專利名稱:重組金黃色葡萄球菌腸毒素j口服制劑及應(yīng)用的制作方法
重組金黃色葡萄球菌腸毒素J 口服制劑及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程，涉及重組金黃色葡萄球菌腸毒素J (Staphylococcal EnterotoxinJ， SEJ)的制備以及以SEJ主要有效成分的口服制劑的制備和在腫 瘤治療中的應(yīng)用。具體地說，就是利用基因工程方法制備高純度重組金黃色葡 萄球菌腸毒素J蛋白及其相關(guān)蛋白制品，并將其制備成口服制劑，用于腫瘤患 者的治療和康復(fù)。
技術(shù)背景金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal Enterotoxin)由金黃色葡萄球菌產(chǎn) 生。目前已經(jīng)獲得鑒定的腸毒素有二十余種，其中包括經(jīng)典的腸毒素如SEA、 SEB、 SEC、 SED、 SEE等，以及新近發(fā)現(xiàn)的腸毒素SEG SEQ。不同種類腸 毒素分子量為25 33kD不等，各類腸毒素氨基酸序列具有一定的同源性(28 % 98%)，通過蛋白質(zhì)晶體衍射以及計算機三維結(jié)構(gòu)模擬技術(shù)可知，各類腸 毒素的三維結(jié)構(gòu)十分相似，均具有兩個結(jié)構(gòu)域，多數(shù)腸毒素包含一個對維持三 維結(jié)構(gòu)十分重要的二硫鍵。金葡菌腸毒素是一類典型的細(xì)菌性超抗原，能在短時間內(nèi)引起宿主體內(nèi)T 細(xì)胞的大量增殖與活化。研究發(fā)現(xiàn)，腸毒素分子可以以完整分子結(jié)合于抗原提 呈細(xì)胞(Antigen presenting cells, APC)表面的MHC- II類分子的抗原肽結(jié)合溝槽 外側(cè)，進而通過與T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR) V卩區(qū)特異性結(jié)合激活T 細(xì)胞。與普通抗原不同的是，腸毒素不需要同時被TCR分子的Va、 Ja、 J卩、 Vp和D卩等各部分共同識別，也無MHC-II限制性，使得金葡菌腸毒素只需極 低濃度(0.01 10ng/mL)即可激活2 30%的初始T淋巴細(xì)胞，是普通抗原激活 的T細(xì)胞數(shù)量的103 106倍。同時，腸毒素亦能促進受其激活的T細(xì)胞分泌多 種細(xì)胞因子，間接激活B細(xì)胞、NK細(xì)胞，因此金葡菌腸毒素能高效地刺激和 增強免疫應(yīng)答。介于此性質(zhì)，國內(nèi)外對腸毒素超抗原應(yīng)用于腫瘤治療的研究已有大量的文 獻報導(dǎo)。Frank等人將SEB (lOpg/mL)膀胱內(nèi)灌注荷RT112和RT4細(xì)胞小鼠， 六周后約76%的小鼠膀胱內(nèi)腫瘤消失，其余小鼠膀胱內(nèi)的腫瘤細(xì)胞則產(chǎn)生明顯 調(diào)亡現(xiàn)象。Hedlund等人進行的體內(nèi)實驗表明，SEA激活T細(xì)胞使之增殖作用在每只小鼠0.1 —100嗎范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，注射后1天出現(xiàn)最大效應(yīng)，增 殖效應(yīng)維持4天。Litton等人用結(jié)腸癌相關(guān)抗原C242的單抗Fab片段和SEA 制備融合蛋白，證明該融合蛋白在體內(nèi)能夠高效地促進T細(xì)胞和單核細(xì)胞在腫 瘤組織處聚集、滲透，并誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，同時誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞 產(chǎn)生IL-4、 IL-IO、 TNF-a等細(xì)胞因子，并引起癌細(xì)胞IFN-Y受體、Fas受體表 達上調(diào)，從而有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡。Kodama等制備了 SEA的突變體 mSEAD227A，該突變蛋白與天然SEA相比降低了與MHC-II分子的結(jié)合能力， 但未改變對T細(xì)胞的刺激增殖能力。實驗證明家兔對該突變體的耐受力是天然 SEA的500倍。利用該突變蛋白與抗MUC1抗原的單克隆抗體MUSE11制備 融合蛋白，證明該融合蛋白在體內(nèi)和體外均能高效地增強T-LAK細(xì)胞對表達 MUC1的膽管癌細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒作用。在國外，以金葡菌腸毒素及其融合蛋白為主要有效成分的藥物已經(jīng)進入了 臨床研究。如Giantonio等人完成的PNU-214565 (重組SEA與C242單克隆抗 體的Fab片段制備的融合蛋白)的I期臨床實驗表明，患者可能產(chǎn)生的細(xì)胞毒 性與給藥劑量密切相關(guān)，而給藥劑量又取決于患者的體重和血液循環(huán)中抗SEA 抗體濃度。在給藥過程中，76%的患者出現(xiàn)不同程度的體溫升高，62%的患者 出現(xiàn)不同程度的血壓降低，其主要因素是誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-2和TNF，毒副作用 均為暫時性的，容易得到控制。他們發(fā)現(xiàn)，治療開始之前病人體內(nèi)抗SEA抗 體在一定程度上降低了毒副反應(yīng)，通過綜合考慮個體體重與抗SEA抗體濃度， 可以確定一個副作用最小的給藥劑量。Jonathan等人完成了 PNU-214565的第 二代產(chǎn)品PNU-214936的I期臨床實驗，目的為了在非小細(xì)胞肺癌 (non-small-cell lung cancer ， NSCLC)患者身上實現(xiàn)個體化給藥，并使用 Bayesian模型結(jié)合過量劑量控制方法進行劑量放大，確定了該藥的最大耐藥劑 量(MTD)。在我國，以腸毒素C2 (SEC2)為主要有效成分的金葡菌濾液制劑應(yīng)用于 臨床腫瘤治療已逾十年。資料顯示，該類制劑不僅可以顯著增強中晚期腫瘤患 者的機體免疫能力，同時可以減輕因放化療引起的毒副作用，對惡性腫瘤患者 生存期的延長和生存質(zhì)量的改善具有重要的臨床價值和意義。如朱根海等研究 了 56例卵巢上皮癌患者化療后及高聚金葡萄素輔助治療后的機體細(xì)胞免疫狀 態(tài)，治療結(jié)果顯示應(yīng)用高聚生金葡素聯(lián)合化療后，CD4+A:D8+比例、NK細(xì)胞 活性較單純化療顯著提高，同時高聚金葡素聯(lián)合化療組2個療程治療后血中 CA125、 TSGF等惡性腫瘤特異性生長因子降至正常的例數(shù)多于單純化療組，白細(xì)胞或血小板計數(shù)低于正常的例數(shù)少于單純化療組。羅鋒等對35例淺表轉(zhuǎn) 移性腫瘤應(yīng)用高聚生金葡素局部治療，治療一個月后總有效率達82.9%，并證 實經(jīng)高聚生金葡素治療后腫瘤細(xì)胞平均細(xì)胞調(diào)亡率增加(尸O.Ol)。湯煒等對 早期口腔癌采用局部金葡素治療及對晚期口腔癌應(yīng)用金葡素聯(lián)合化療，觀察療 效和病理改變，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用金葡素可使大量淋巴細(xì)胞及纖維組織聚集在癌巢附 近，并能觀察到腫瘤細(xì)胞顯著減少，甚至部分病例腫瘤細(xì)胞消失。