)選實施方案中，所述突變的BORIS蛋白質(zhì)、多肽或者肽與常規(guī)佐劑混合。在再一優(yōu)選實施方案中，所述無功能突變的BORIS蛋白質(zhì)、多肽或者肽附著到可藥用載體(主鏈)。在再一優(yōu)選實施方案中，所述無功能突變的BORIS蛋白質(zhì)、多肽或者肽連接到修飾BORIS的肽并且保持它的抗原性質(zhì)。在再一優(yōu)選實施方案中，所述無功能突變的BORIS蛋白質(zhì)、多肽或者肽連接到蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(proteintransducing domain, PTD)。
本發(fā)明還涉及表達(dá)無功能突變BORIS分子的樹突細(xì)胞。在優(yōu)選實施方案中，樹突細(xì)胞用編碼突變BORIS分子的DNA轉(zhuǎn)染。在再一優(yōu)選實施方案中，用編碼無功能突變BORIS分子的病毒載體感染樹突細(xì)胞。在再一優(yōu)選實施方案中，樹突細(xì)胞裝載無功能突變BORIS蛋白質(zhì)、多肽、肽或者BORIS的任意無功能經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)形式。
本發(fā)明包括針對BORIS蛋白 質(zhì)、多肽、肽的無功能突變形式或者BORIS的任意無功能經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)形式產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明包括針對BORIS蛋白質(zhì)、多肽、肽的無功能突變形式或者BORIS的任意經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)形式產(chǎn)生的抗體。
本發(fā)明還包括包含編碼BORIS的任意無功能突變形式的多核苷酸、無功能突變BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽或者表達(dá)無功能突變BORIS分子的樹突細(xì)胞的癌癥預(yù)防性或者治療性疫苗。
本發(fā)明還涉及治療癌癥的方法，其包括對需要其的患者施用有效量的編碼BORIS的任意無功能突變形式的多核苷酸、無功能突變BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽或者表達(dá)或含有無功能突變BORIS分子的樹突細(xì)胞(預(yù)防性疫苗)?？梢酝ㄟ^肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)鼻、直腸、陰道或者腹膜途徑進(jìn)行施用。癌癥可以是原發(fā)或轉(zhuǎn)移性癌癥。患者可以患有多種不同形式的癌癥。在優(yōu)選實施方案中，癌癥是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌或者食道癌。
附圖簡述
圖la、b、和c給出了用pB0RIS(DNA免疫)pIL12/IL18(分子佐劑)接種小鼠(η=10)的結(jié)果。這導(dǎo)致保護(hù)小鼠免于用天然表達(dá)小鼠BORIS的IO4個4Τ1腫瘤細(xì)胞的攻擊。
圖1a對于pB0RIS/pIL12/IL18、pIL12/IL18和僅載體，在Y軸上顯示了存活率，在X軸上顯示了腫瘤攻擊后的天數(shù)。圖1b顯示了對于pB0RIS/pIL12/IL18、pIL12/IL18和僅載體，腫瘤體積和腫瘤攻擊后天數(shù)之間的關(guān)系。圖1c顯示了用pB0RIS/pIL12/IL18、pIL12/IL18和僅載體免疫的組之間在第21天時腫瘤體積的顯著不同ΓΡ < 0.001)。
圖2a和b顯示了對于用pB0RIS(DNA免疫)然后用Ad5_B0RIS (病毒樣顆粒)并用IO4個4T1細(xì)胞刺激的小鼠，存活百分?jǐn)?shù)和腫瘤刺激后天數(shù)之間的關(guān)系(a)和腫瘤體積和刺激后天數(shù)之間的關(guān)系。數(shù)據(jù)表明至少33天刺激后針對腫瘤刺激的完全保護(hù)。
圖3&，13，(3給出了用？8( 15加？正^或者pIL12/IL18然后用IO5個4T1腫瘤細(xì)胞對小鼠的基因槍免疫的結(jié)果。圖3a顯示了腫瘤生長更長時間至2cm3的體積，圖3b顯示了較低的腫瘤生長速率。圖3c顯示了在第14天組pBORIS/pIFNy相對于載體(p < 0.05)，pB0RIS/pIL12/IL18 相對于 pIL12/IL18 (P < 0.05)和 pB0RIS/pIL12/IL18 相對于載體(P< 0.01)之間腫瘤體積的顯著差異。
