專利名稱:富含胰島素樣生長(zhǎng)因子的鹿茸納米化制品及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于鹿茸提取物的醫(yī)用或食用制品領(lǐng)域。更具體地來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及由富 含胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)的鹿茸提取物制成的納米化制品。另外，本發(fā)明還涉及制備 該鹿茸納米化制品的方法，以及該制品在藥品、食品、保健品和化妝品等方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鹿茸(鹿尚未骨化的幼角)和鹿角作為傳統(tǒng)的中藥材，具有強(qiáng)筋健骨、補(bǔ)腎壯陽(yáng)、 疏通督脈等功效，自古以來(lái)就被廣泛應(yīng)用于配制成為各種滋補(bǔ)藥品、食品、保健品和化妝 品。通過(guò)現(xiàn)代藥物化學(xué)研究分析，鹿茸中含有許多種生理活性成分，包括磷脂、生物胺類化 合物、前列腺素、維生素、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、不飽和脂肪酸、皮質(zhì)醇等。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)高速 發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)鹿茸中除了含有上述各種生理活性成分之外，其中還含有胰島素樣生長(zhǎng)因 子(IGF-I)、胰島素、人生長(zhǎng)激素(HGH)、促生長(zhǎng)釋放因子(GHRF-6)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、表 皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維生長(zhǎng)因子(FGF)等大分子活性蛋白質(zhì)。以上各種活性成分，尤其 是各種活性蛋白質(zhì)，相互協(xié)同作用，發(fā)揮功效。其中，胰島素樣生長(zhǎng)因子起著尤為突出的作 用。IGF-I具有促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用，能夠用于治療和預(yù)防碳水化合物等能源代謝調(diào)節(jié)紊亂 等方面的疾病，如治療和預(yù)防糖代謝或脂肪代謝等方面的疾病，如糖尿病等。中國(guó)專利申請(qǐng) CN1251531A公開(kāi)了可以利用IGF-I誘導(dǎo)或提高組織生長(zhǎng)、增殖或再生的方法，尤其是利用 IGF-I促進(jìn)內(nèi)耳組織的生長(zhǎng)；中國(guó)專利申請(qǐng)CN1204263A披露了可以利用IGF-I治療腦或脊 髓神經(jīng)的退行性疾病，如阿爾茲海默癥(Alzheimer's Disease)、帕金森氏癥(Parkinson's Disease)等。在治療糖尿病方面，也有大量文獻(xiàn)披露了利用IGF-I治療I型、II型和胰島 素耐藥性糖尿病等方面的實(shí)踐(參見(jiàn)中國(guó)專利申請(qǐng)CN1387440A、CN1384201A等)。
在傳統(tǒng)的鹿茸加工過(guò)程中，鹿茸直接粉碎后服用，顆粒較大，造成吸收效率低下； 有時(shí)，鹿茸的加工需要經(jīng)過(guò)加熱煎煮、烘干等步驟，高溫會(huì)使其中的IGF-I等蛋白質(zhì)變性， 從而降低乃至喪失它們的功效。另一種傳統(tǒng)的加工方式是將鹿茸浸泡在高濃度酒精含量的 酒中，制成藥酒服用。但是由于酒中含有高濃度的作為有機(jī)溶劑的酒精，會(huì)使IGF-I等蛋白 質(zhì)變性，而且從大顆粒鹿茸中也不利于溶解出IGF-I等蛋白質(zhì)，因而會(huì)導(dǎo)致IGF-I等蛋白質(zhì) 被破壞，使得鹿茸的使用效率低下，造成資源浪費(fèi)。另外，高濃度酒精含量的藥酒也限制了 每次的服用量。
為了提高鹿茸材料的使用效率，人們嘗試了各種方法提取鹿茸的有效成分。例如， 國(guó)際專利申請(qǐng)W02004/035069A披露了一種用于預(yù)防和治療糖尿病的鹿角制品及其制備方 法，但是每1克該制品中僅僅含有18ng IGF-I和0. 5ng胰島素。中國(guó)專利CN1241943C公 開(kāi)了一種鹿茸制品的提取方法，但是其中提取出的物質(zhì)沒(méi)有提示可以經(jīng)過(guò)納米化包裹等修 飾處理，口服時(shí)要面對(duì)胃腸道的吸收屏障和消化系統(tǒng)的蛋白水解酶降解的難題，造成IGF-I 等有效成分的實(shí)際吸收效率的低下。