吳潔等觀察 了高聚金葡素在食管癌根治性放療期間，對近期療效、胃腸道反應(yīng)、白細(xì)胞變 化以及對全身狀況的輔助作用，結(jié)果顯示與對照組相比，觀察組在放療期間的 胃腸道反應(yīng)、白細(xì)胞數(shù)量變化差異顯著，表明高聚金葡素可明顯升高白細(xì)胞數(shù) 量，減輕胃腸道反應(yīng)。同時，觀察組Kps評分增加W0分的患者占86. 6%， 對照組僅占36.6% (尸<0. 05)，說明高聚金葡素有明顯的改善全身狀況的作用。 但另一方面，由于制劑中含有大量雜質(zhì)蛋白，其中包括多種金葡菌屬的毒素蛋 白，如溶血素、白細(xì)胞殺傷因子、表皮剝落因子等，在應(yīng)用金葡菌濾液注射制 劑用于腫瘤患者治療時，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者使用時普遍出現(xiàn)低熱，低血壓等毒副作 用，同時也會導(dǎo)致注射或灌注部位紅腫、疼痛等癥狀，對腫瘤患者的治療和生 存質(zhì)量產(chǎn)生一定影響。一般認(rèn)為，蛋白質(zhì)以及多肽類物質(zhì)在進入胃腸道以后，胃內(nèi)低pH環(huán)境以 及胃腸道內(nèi)大量存在的胰蛋白酶、糜蛋白酶、多肽酶等多種酶類對蛋白質(zhì)以及 多肽的生物學(xué)活性以及分子的完整性有著非常大的影響，大多數(shù)蛋白以及多肽 類物質(zhì)會很快分解為氨基酸從而被人體吸收利用。目前，對于二肽、三肽等寡 肽分子的胃腸道內(nèi)吸收的研究開展地較為廣泛，在小腸絨毛上皮表面也尋找到 了部分二肽、三肽轉(zhuǎn)運蛋白，上述研究結(jié)果也對傳統(tǒng)的人體內(nèi)蛋白、多肽的分 解、吸收等代謝途徑給予了新的補充，但是，對于完整的蛋白以及多肽分子的 胃腸道吸收的研究仍然處于起步階段，目前也只有極少數(shù)蛋白被推測可能能夠 以完整形式被人體直接吸收利用。目前，對于腸毒素在胃腸道內(nèi)的作用原理和方式的研究開展地并不深入， 對金葡菌腸毒素如何導(dǎo)致食物中毒癥狀以及是否能夠通過口服吸收進而產(chǎn)生 超抗原作用仍未能取得共識。由于給予外源性的IL一2可以模擬產(chǎn)生食物中毒 時的癥狀，因此有學(xué)者認(rèn)為腸毒素引起的食物中毒癥狀可能與其超抗原性質(zhì)有 關(guān)，并猜測腸道上皮細(xì)胞表面存在能夠與腸毒素分子結(jié)合的受體，他們指出腸 道中存在MHC-II+的M細(xì)胞，該類細(xì)胞能夠與腸毒素分子結(jié)合。腸毒素正是 通過該類細(xì)胞產(chǎn)生超抗原作用。但也有研究人員認(rèn)為腸毒素的致嘔吐作用和超抗原作用并無直接聯(lián)系，他們利用氨基酸突變的方法分別找到了對腸毒素分子 的這兩種活性有重要影響的氨基酸殘基，從而猜測胃腸道上皮細(xì)胞表面存在其他種類的受體或轉(zhuǎn)運分子與其發(fā)生相互作用。Hamad等證實了 MHC-I廠的 Caco-2細(xì)胞能夠?qū)EB 實現(xiàn)雙向轉(zhuǎn)運 (Apical—Basolateral ， Basolateral—Apical),并且在轉(zhuǎn)運過程中能夠保持SEB分子的完整性，Shupp 等也利用體外實驗證實了模擬小腸隱窩上皮細(xì)胞的T84細(xì)胞系能對SEA、 SEB 實現(xiàn)單向轉(zhuǎn)運，提示腸毒素分子有可能在穿越胃腸道上皮進入血液循環(huán)系統(tǒng)后 產(chǎn)生超抗原作用。馬海英等將金葡菌濾液制劑經(jīng)灌胃給藥，可使因注射環(huán)磷酰 胺所致的免疫功能低下模型小鼠的細(xì)胞免疫能力和體液免疫功能得到良好的 改善和提高，其中以細(xì)胞免疫功能的改善和提高尤為明顯。需要指出的是，腸 毒素在腸道中未必僅限于以某種單一方式發(fā)揮作用，可能存在更為復(fù)雜的機 理，如Gerburg等人發(fā)現(xiàn)口服給予低劑量腸毒素后雖可以迅速激活大量存在于 腸系膜淋巴節(jié)以及皮氏小節(jié)處的Vp8+T細(xì)胞，但對體循環(huán)系統(tǒng)中的T淋巴細(xì) 胞并無顯著的刺激作用?？