圖4a，b，和c顯示了用pB0RIS(DNA免疫)然后注射Ad5_B0RIS (病毒樣顆粒)免疫小鼠的結(jié)果。圖4a顯示了經(jīng)接種小鼠的顯著延長的存活，而圖4b表明這些小鼠具有較低的腫瘤生長速率和用IO5個4T1腫瘤細(xì)胞刺激小鼠后腫瘤生長到2cm3的體積的時間延長。圖4c顯示了在第15天組Ad5-B0RIS相對于Ad5之間腫瘤體積的顯著差異(P < 0.001)。
圖5顯示了通過GCG程序包，對于缺口罰分用O罰分產(chǎn)生的人和小鼠BORIS多肽的最佳適合比對，保守的鋅指區(qū)高亮顯示并且指出為ZF-1I。
發(fā)明詳述
盡管本發(fā)明可以以多種不同形式體現(xiàn)，但是在此處公開例證本發(fā)明原理的特定闡明性實施方案。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是本發(fā)明不限于所闡明的特定實施方案。
本發(fā)明包括使用僅在免疫特權(quán)的睪丸細(xì)胞中表達(dá)并且在許多經(jīng)轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)的抗原來防止耐受效應(yīng)，其可以誘導(dǎo)其他腫瘤抗原。本發(fā)明還包括在編碼所述抗原的DNA中引入特定 改變以消除副作用和自身免疫反應(yīng)。在該上下文中應(yīng)用下面的定義。
術(shù)語“腫瘤”、“癌癥”、“癌”、“瘤形成”和它們的近義詞在本申請的上下文中可互換使用，用來一般指異常增生疾病和相關(guān)受影響的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊。優(yōu)選地，異常增生細(xì)胞在本文中指表達(dá)免疫特權(quán)的抗原。
細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)是效應(yīng)T細(xì)胞，通常是⑶8+，其可以介導(dǎo)具有與MHC分子結(jié)合的抗原肽的靶細(xì)胞裂解。其他細(xì)胞毒性細(xì)胞包括Y/S和CD4+NK 1.1+細(xì)胞。
免疫特權(quán)和免疫特權(quán)抗原指身體內(nèi)的某些部位和抗原與免疫系統(tǒng)分離并且從而涉及通常不針對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原。異位(它們的正常免疫特權(quán)部位之外)表達(dá)的免疫特權(quán)抗原可以導(dǎo)致自身免疫或者腫瘤免疫。免疫特權(quán)抗原由某些腫瘤表達(dá),導(dǎo)致對腫瘤和表達(dá)相同免疫特權(quán)抗原的非腫瘤位點(diǎn)的免疫應(yīng)答。
抗原呈遞細(xì)胞(APC)是可以加工和呈遞與I類或II類MHC分子結(jié)合的抗原肽和遞送T細(xì)胞活化必需的共刺激 信號的細(xì)胞，包括樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞。
“鋅指結(jié)構(gòu)域”指小的獨(dú)立折疊的結(jié)構(gòu)域，其需要一個或多個鋅離子的配位以穩(wěn)定它的結(jié)構(gòu)。指結(jié)構(gòu)(finger)結(jié)合三個堿基對亞位點(diǎn)并且特定接觸由相對于α螺旋起始的1、2、3和6位中的氨基酸介導(dǎo)。
“BORIS的無功能突變形式”指缺少功能的BORIS蛋白質(zhì)、多肽或者肽?！叭鄙俟δ堋币庠谥覆荒軋?zhí)行野生型BORIS分子的關(guān)鍵活性的任一種，如DNA結(jié)合、父本DNA-甲基化模
式的重建，等等。
“無功能突變體”指DNA或者氨基酸水平上的改變，其破壞所得蛋白質(zhì)的野生型活性。此類改變可以是作為催化位點(diǎn)和/或者參與結(jié)合DNA或蛋白質(zhì)的分子區(qū)中的氨基酸替代、缺失或者加入。能夠破壞活性的改變的實例為參與催化或結(jié)合相互作用的關(guān)鍵氨基酸的缺失或替代，改變參與催化和/或結(jié)合相互作用的位點(diǎn)所需的三維結(jié)構(gòu)的氨基酸加入，或者導(dǎo)致移碼從而破壞所需三維結(jié)構(gòu)的核苷酸加入或缺失?？梢允褂贸Ｒ?guī)分子技術(shù)，如PCR,使用寡核苷酸等等產(chǎn)生突變(例如,見Sambrook,Maniatis和Fritsch)。還可以從細(xì)胞群體分離自然發(fā)生的突變(見，例如，Sambrook, Maniatis和Fritsch)。
“肽”指含有通過肽鍵連接的至少兩個氨基酸的分子?！岸嚯摹敝负型ㄟ^肽鍵連接的至少10個氨基酸的分子，“蛋白質(zhì)”指含有至少20個氨基酸的分子。