人們也嘗試各種方法提取鹿茸的有效成分，制備成各種有利于吸收的制品，尤其 是制備成納米化的制品，從而提高鹿茸材料的吸收效率。例如，中國(guó)專利申請(qǐng)CN1723992A就公開(kāi)了一種用特定方式制備的含有納米級(jí)鹿茸粉和核桃仁粉等成分的制品，作為抗疲勞 和增強(qiáng)免疫力的保健品。但是，該制品在制備的過(guò)程中，鹿茸需要用乙醇溶劑進(jìn)行萃取，由 于酒精是一種有機(jī)溶劑，對(duì)IGF-I等水溶性蛋白質(zhì)萃取效率低，而且容易使這些蛋白質(zhì)變 性，破壞了 IGF-I等蛋白質(zhì)的功效，造成制成品中IGF-I等蛋白質(zhì)的活性低，影響了使用效 果。中國(guó)專利CN1166369C公開(kāi)了一種使用水、植物油和/或動(dòng)物油將鹿茸或鹿角制成粒徑 為10 IOOOnm的膠體狀液或混懸液，但是在制備過(guò)程中對(duì)鹿茸的所有粉碎物進(jìn)行納米化 處理，沒(méi)有去除其中大量不能為人體所吸收的角質(zhì)成分，而且使用植物油或動(dòng)物油將不能 充分提取IGF-I等水溶性蛋白質(zhì)，使該制品中IGF-I的實(shí)際含量低，而且這種納米化的顆粒 并不能有效避免消化系統(tǒng)的蛋白水解酶的降解。
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期艱苦的研究，本發(fā)明人獲得了一種新的富 含胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)的鹿茸提取物及其納米化制品，克服了上述缺陷。本發(fā)明的 制品不但I(xiàn)GF-I的含量高并保持了高活性，充分利用了鹿茸資源，而且納米化的制品可以 帶來(lái)一定的促滲作用，有助于克服胃腸道的吸收屏障和酶屏障的問(wèn)題。此外，該制品的制備 工藝合理，便于在大規(guī)模生產(chǎn)中控制質(zhì)量，而且制備過(guò)程使用天然原材料，可以生物降解， 避免了人工合成產(chǎn)品的污染，更容易為消費(fèi)者接受。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種由鹿茸提取物制成的納米化制品及其制備方法，所述提取物富 含胰島素樣生長(zhǎng)因子。本發(fā)明還提供了該納米化制品在制備藥品、食品、保健品和化妝品中 的應(yīng)用。
在第一方面，本發(fā)明提供了一種由鹿茸提取物制成的納米化制品，其包含粒徑為 IiTlOOO納米(nm)的納米囊球，而且所述提取物中胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)的含量為 10(Γ10000納克/克。本發(fā)明的制品中的提取物的IGF-I含量為10(Γ 0000納克/克提 取物，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他已知鹿茸提取物的IGF-I含量，優(yōu)選所述IGF-I含量為lOOCTeOOOng/ 克，更優(yōu)選為150(T4500ng/克。而且本發(fā)明的制品所述制品中的納米囊球的粒徑優(yōu)選為 IO^lOOOnm,更優(yōu)選為 2(T800nm，更優(yōu)選為 4(T400nm。
所述制品可以通過(guò)以下兩個(gè)步驟來(lái)獲得首先從鹿茸中用溶劑提取出富含IGF-I 的提取物；然后將上述提取物制備成納米化制品。本發(fā)明優(yōu)選選用新鮮鹿茸或冷藏的新鮮 鹿茸作為原材料，有利于最大限度地保存IGF-I等活性成分的含量和活性。本文中所用的 術(shù)語(yǔ)“新鮮”指的是采集鹿茸后6小時(shí)內(nèi)就開(kāi)始進(jìn)行加工制備本發(fā)明的納米化制品或進(jìn)行 冷藏了，優(yōu)選加工或冷藏不遲于采集后的3小時(shí)，更有選不遲于1小時(shí)，最優(yōu)選不遲于20分 鐘。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“冷藏”指的是將鹿茸保存于0°C以下的環(huán)境中，優(yōu)選保存于-20°C 的環(huán)境中。