梢姼淖兡c毒素給予的劑量和時間與腸毒素在腸道內(nèi) 以及全身的生物學(xué)效應(yīng)存在著微妙的關(guān)系。以金葡菌腸毒素為主要成分的口服抗腫瘤制劑的理論研究和治療應(yīng)用開 展地也較為緩慢，且主要以經(jīng)典腸毒素如SEA、 SEB、 SEC等為研究對象。如 中國專利CN 1509762A公開了一種金葡菌發(fā)酵液中提取代謝產(chǎn)物用于治療和 預(yù)防艾滋病，其中主要成分包括了 SEA、 SEB、 SEC1、 SEC2、和SED，病人 口服后可以提高抗病毒能力；中國專利CN 1509725A公開了一種金葡菌發(fā)酵 液中提取獲得SEA、 SEB、 SEC、 SED以及TSST—1制備用于提高機體免疫功 能的口服制劑，病人使用后可以提高白細(xì)胞數(shù)量、改善健康狀況；中國專利 CN 1283264C公開了一種金葡菌代謝產(chǎn)物中提取SEA、 SEB、 SEC1、 SEC2、 SEC3、 SED以及TSST—1用于制備口服制劑，應(yīng)用于防治腫瘤、糖尿病、乙 肝、戒毒、抗病毒、抗艾滋病、提高免疫力。但上述從金葡菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物中 提取腸毒素的方法存在一定不足，如制備工藝簡單，缺乏嚴(yán)格質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)， 批次之間不穩(wěn)定，容易引入其他蛋白雜質(zhì)等，從而影響最終產(chǎn)品的純度、活性 和質(zhì)量。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供重組金黃色葡萄球菌腸毒素J 口服制劑，所述重 組金黃色葡萄球菌腸毒素J是利用基因工程方法制備獲得的超抗原蛋白，具有 SEQ ID NO.l的氨基酸序列，表達重組金黃色葡萄球菌腸毒素J的是重組質(zhì)粒pGEX-4T-l-SEJ，該質(zhì)粒由pGEX-4T-l和SEQIDNO.2的核苷酸序列經(jīng)過重組 構(gòu)建而成，所述制劑形式是以重組金黃色葡萄球菌腸毒素J及其相關(guān)蛋白制品 為主要有效成分的口服制劑，該口服制劑還含有制劑允許的藥物賦形劑或載 體。本發(fā)明通過Caco-2單層細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運試驗證實了該蛋白可以以完整分子 的形式透過小腸上皮細(xì)胞進入全身血液循環(huán)并能保持其促脾淋巴細(xì)胞增殖和 以及抑制腫瘤細(xì)胞生長的超抗原活性，可以應(yīng)用于口服抗腫瘤制劑的制備。本發(fā)明描述的口服制劑可以被稱為"口服的"、"口服給藥的"、"腸的"、"腸 給藥的"、"非腸胃外的"、"非腸胃外給藥的"等，以表明為沿消化道對個體進行 給藥的途徑或方式。這種"口服"或"腸"給藥途徑包括但不限于例如吞咽固體(藥 丸、片劑、膠囊)或液體(糖漿)化合物或組合物；舌下；鼻空腸管或胃造口 術(shù)管；十二指腸給藥；直腸給藥等，同時，可以采用一種或多種口服或腸給藥 途徑，其中優(yōu)選口服給藥。"藥學(xué)上可接受的"是指不會在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)上或以任何其他方式與 身體化學(xué)和新陳代謝不相容的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明制備的口服抗腫瘤制劑中除含有的以重組金黃色葡萄球菌腸 毒素J及其相關(guān)蛋白制品作為主要有效成分以外，同時含有的組分和輔料包括 防止胃蛋白酶降解上述主要有效成分的組分、防止糜蛋白酶降解上述主要有效 成分的組分、防止腸胰蛋白酶降解上述主要有效成分的組分、吸收促進劑以及 其他生物制品及/或基因工程藥品中可以接受的輔料和組分中的一種或多種，從 而可以使得有效量的上述主要有效成分到達腸內(nèi)并最終被吸收到使用個體的 血液中。