“編碼BORIS的無功能突變形式的多核苷酸”指與人(SEQ ID NO:1)或小鼠(SEQID NO:3)B0RIS多核苷酸具有至少50%、60%或70%序列同一性，更可能與人(SEQ ID NO:1)或小鼠(SEQ ID NO:3)B0RIS 多核苷酸具有 75%、80%、90%、95%或96%、97%、98%或99%序列同一'丨生的多核苷酸。
“無功能突變BORIS肽、多肽或蛋白質(zhì)”指BORIS分子，其不能執(zhí)行野生型BORIS分子的關(guān)鍵活性任一種，如DNA結(jié)合、父本DNA-甲基化模式的重建，等等?！盁o功能突變BORIS肽、多肽或蛋白質(zhì)”與人(SEQ IDNO:I)或小鼠(SEQ ID NO:2)BORIS肽、多肽或蛋白質(zhì)具有至少50%、60%或70%序列同一性，更可能與人(SEQ ID NO:2)或小鼠(SEQ ID NO:4)BORIS肽、多肽或蛋白質(zhì)具有75%、80%、90%、95%或96%、97%、98%或99%序列同一性。
無功能突變的BORIS分子被識別為僅在經(jīng)轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的非自身抗原并且用作抗原來克服現(xiàn)有技術(shù)的限制。BORIS的突變形式用作理想的非毒性疫苗，因為它應(yīng)該不具有它的DNA結(jié)合活性和/或自然功能導(dǎo)致的不希望的副作用。換句話說，用于接種的突變BORIS沒有功能活性并且僅作為免疫原(抗原)存在。不像其他腫瘤特異抗原，BORIS不在婦女中的正常組織中表達(dá)。此外，盡管BORIS在男人中正常睪丸的青春期發(fā)育期間表達(dá)，但是引入和/或表達(dá)無功能突變的BORIS應(yīng)該無害，因為睪丸是免疫特權(quán)組織(免疫細(xì)胞不可及)。換句話說，免疫后產(chǎn)生的抗-BORIS免疫應(yīng)答對于正常細(xì)胞沒有危險并且BORIS疫苗不誘導(dǎo)自身免疫。此外，保證了產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答，因為不像其他腫瘤特異抗原，BORIS被識別為外來抗原。BORIS特異T細(xì)胞沒有在胸腺中缺失并且將突變BORIS識別為非自身抗原并且產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
在一個實施方案中，通過RT-PCR對從小鼠或者人睪丸分離的mRNA產(chǎn)生編碼小鼠BORIS的cDNA(mBORIS)。將該分子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失并用已知在產(chǎn)生單鏈Fv結(jié)構(gòu)域抗體中工作良好的小間隔區(qū)代替。通過自動化核苷酸序列分析證實正確的序列。所得分子缺少IlZF結(jié)構(gòu)域并且由通過18個氨基酸的間隔區(qū)連接C-末端區(qū)(氨基酸573-636)的mB0RIS(氨基酸1-258)的N-末端區(qū)組成。
將突變cDNA克隆到pORF載體中處于hEFl_HTLV啟動子控制下，然而，可以使用其他表達(dá)載體。這里，所突變的cDNA有效連接能夠?qū)е略谒拗骷?xì)胞中表達(dá)的啟動子和/或調(diào)節(jié)分子?？梢允褂貌《据d體，包括ct -病毒DNA或者RNA載體、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒(見Vasilevko, V.等人(2003)Clin.Exp.Metastas.20:489-98.；Leitner,ff.W.等人(2003)NatMed 9:33-39 ；Ribas, A 等人(2002) Curr.Gene Ther 2:57-78)。
除了上面的，本發(fā)明還包括使用編碼無功能突變的BORIS分子的病毒樣顆粒，如來自腺病毒、人乙型肝炎、人丙型肝炎、痘苗病毒、多瘤病毒(polyoviurs)等等的病毒樣顆粒。來自不同病毒的重組病毒蛋白質(zhì)具有自組裝成病毒樣顆粒(VLP)的有用性質(zhì)。這些顆粒不含有病毒核酸并且因此是非復(fù)制的、非感染的并且保持構(gòu)象正確的抗原表位。已經(jīng)在許多實驗系統(tǒng)，如哺乳動物細(xì)胞、桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞、酵母、大腸桿菌、無細(xì)胞系統(tǒng)和轉(zhuǎn)基因植物中顯示了 VLP產(chǎn)生。重要的是，用VLP接種不僅產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答而且產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答。