本發(fā)明優(yōu)選將水作為溶劑，提取出IGF-I含量為lOCTlOOOOng/克的提取物，優(yōu)選 IGF-I含量為lOOCTeOOOng/克，更優(yōu)選為150(T4500ng/克。而納米化制品的產(chǎn)生可以采用 超音速射流法或聚合物包裹法來(lái)制備納米級(jí)的顆?；蚰仪?。優(yōu)選本發(fā)明的制品為納米級(jí)的 囊球，其采用聚合物包裹鹿茸提取物形成納米級(jí)的囊球。合適的聚合物有用單體合成的聚 合物和脂肪族類聚酯類聚合物。用單體合成的聚合物的單體實(shí)例有丙烯酰胺、丙烯酸酯和 氰基丙烯酸烷基酯及它們的衍生物。由于多為人工合成，該類許多聚合物不能為生物降解， 因此本發(fā)明的制品優(yōu)選包含具有良好的可生物降解的脂肪族類聚酯類聚合物，由此形成納米級(jí)的囊球。這類聚合物的實(shí)例有聚乳酸(PLA)、聚乙交酯(PLG)、聚乙交酯丙交酯共聚物 (PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、多聚氨基酸及它們的衍生物等，優(yōu)選多聚氨基酸。其他優(yōu)選的實(shí)例 是一些天然高分子聚合物及它們的衍生物，可選的天然高分子聚合物有白蛋白、殼聚糖、葡 聚糖、海藻酸鹽等，它們具有良好的可生物降解的性質(zhì)，分散后可形成納米囊球包裹活性成 分。
本發(fā)明的納米化制品特別優(yōu)選含有粒徑為10(T400nm的納米囊球。在一個(gè)具體 實(shí)施方式中，本發(fā)明的納米化制品中含有殼聚糖，使用殼聚糖包裹鹿茸提取物，形成粒徑為 10(T400nm的納米囊球。殼聚糖包裹的鹿茸提取物除了對(duì)其中肽類物質(zhì)具有一定的促滲透 作用，而且由于殼聚糖具有較前的粘膜粘附特性，也能抑制一定的蛋白酶降解，防止IGF-I 等有效成份在吸收前就被降解。此外，在殼聚糖中綴和蛋白酶抑制劑，如EDTA等金屬蛋白 酶抑制劑，也可以降低蛋白酶的降解作用。因此，本發(fā)明的含有殼聚糖的納米化制品尤其適 合進(jìn)一步加工成口服制品，如口噴劑、片齊U、膠囊劑等。
本發(fā)明的納米化制品還優(yōu)選含有粒徑為5(Tl50nm的納米囊球。在一個(gè)具體實(shí)施 方式中，本發(fā)明的納米化制品中含有多聚氨基酸，使用多聚氨基酸包裹鹿茸提取物，形成粒 徑為5(Tl50nm的納米囊球。多聚氨基酸可以選自多聚賴氨酸以及由亮氨酸和谷氨酸組成 的聚氨基酸(參見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)W096/029991A)。
本發(fā)明的納米化制品除了含有上述鹿茸提取物和聚合物包裹材料之外，還可以進(jìn) 一步包含藥學(xué)上可接受的輔劑，從而加工各種劑型。藥學(xué)上可接受的輔劑包括藥學(xué)上可接 受的載體、賦形劑、稀釋劑等，它們與活性成分相容。運(yùn)用藥學(xué)上可接受的輔劑制備制劑對(duì) 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。本發(fā)明的制劑包含一種或多種本發(fā)明第一個(gè)方面所 述的納米化制品作為活性成分，將該納米化制品和藥學(xué)上可接受的輔劑(如本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員所熟知的載體、賦形劑、稀釋劑等)組合在一起，配制成各種制劑，優(yōu)選為固體制劑 和液體制劑。優(yōu)選本發(fā)明的制劑為單位劑量形式，如片劑、丸劑、膠囊(包括持續(xù)釋放或延 遲釋放形式)、粉劑、混懸劑、顆粒劑、酊劑、糖漿劑、乳液劑、懸浮液、針劑等劑型，從而適合 各種給藥形式，例如口服、非腸道注射、粘膜、肌肉、靜脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)過(guò)皮膚等 的給藥形式。本發(fā)明的納米化制品特別優(yōu)選制成口噴劑、膠囊劑或注射劑。其中載體、賦形 劑、稀釋劑是藥學(xué)上可接受的并與活性成分相容?？梢赃x用的合適的賦形劑優(yōu)選但不僅限 于水、生理鹽水、葡萄糖，甘油、乙醇或其類似物及其組合。