本發(fā)明重組金黃色葡萄球菌腸毒素J通過以下步驟實現(xiàn) (一)重組金黃色葡萄球菌腸毒素J的制備和純化(1) 設(shè)計分別帶有5amH I和I酶切位點的用于克隆金黃色葡萄球菌 腸毒素J成熟肽序列的上下游引物SEQ ID NO.3: gca gga tcc gat agg aaa aat g (劃線部分為5amH I酶切位點) SEQ ID N0.4: cgc etc gag cta cag aac caa a (劃線部分為屈o I酶切位點)(2) 以金黃色葡萄球菌(FRI 1230)基因組為模板，采用PCR擴增獲得 編碼金葡菌腸毒素J蛋白成熟肽的基因片段，分別將其連入pGEM-T質(zhì)粒載體 上的多克隆位點，成功構(gòu)建pGEM-T-SEJ重組質(zhì)粒。通過測序證實通過PCR 擴增獲得的編碼金葡菌腸毒素J蛋白成熟肽的基因片段序列(見SEQIDNO.2)與GenBank數(shù)據(jù)庫中的編碼相同蛋白質(zhì)的基因序列(AF053140)完全一致。(3) 以pGEM-T-SEJ質(zhì)粒為模板，PCR擴增獲得兩端帶有酶切位點的編 碼金葡菌腸毒素J蛋白成熟肽的基因序列，將上述基因片段用內(nèi)切酶BamHI 和屈oI進行酶切后與用相同內(nèi)切酶處理后的pGEX-4T-l質(zhì)粒相連接，成功構(gòu) 建表達質(zhì)粒pGEX-4T-l-SEJ。(4) 將pGEX-4T-l-SEJ表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)，誘導(dǎo)表 達帶GST標(biāo)簽的重組GST-SEJ融合蛋白。收獲菌體并破碎后離心收集上清， 依次采用親和層析、離子層析、凝膠層析獲得高純度(>98%)的重組金葡菌 腸毒素J。將該純化產(chǎn)物經(jīng)過脫鹽、冷凍干燥即得重組金黃色葡萄球菌腸毒素 J凍干粉。重組金葡菌腸毒素跨膜實驗建立單層Caco-2細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運模型，檢測 重組腸毒素J的跨膜效應(yīng)。證實了重組金葡菌腸毒素J可以以完整分子形式透 過小腸上皮細(xì)胞進入人體血液循環(huán)。跨膜后的重組腸毒素分子的超抗原活性檢測采用MTT法，以有絲分裂 原ConA為陽性對照，建立合適的體外模型以觀察跨膜后的重組金葡菌腸毒素 J對小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用以及受其刺激增殖的小鼠脾淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì) 胞的殺傷作用，并與金黃色葡萄球菌腸毒素C2 (SEC2)進行比較，結(jié)果顯示 跨膜后的重組金葡菌腸毒素J蛋白分子仍然保持典型的超抗原活性，與SEC2 的作用相當(dāng)。本發(fā)明的以重組金葡菌腸毒素J及其相關(guān)蛋白制品為主要有效成分的口服 制劑的制備方法為以重組金葡菌腸毒素J及其相關(guān)蛋白制品為主要有效成分，通過添加藥學(xué) 上可接受的組分和輔料制備口服抗腫瘤制劑。其制劑可以是片劑、微型片劑、 膠囊、微型膠囊、顆粒劑、粉劑、泡騰固體、可咀嚼固體片劑、軟凝劑、囊片、 水溶液、混懸劑、乳液、微乳液、糖漿或酏劑中的一種或幾種，但不限于上述 劑型。