VLP感染專職APC并且隨后誘導(dǎo)保護(hù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答，包括CD4+Thl (幫助⑶8+T細(xì)胞的⑶4+T細(xì)胞類型)和⑶8+CTL應(yīng)答。從而，VLP已經(jīng)清楚地揭示了激活細(xì)胞免疫應(yīng)答(T細(xì)胞應(yīng)答)的罕見能力。VLP用作預(yù)防性疫苗的潛力當(dāng)前正在許多不同臨床試驗中評估。來自這些試驗的結(jié)果是令人鼓舞的，在每個試驗中都報導(dǎo)了極佳的耐受性和高免疫原性。產(chǎn)生由截短的BORIS抗原組成的VLP疫苗將促進(jìn)誘導(dǎo)針對表達(dá)該腫瘤結(jié)合抗原的癌細(xì)胞的強(qiáng)烈細(xì)胞免疫 應(yīng)答。乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)和VSV是適宜的VLP的實例。
為了產(chǎn)生更穩(wěn)固的細(xì)胞免疫應(yīng)答，將截短的或者突變的mBORIS與分子佐劑如B7共刺激分子、防衛(wèi)素2/3、MIP α 3、IFN Y、細(xì)胞因子、趨化因子等融合后克隆到載體中。其他適宜的分子佐劑在下表中列出。
權(quán)利要求
1.免疫原性組合物，其包含選自由編碼印記位點(diǎn)調(diào)節(jié)物兄弟(BORIS)蛋白質(zhì)、多肽或肽的非功能性突變形式的多核苷酸，非功能性突變的BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽，表達(dá)非功能性突變的BORIS肽、多肽和蛋白質(zhì)的樹突細(xì)胞構(gòu)成的組的成員，上述非功能性突變BORIS具有缺少全部11個鋅指結(jié)構(gòu)域的特征和蛋白質(zhì)、多肽或肽具有免疫原的特征。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的組合物，其中所述非功能性突變的BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽缺少全部11個鋅指結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合性質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的組合物，其中所述蛋白質(zhì)、多肽或肽連接到可藥用載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1-3任一項的組合物，其中所述BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽連接到蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1-3任一項的組合物，其中所述非功能性突變BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽連接到修飾BORIS的肽并且保持或增強(qiáng)所述BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽抗原性。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1的組合物，其中用編碼突變BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽的DNA轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞以表達(dá)所述非功能性突變的BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1的組合物，其中用編碼非功能性突變BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽的病毒載體感染樹突狀細(xì)胞以表達(dá)所述非功能性突變的BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1的組合物，其中包括應(yīng)用所述突變的BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽裝載所述樹突細(xì)胞以表達(dá)BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1的免疫原性組合物,其中還包含佐劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9的免疫原性組合物，其中所述佐劑與編碼非功能性突變BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸，或者突變BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽混合或融合。