在第二方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的納米化制品在制備促進(jìn)細(xì)胞增殖的 藥品、保健食品和/或化妝品中的應(yīng)用。本發(fā)明的納米化制品由富含IGF-I的鹿茸提取物 制成，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖的作用，可用于誘導(dǎo)或提高患者的組織生長(zhǎng)、增殖或再生的 水平，治療相應(yīng)疾病，例如腦或脊髓神經(jīng)的退行性疾病，如阿爾茲海默癥、帕金森氏癥等。由 于是天然制品，而且鹿茸本身有著悠久的使用歷史，健康人服用一定量的本發(fā)明的納米化 制品有助于維持其正常的細(xì)胞分裂、增殖作用，有助于保持其充沛的活力。健康人外用一定 量的本發(fā)明的納米化制品有助于維持其皮膚細(xì)胞的分裂、增殖，改善外部形象，具有美容的 作用。
在第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的納米化制品在制備治療和/或預(yù)防 碳水化合物代謝調(diào)節(jié)紊亂的藥品和/或保健食品中的應(yīng)用。本發(fā)明的納米化制品由富含 IGF-I的鹿茸提取物制成，能夠用于治療和/或預(yù)防碳水化合物等能源代謝調(diào)節(jié)紊亂等方面的疾病或亞健康狀態(tài)，如治療和預(yù)防糖代謝或脂肪代謝等方面的疾病，特別是糖尿病，包 括I型、II型和胰島素耐藥性糖尿病等。
對(duì)于本發(fā)明第二和第三方面的藥品來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的納米化制品可以加工成各種藥 物劑型，對(duì)需要促進(jìn)細(xì)胞增殖或者需要治療和/或預(yù)防碳水化合物代謝調(diào)節(jié)紊亂的患者給 藥。給藥的劑量和形式一般由醫(yī)師根據(jù)患者的具體情況(如年齡、體重、性別、病情、患病 時(shí)間、身體狀況等)確定。一般而言，以納米化制品中的IGF-I計(jì)，給藥的劑量為0. 001 100mg/kg患者體重，優(yōu)選為0. 01 lmg/kg，優(yōu)選為0. 02 0. lmg/kg.給藥形式可以根據(jù) 各種藥物制劑的劑型來(lái)確定，適合的給藥形式有口服、非腸道注射、粘膜、肌肉、靜脈內(nèi)、皮 下、眼內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)過(guò)皮膚等給藥形式，優(yōu)選使用口噴劑或膠囊劑口服給藥。
在本發(fā)明第二和第三方面的應(yīng)用中，本發(fā)明的納米化制品可以單獨(dú)作為藥品、保 健食品和/或化妝品使用，也可以添加到其他藥品、保健食品和/或化妝品中使用。例如， 本發(fā)明的納米化制品可以添加到常規(guī)的飲料、食品或化妝品中配合應(yīng)用。
在第四方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的納米化制品的制備方法。該制備方 法可以包括以下兩個(gè)步驟首先從鹿茸中提取富含IGF-I的提取物；然后將上述提取物制 備成納米化制品。該制備方法優(yōu)選包括下列步驟
a)用水浸提粉碎的鹿茸，分離出分子量為50(T500000Da的水溶性提取物，冷凍干 燥；
和b)用可生物降解的聚合物將步驟a)所得的提取物包裹成納米囊球。
其中，步驟a)中粉碎鹿茸的步驟可包括切片、勻漿、超聲波破碎等方式中的一種 或幾種?！扒衅敝傅氖菍⒙谷字瞥杀∑?，優(yōu)選使用切片機(jī)將新鮮鹿茸或冷藏的新鮮鹿茸切 成厚度為廣5mm的薄片?！皠驖{”指的是將鹿茸粉碎至沒(méi)有大的組織塊為止，勻漿過(guò)程中可 以加入適量的去離子水。經(jīng)過(guò)超聲波破碎，能充分使細(xì)胞破裂，該破碎過(guò)程中可以加入適量 的去離子水。粉碎鹿茸的步驟優(yōu)選按次序包括切片、勻漿和超聲波破碎步驟，也可以省略其 中的切片步驟。粉碎鹿茸的全過(guò)程最好在低溫環(huán)境中操作，其中使用的試劑也最好是低溫 預(yù)冷的，低溫環(huán)境指在(T20°C的環(huán)境，優(yōu)選(Tl(TC的環(huán)境，最好在4°C。步驟a)中用水浸 提粉碎的鹿茸的步驟可以與粉碎鹿茸的步驟同時(shí)完成，即通過(guò)在切片、勻漿和/或超聲波 破碎等步驟中加入的水來(lái)浸提鹿茸的有效成分，如IGF-I，浸提隨著粉碎步驟的完成而自然 完成；也可以在粉碎鹿茸的步驟后再進(jìn)一步放置一段時(shí)間進(jìn)行浸提，所述時(shí)間如不超過(guò)36 小時(shí)，優(yōu)選放置24小時(shí)，最好能夠放置在低溫環(huán)境中。步驟a)中將水溶性提取物分離出來(lái) 的步驟可以通過(guò)常規(guī)的離心和/或過(guò)濾等方式來(lái)進(jìn)行，如超離心和/或超濾等。該步驟中 優(yōu)選提取分子量為50(T500000Da的成分，更有選提取分子量為lOOiTlOOOOODa的成分，最 優(yōu)選提取分子量為lOOCTlOOOODa的成分。在一個(gè)具體實(shí)施方式