目前，還未見用非經(jīng)典金葡菌腸毒素制備口服制劑用于腫瘤治療的報導(dǎo)， 美國專利(PCT/US2005/02263)報道了用來源于腸毒素基因簇(egc， enterotoxin gene cluster)的金葡菌腸毒素(SEG、 SEI、 SEM、 SEN、 SEO)具有良好的抗 腫瘤作用，并將其應(yīng)用于惡性腫瘤及嚴(yán)重并發(fā)癥(胸水、腹水等)患者的治療 和康復(fù)，取得了令人滿意的療效，但該專利申請亦未提出將上述腸毒素應(yīng)用于 口服抗腫瘤制劑。我實驗室申請的中國專利(公開號CN1962692、 CN1900119、CN101066993、 CN101037478、 CN101045924)涉及重組金葡菌腸毒素SEE、 SEI、 SEM、 SEN、 SEO的制備以及在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，也未涉及口服制 劑的應(yīng)用。金葡菌腸毒素J屬于金葡菌超抗原家族中的一種，與經(jīng)典腸毒素以 及上述腸毒素一樣具有典型的超抗原活性。本發(fā)明通過基因工程的方法獲得高 純度重組金葡菌腸毒素J，同時證明通過上述方法制備得到的金葡菌腸毒素J 可以以完整分子形式通過小腸上皮細(xì)胞被人體吸收并繼續(xù)發(fā)揮超抗原作用，可 以刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖并增強淋巴細(xì)胞的腫瘤殺傷作用。因此，我們證明了 重組金葡菌腸毒素J可以通過人體胃腸道吸收，可以進入血液循環(huán)并產(chǎn)生有效 的抗腫瘤作用，具有良好的制備成為口服抗腫瘤制劑的應(yīng)用前景。同時，獲得 的高純度重組腸毒素J蛋白不含金葡菌屬及其他革蘭氏陽性菌屬各類毒素蛋 白，可以有效降低臨床使用中各種毒副作用發(fā)生的可能性。因此可以應(yīng)用于口 服制劑的制備，用于提高機體免疫力，治療惡性腫瘤以及其他嚴(yán)重并發(fā)癥。本發(fā)明的又一個目的是提供重組金黃色葡萄球菌腸毒素J在制備治療惡性 腫瘤以及其他嚴(yán)重并發(fā)癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明方法的特點是(1)提供了高純度的重組金葡菌腸毒素J蛋白的制 備方法，并證實該腸毒素蛋白可以以完整分子的形式透過小腸上皮細(xì)胞，并且 能保持其超抗原活性，可以應(yīng)用于口服抗腫瘤制劑的制備(2)提供了一種以 重組金葡菌腸毒素J及其相關(guān)蛋白制品作為有效成分的口服抗腫瘤制劑，可以 應(yīng)用于腫瘤患者的康復(fù)和治療(3)提供了含有編碼金黃色葡萄球菌腸毒素J 成熟肽基因(W)的重組表達質(zhì)粒pGEX-4T-l-SEJ，該質(zhì)粒由pGEX-4T-l和 SEQIDN0.2所示核苷酸融合構(gòu)建而成，可轉(zhuǎn)化入合適的表達宿主，含有強啟 動子，在誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下可高效表達帶有GST標(biāo)簽的重組GST-SEJ融合蛋白(4) 使用陰離子交換層析、凝膠過濾層析對通過親和純化并經(jīng)過酶切的重組SEJ蛋 白進行精制純化，獲得了高純度的重組SEJ蛋白(純度>98%)。本發(fā)明方法利用基因工程的方法獲得了高純度的重組金黃色葡萄球菌腸 毒素J。重組金葡菌腸毒素J的表達強度高，占全菌蛋白的10—20%左右，且 為可溶性表達。重組GST-SEJ融合蛋白經(jīng)凝血酶酶切后，所得到的重組腸毒素 J與相應(yīng)的天然腸毒素J成熟肽相比，只在N端多出2個氨基酸(Gly-Ser)。 本發(fā)明方法采用Caco-2單層細(xì)胞模型證實完整的重組金葡菌腸毒素J分子可以 透過小腸上皮細(xì)胞進入全身血液循環(huán)，并利用MTT法證明透過Caco-2單層細(xì) 胞的完整重組腸毒素J分子可以保持其超抗原特性。