11.根據(jù)權(quán)利要求
9的免疫原性組合物，其中所述佐劑選自細(xì)胞因子、趨化因子和共刺激分子。
12.載體，其包含編碼BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽的非功能性突變形式的多核苷酸，所述的非功能性突變體BORIS具有缺少全部11個鋅指結(jié)構(gòu)域的特征。
13.權(quán)利要求
12的載體，其中所述載體允許在細(xì)菌、哺乳動物、酵母或者病毒系統(tǒng)中表達(dá)。
14.針對乳腺癌的疫苗，其包含編碼BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽的非功能性突變形式的多核苷酸，上述非功能性突變BORIS具有缺少全部11個鋅指結(jié)構(gòu)域的特征。
15.根據(jù)權(quán)利要求
14的疫苗，其還包含佐劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求
14的疫苗，其還包含可藥用載體。
17.編碼BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽的非功能性突變形式的多核苷酸，非功能性突變的BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽，以及表達(dá)非功能性突變的BORIS分子的樹突細(xì)胞在制備預(yù)防或治療哺乳動物乳腺癌的藥物中的用途，所述非功能性突變BORIS具有缺少全部11個鋅指結(jié)構(gòu)域的特征。
18.根據(jù)權(quán)利要求
17的用途，其中編碼非功能性突變BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽的所述多核苷酸，非功能性突變的BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽，表達(dá)非功能性突變的BORIS分子的樹突細(xì)胞與分子佐劑混合或融合。
19.根據(jù)權(quán)利要求
18的用途，其中所述分子佐劑是增加細(xì)胞免疫應(yīng)答和/或抗體應(yīng)答的分子。
20.根據(jù)權(quán)利要求
18的用途，其中所述分子佐劑選自任意細(xì)胞因子、趨化因子、共刺激分子。
21.根據(jù)權(quán)利要求
17的用途，其中所述藥物適用于肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)鼻、直腸、陰道或腹膜的途徑進(jìn)行施用。
22.根據(jù)權(quán)利要求
17的用途，其中所述哺乳動物患有癌癥。
23.根據(jù)權(quán)利要求
17的用途，其中所述哺乳動物沒有患癌癥。
24.根據(jù)權(quán)利要求
17的用途，其中所述哺乳動物沒有癌癥，但是具有對癌癥的遺傳易感性。
25.根據(jù)權(quán)利要求
17的用途，其中所述哺乳動物沒有可檢測的癌癥，但是希望保護(hù)他自己免于可能產(chǎn)生惡性腫瘤。
26.根據(jù)權(quán)利要求
17-25任一項的用途，其中所述預(yù)防起因于引起包含T細(xì)胞的細(xì)胞免疫應(yīng)答，所述T細(xì)胞識別來自非功能性突變的BORIS肽、多肽或蛋白質(zhì)。
27.樹突細(xì)胞，其表達(dá)非功能性突變的BORIS肽、多肽、或蛋白質(zhì)，該非功能性突變體BORIS具有缺少全部11個鋅指結(jié)構(gòu)域的特征。
28.樹突細(xì)胞，其裝載非功能性突變的BORIS肽、多肽、或蛋白質(zhì)，該非功能性突變體BORIS具有缺少全部11個鋅指結(jié)構(gòu)域的特征。
專利摘要
描述了編碼印記位點(diǎn)調(diào)節(jié)物兄弟(BORIS)分子的無功能突變形式的多核苷酸，無功能突變的BORIS蛋白質(zhì)、多肽或肽和BORIS的經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)形式。這些分子用作針對癌癥的治療性疫苗。
文檔編號C12N5/0784GKCN1871025 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200480031413
公開日2013年6月5日 申請日期2004年8月25日
發(fā)明者M·G·阿加德簡炎, A·古其科炎 申請人:楊啟明導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1),