，本發(fā)明先通過(guò)離心去除水 浸提產(chǎn)物中的沉淀，然后選用合適的超濾膜截留相應(yīng)分子量的成分，再加入適當(dāng)量的水溶 解。然后進(jìn)行冷凍干燥，如使用冷凍干燥機(jī)將上步所得的溶有相應(yīng)分子量的成分的水溶液 以-30°C -50°C的干燥機(jī)工作溫度來(lái)進(jìn)行干燥，干燥后產(chǎn)品的含水量為3% -10%。
在步驟b)中，將步驟a)所得的最終產(chǎn)物進(jìn)行納米化，其可以采用超音速射流法或 聚合物包裹法來(lái)制備納米級(jí)的顆?；蚰仪颉！俺羲偕淞鞣ā笔侵甘褂贸羲偕淞髟O(shè)備(如 可購(gòu)自北京納諾生物科技有限公司)將鹿茸提取物形成高速噴射流，并使多股噴射流在粉 碎區(qū)高速互相交匯，產(chǎn)生高速碰撞和研磨，從而形成納米級(jí)的顆粒。本發(fā)明優(yōu)選采用聚合物包裹鹿茸提取物的方式形成納米級(jí)的囊球。其合適的聚合物有用單體合成的聚合物和脂肪 族類聚酯類聚合物。用單體合成的聚合物的單體實(shí)例有丙烯酰胺、丙烯酸酯和氰基丙烯酸 烷基酯及它們的衍生物。制備納米級(jí)囊球的步驟包括將鹿茸提取物與單體一起加入含有乳 化劑(如葡聚糖、聚山梨酸酯等)的酸性水介質(zhì)中，加入聚合引發(fā)劑(通常是陰離子，如OH—) 引發(fā)單體的聚合反應(yīng)，使得鹿茸提取物在聚合反應(yīng)過(guò)程中包埋進(jìn)納米級(jí)囊球中。由于單體 多為人工合成，該類許多聚合物不能為生物降解，因此本發(fā)明的制品優(yōu)選包含具有良好的 可生物降解的脂肪族類聚酯類聚合物，由此形成納米級(jí)的囊球。這類聚合物的實(shí)例有聚乳 酸(PLA)、聚乙交酯(PLG)、聚乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、多聚氨基酸及 它們的衍生物等，其他優(yōu)選的實(shí)例是一些天然高分子聚合物及它們的衍生物，可選的天然 高分子聚合物有白蛋白、殼聚糖、葡聚糖、海藻酸鹽等，它們具有良好的可生物降解聚乳酸， 分散后可形成納米囊球包裹活性成分。這類聚合物可以采用后分散法包裹鹿茸提取物，具 體的實(shí)例有采用溶劑蒸發(fā)或自發(fā)乳化/溶劑擴(kuò)散等方式進(jìn)行包裹。溶劑蒸發(fā)法指，將聚合 物和鹿茸提取物溶于有機(jī)溶劑中，將有機(jī)溶劑加到含有乳化劑的水體系中進(jìn)行乳化，然后 通過(guò)加溫、減壓或連續(xù)攪拌等方式把有機(jī)溶劑蒸發(fā)除去，形成聚合物納米囊球的水分散體 系。自發(fā)乳化/溶劑擴(kuò)散法指，用親水性有機(jī)溶劑和疏水性有機(jī)溶劑形成的混合溶劑溶解 聚合物和鹿茸提取物，將其分散到水中，由于親水性有機(jī)溶劑會(huì)自動(dòng)從油相擴(kuò)散到水相，從 而形成納米囊球。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的制備方法中使用的聚合物為殼聚糖，即 使用殼聚糖包裹鹿茸提取物，形成粒徑為10(T400nm的納米囊球。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的制備方法中使用的聚合物為多聚氨基酸，即使用多聚氨基酸包裹鹿茸提取物， 形成粒徑為5(Tl50nm的納米囊球。多聚氨基酸可以選自多聚賴氨酸和由亮氨酸和谷氨酸 組成的聚氨基酸。
本發(fā)明引用了公開(kāi)文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容 均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過(guò)一樣。
為了便于理解，以下將通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指 出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說(shuō)明書(shū)的論 述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見(jiàn)了。
本發(fā)明的實(shí)施例
實(shí)施例1，鹿茸有效成分的提取