本發(fā)明通過活性比較，證 實了透過Caco-2單層細(xì)胞的重組金葡菌腸毒素J的超抗原活性與金葡菌腸毒素9SEC2相當(dāng)，由于在臨床獲得應(yīng)用的金葡菌濾液制劑的主要有效成分為SEC2， 因而重組金葡菌腸毒素J可以應(yīng)用于口服抗腫瘤制劑的制備。同時，本發(fā)明方 法提供的口服有效制劑中含有的組分和輔料包括防止胃蛋白酶降解上述有效 成分的組分、防止糜蛋白酶降解上述有效成分的組分、防止腸胰蛋白酶降解上 述有效成分的組分、吸收促進劑以及其他生物制品及/或基因工程藥品中可以接 受的輔料和組分中的一種或多種，從而可以使得有效量的上述主要有效成分通 過口服、胃腸道、非胃腸道外等給藥方式到達腸內(nèi)從而最終被吸收到使用個體 的血液中。另一方面，根據(jù)鑒定實驗結(jié)果，現(xiàn)有的三種市售金葡素注射制劑(高 聚生、思復(fù)勝、恩格菲)中除了含有作為主要有效成分的微量腸毒素C2之外， 還含有大量不同種類的金葡菌屬蛋白及多肽類物質(zhì)，其中絲氨酸蛋白酶(serine protease )、烯醇化酶(enolase)、 二氫硫辛酰胺脫氫酶(dihydrolipoamide dehydrogenase)等三種酶含量超過了制劑中總蛋白質(zhì)含量的95%以上。同時， 三種制劑中也含有多種金葡菌屬外毒素以及致病因子，其中包括a -溶血素、 Y-溶血素、殺白細(xì)胞素、自溶素、纖維連接素結(jié)合蛋白以及其他不同種類的 脂酶、肽酶、核酶等。上述各種蛋白酶類結(jié)構(gòu)及其功能明確，不具備剌激、增 強機體免疫系統(tǒng)的超抗原活性，但很有可能是導(dǎo)致臨床應(yīng)用中普遍出現(xiàn)的各種 毒副作用(發(fā)熱、低血壓、過敏、局部疼痛等)的直接原因。通過本發(fā)明獲得 的高純度重組腸毒素J不含有上述各類金葡菌屬毒素蛋白以及致病因子，在今 后的臨床使用中造成相關(guān)副作用的可能性大大降低。本發(fā)明通過基因工程的方 法獲得高純度重組金葡菌腸毒素J，同時證明通過上述方法制備得到的金葡菌 腸毒素J可以以完整分子形式通過小腸上皮細(xì)胞被人體吸收并繼續(xù)發(fā)揮超抗原 作用，可以刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖并增強淋巴細(xì)胞的腫瘤殺傷作用。因此，我 們證明了重組金葡菌腸毒素J可以通過人體胃腸道吸收，可以進入血液循環(huán)并 產(chǎn)生有效的抗腫瘤作用。同時，獲得的高純度重組腸毒素J蛋白不含金葡菌屬 及其他革蘭氏陽性菌屬各類毒素蛋白，可以有效降低臨床使用中各種毒副作用 發(fā)生的可能性，具有良好的臨床應(yīng)用前景。鑒于此，本發(fā)明方法提供了以重組 金葡菌腸毒素J及其蛋白制品為主要有效成分的口服抗腫瘤制劑的制備，用于 腫瘤患者的康復(fù)與治療。
圖1為PCR擴增所得含酶切位點的編碼SEJ蛋白成熟肽基因的瓊脂糖凝 膠電泳圖。圖2為PCR擴增后所測編碼SEJ成熟肽的基因序列測序結(jié)果圖。圖3為重組pGEX-4T-l-SEJ質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖。 圖4為重組SEJ表達質(zhì)粒pGEX-4T-l-SEJ示意圖，標(biāo)示的"SEJ"即為編碼 SEJ蛋白成熟肽的基因序列插入位置。圖5為重組SEJ在BL21 (DE3)大腸桿菌中誘導(dǎo)表達電泳圖。圖6為重組金葡菌腸毒素J純化電泳圖。圖7為親和層析純化并酶切后的重組SEJ的陰離子層析圖譜。圖8為經(jīng)過陰離子交換層析純化后的重組SEJ的凝膠層析圖譜。圖9為重組SEJ的Caco-2單層細(xì)胞轉(zhuǎn)運實驗的時間-質(zhì)量關(guān)系圖(A側(cè)到圖10為重組SEJ的Caco-2單層細(xì)胞轉(zhuǎn)運實驗的時間-質(zhì)量關(guān)系圖(B側(cè)到 A側(cè))。