取新鮮鹿茸0. 5kg，用冷凍切片機(jī)將鹿茸切成厚度為廣2mm的切片，然后加入適量 (200mL)預(yù)冷的去離子水在4°C用勻漿機(jī)進(jìn)行粉碎，勻漿操作進(jìn)行至勻漿中沒(méi)有大的組織 塊時(shí)結(jié)束。然后向初步粉碎的產(chǎn)物中加入IL預(yù)冷的去離子水，混勻后在冰浴條件下進(jìn)行超 聲波破碎。然后將該破碎后的懸濁液以5000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)離心20分鐘，留上清液待用。 離心后的沉淀物加入IL預(yù)冷的去離子水，震蕩均勻后在冰浴條件下進(jìn)行超聲波破碎，然后 再以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，留上清液待用。離心后的沉淀物再重復(fù)上述步驟，加入水、 超聲波處理、離心后，留上清液待用。將以上步驟中獲得的3份上清液混合在一起，接著進(jìn) 行2次超濾。首次超濾用截留分子量為IOOOOODa的超濾膜(購(gòu)自Millopore，Ultrapore)， 保留濾出液。然后將濾出液用截留分子量為IOOODa(購(gòu)自Millopore，Ultrapore)的超濾 膜進(jìn)行超濾，棄去濾出液。用200mL預(yù)冷的去離子水溶出超濾膜截留的物質(zhì)，保留溶出液待 用。將經(jīng)過(guò)第一次溶出步驟的超濾膜再用200mL預(yù)冷的去離子水溶出，棄去超濾膜，合并所得的兩次溶出液。使用冷凍干燥機(jī)在-3(T-5(TC冷凍干燥溶出液，得干燥后的粗產(chǎn)品22克， 其中該粗產(chǎn)品的含水量不超過(guò)8 %。
用IGF-1ELISA檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司，產(chǎn)品目錄號(hào)DG100)來(lái) 檢測(cè)以上提取過(guò)程得到的粗產(chǎn)品中的IGF-I含量。精確稱取IOmg粗產(chǎn)品，溶于Iml去離子 水中，根據(jù)廠商的試劑盒操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)，從標(biāo)準(zhǔn)IGF-I檢測(cè)曲線上讀出含量，上述每克粗 產(chǎn)品中IGF-I的含量為2384納克(ng)。
實(shí)施例2，鹿茸有效成分的提取
使用與實(shí)施例1相似的步驟進(jìn)行提取。所用步驟與實(shí)施例1不同的地方主要在于 使用冷藏于-20°C的鹿茸；以及在冰浴條件下進(jìn)行超聲波破碎后，靜止放置懸濁液24小時(shí)， 以充分溶出活性成分。具體過(guò)程如下新鮮鹿茸采集后冷藏于-20°C冰箱10天，取該鹿茸 0. 5kg，用冷凍切片機(jī)將鹿茸切成厚度為廣2mm的切片，然后加入適量水在4°C用勻漿機(jī)進(jìn) 行粉碎。然后向初步粉碎的產(chǎn)物加入IL預(yù)冷的去離子水，混勻后在冰浴條件下進(jìn)行超聲波 破碎。然后將該破碎后的懸濁液靜止放置24小時(shí)，以充分溶出活性物質(zhì)。接著，將懸濁液 以5000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)離心20分鐘，留上清液待用。離心后的沉淀物加入IL預(yù)冷的去離 子水，震蕩均勻后再以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，留上清液待用。離心后的沉淀物再重復(fù) 上述步驟，加入水、混勻、離心后，留上清液待用。將以上步驟中獲得的3份上清液混合在一 起，接著進(jìn)行2次超濾。首次超濾用截留分子量為IOOOOODa的超濾膜，保留濾出液。然后 將濾出液用截留分子量為IOOODa的超濾膜進(jìn)行超濾，棄去濾出液。用200mL預(yù)冷的去離 子水溶出超濾膜截留的物質(zhì)，保留溶出液待用。將經(jīng)過(guò)第一次溶出步驟的超濾膜再用200mL 預(yù)冷的去離子水溶出，棄去超濾膜，合并所得的兩次溶出液。使用冷凍干燥機(jī)在-3(T-5(TC 冷凍干燥溶出液，得干燥后的粗產(chǎn)品24克，其中該粗產(chǎn)品的含水量不超過(guò)8%。
用IGF-1ELISA檢測(cè)試劑盒來(lái)檢測(cè)以上提取過(guò)程得到的粗產(chǎn)品中的IGF-1含量，測(cè) 得上述每克粗產(chǎn)品中IGF-I的含量為1832ng。
實(shí)施例3，鹿茸有效成分的提取
使用與實(shí)施例1相同的步驟將新鮮鹿茸0. 5kg切片、超聲波破碎，然后進(jìn)行2次 超濾。首次超濾用截留分子量為IOOOODa(購(gòu)自Millopore，Ultrapore)的超濾膜，保留濾 出液。然后將濾出液用截留分子量為IOOODa的超濾膜進(jìn)行超濾，棄去濾出液。用200mL 預(yù)冷的去離子水溶出超濾膜截留的物質(zhì)，保留溶出液待用。將經(jīng)過(guò)第一次溶出步驟的超濾 膜再用200mL預(yù)冷的去離子水溶出，棄去超濾膜，合并所得的兩次溶出液。使用冷凍干燥 機(jī)在-3(T-5(TC冷凍干燥溶出液，得干燥后的粗產(chǎn)品10克，其中該粗產(chǎn)品的含水量不超過(guò) 8%。
用IGF-1ELISA檢測(cè)試劑盒來(lái)檢測(cè)以上提取過(guò)程得到的粗產(chǎn)品中的IGF-1含量，測(cè) 得上述每克粗產(chǎn)品中IGF-I的含量為4315ng。
實(shí)施例4，用殼聚糖制備納米化鹿茸制品
取平均相對(duì)分子量為45000的殼聚糖(購(gòu)自浙江大學(xué))120mg和上述實(shí)施例制得 的粗產(chǎn)品5mg，將它們?nèi)芙庥?2mL 醋酸溶液。然后將該殼聚糖醋酸溶液緩慢滴加到 150mL含20%乙醇的司盤(pán)85溶液(購(gòu)自上海化學(xué)試劑公司)中，于40°C減壓抽去水分。然 后將獲得產(chǎn)物以5000rpm離心20分鐘，棄去上清液，沉淀用石油醚洗滌2次。然后向沉淀 加入20毫升水，以超聲波處理，即得殼聚糖包裹的納米囊球懸液。將上述殼聚糖包裹的納米囊球懸液加水稀釋20倍，取適量于銅網(wǎng)上，用2%磷鎢酸鈉進(jìn)行負(fù)染，然后利用透射電子 顯微鏡進(jìn)行觀察，所得的納米囊球的粒徑大小為10(T400nm。重復(fù)以上制備過(guò)程制備，但其 中不加入鹿茸粗產(chǎn)品，由此制得空白納米囊球懸液作為空白對(duì)照。
用IGF-1ELISA檢測(cè)試劑盒來(lái)檢測(cè)以上納米化鹿茸制品的包封率。將適量納米囊 球懸液等分成2份(每份樣品中的IGF-I的投藥量計(jì)為W0)，其中一份用IGF-1ELISA檢測(cè) 試劑盒檢測(cè)游離的和吸附在納米顆粒表面的IGF-I的量(Wl)；另一份用0. 5U/mL殼聚糖酶 (購(gòu)自日本化學(xué)工業(yè)公司)酶解6小時(shí)，然后再用IGF-1ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IGF-I的量 (W2)。根據(jù)包封率=(W2-W1)/W0*100%的公式，測(cè)得的上述產(chǎn)品的包封率為68%。
實(shí)施例5，用多聚氨基酸制備納米化鹿茸制品
將上述實(shí)施例制得的粗產(chǎn)品IOmg溶于12mL pH7. 4的PBS (其中含有0. Olmol/ L磷酸鹽、0. 138mol/L NaCl和0. 0027mol/L KCl)中。取平均相對(duì)分子量為23000的聚 Leu/Glu-50/50 (購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所，其中含50%的亮氨酸和50%的谷氨 酸)50mg，將其分散在上述PBS溶液中，自動(dòng)形成含有納米囊球的膠體分散液(聚氨基酸包 裹的納米化鹿茸制品)。該液體能夠散射光現(xiàn)，而且置于15°C 3小時(shí)后未出現(xiàn)沉淀。取上 述聚氨基酸包裹的納米化鹿茸制品，利用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察，所得的納米囊球的粒 徑大小為5(Tl50nm。
實(shí)施例6，納米化鹿茸制品中的IGF-I活性測(cè)定
用實(shí)施例4制備的納米囊球懸液和空白對(duì)照分別刺激96孔板培養(yǎng)的Balb_3T3細(xì) 胞的增殖。用鼠尾膠原包被96孔培養(yǎng)板，用DMEM稀釋后置冰上待用。30分鐘后，向板孔中 分別加入50yL納米囊球懸液和空白對(duì)照，置孵育箱內(nèi)平衡60分鐘。接著加入50yL MTT, 在37°C孵育4小時(shí)。然后加100 μ L DMS0，溫浴1小時(shí)。由于活細(xì)胞可將四唑鹽轉(zhuǎn)化成可被 DMSO溶解的有色產(chǎn)物，其產(chǎn)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，因此用酶標(biāo)儀在570nm下測(cè)吸光度，即 可估算活細(xì)胞數(shù)。相對(duì)于空白對(duì)照，使用本發(fā)明的納米化鹿茸制品能夠顯著提高Balb-3T3 細(xì)胞的增殖率。
實(shí)施例7，納米化鹿茸制品中的IGF-I抗酶降解活性測(cè)定
用實(shí)施例4制備的納米囊球懸液、胰酶處理過(guò)的納米囊球懸液和空白對(duì)照分別刺 激96孔板培養(yǎng)的Balb-3T3細(xì)胞的增殖。其中，用胰酶37°C處理2小時(shí)，制備得胰酶處理過(guò) 的納米囊球懸液。用與實(shí)施例6相同的實(shí)驗(yàn)步驟檢測(cè)細(xì)胞的增殖效應(yīng)，測(cè)定吸光度。由此 測(cè)得的上述產(chǎn)品經(jīng)酶降解后IGF-I的活性相對(duì)于未經(jīng)酶降解的，仍舊保持81%的活性。
權(quán)利要求
一種由鹿茸提取物制成的納米化制品，其中納米囊球的粒徑為100～400nm，其中含有殼聚糖，而且所述提取物中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的含量為1000～6000ng/克；而且所述納米化制品由包括下列步驟的制備方法制成a)用水浸提粉碎的鹿茸，分離出分子量為500～500000Da的水溶性提取物，冷凍干燥；和b)用殼聚糖將步驟a)所得的提取物包裹成納米囊球。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的納米化制品，其中而且所述提取物中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的含量 為 1500 4500ng/ 克。
3.一種由鹿茸提取物制成的納米化制品，其中納米囊球的粒徑為50 150nm，其中含 有多聚氨基酸，而且所述提取物中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的含量為1000 6000ng/克；而且 所述納米化制品由包括下列步驟的制備方法制成a)用水浸提粉碎的鹿茸，分離出分子量為500 500000Da的水溶性提取物，冷凍干燥；和b)用多聚氨基酸將步驟a)所得的提取物包裹成納米囊球。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3的納米化制品，其中而且所述提取物中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的含量 為 1500 4500ng/ 克。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1-2之任一的納米化制品，其為口噴劑、膠囊劑或注射劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求
3-4之任一的納米化制品，其為口噴劑、膠囊劑或注射劑。
7.權(quán)利要求
1-6之任一的納米化制品在制備促進(jìn)細(xì)胞增殖的藥品、保健食品和/或化 妝品中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求
1-6之任一的納米化制品在制備治療和/或預(yù)防碳水化合物代謝調(diào)節(jié)紊亂 的藥品和/或保健食品中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求
1-6之任一的納米化制品在制備治療和/或預(yù)防糖尿病的藥品和/或保健 食品中的應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種由富含胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)的鹿茸提取物制成的納米化制品，其中所述提取物中IGF-1的含量為100~10000納克/克，而且所述制品中的納米囊球的粒徑為10~1000納米。另外，本發(fā)明還涉及制備該鹿茸納米化制品的方法，以及該制品在藥品、食品、保健品和化妝品等方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/30GKCN101068556 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200680001262
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2006年4月28日
發(fā)明者王利忠 申請(qǐng)人:王利忠導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),