圖ll分別為6hr后(泳道l)、 12hr后(泳道2)、 18hr后(泳道3)、 24hr 后(泳道4)透過Caco-2單層細(xì)胞(A側(cè)到B側(cè))的重組SEJ的Western Blot檢測結(jié)果圖。圖12分別為6hr后(泳道l)、 12hr后(泳道2)、 18hr后(泳道3)、 24hr 后(泳道4)透過Caco-2單層細(xì)胞(B側(cè)到A偵U)的重組SEJ的Western Blot檢測結(jié)果圖。圖13為經(jīng)過24hr后，透過Caco-2單層細(xì)胞的重組SEJ與重組SEC2標(biāo)準(zhǔn) 品對ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用(48h),其中與空白對照組相比***:尸 < 0.001; **: P<0.01。圖14為分別經(jīng)透過Caco-2單層細(xì)胞的重組SEJ與重組SEC2標(biāo)準(zhǔn)品刺激 的ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞對耐阿霉素慢性髓原性白血病細(xì)胞(K562-AD)的抑制 作用(48h)，與空白對照組相比P<0.001。
具體實施方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明。需指出的是，下列各 實施例并非是對本
發(fā)明內(nèi)容
的進一步限定，對本
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)所作出的等效替 換或者相應(yīng)的改進，仍然屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。在本說明書上下文中，除非特別指明，否則所引用的任何技術(shù)術(shù)語具有本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員在本領(lǐng)域中通常理解的含義，而未注明的實驗方法是按照常 規(guī)實驗方法進行或按照供應(yīng)商所建議的操作說明進行。實施例1:含酶切位點的編碼SEJ蛋白成熟肽基因序列的PCR擴增設(shè)計如下引物序列SEQ ID NO.3: gca gga tec gat agg aaa aat g (劃線部分為B"wH I酶切位點) SEQ ID N0.4: cgc etc gag eta cag aac caa a (劃線部分為屈o I酶切位點)以金黃色葡萄球菌(FRI 1230)基因組為模板，用于擴增金葡菌腸毒素SEJ 成熟肽基因片段^/'。PCR擴增條件如下，擴增獲得編碼SEJ成熟肽基因片段，其中各基因片段5' 端帶有B"mHI酶切位點，3'端終止子后帶有屈o1酶切位點。PCR體系H20: 60pLBuffer(lOx): 10pLMg2+(25mmol/L): 恥BSA(5mg/mL): 10pLPrimer國up(25(imol/L): 4jjLPrimer畫down(25j^mol/L): 4jiLdNTP(20mmol/L): 2pLTemplate(Genome of 51. ， 1 Ong/jiL): 1 jxLKOD Plus Polymerase(5U/jiL): 1 (iLPCR程序1、 95'C預(yù)變性3min2、 95。C變性30s， 55。C退火60s， 72。C延伸1 min3、 依步驟2循環(huán)34次4、 72。C延伸10min電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物純度以及產(chǎn)量均較高，擴增得到 的基因片段分子量位置正確，PCR結(jié)果瓊脂電泳圖見附圖1，圖中泳道l:核 酸Marker,泳道2:含酶切位點的編碼SEJ蛋白成熟肽基因的PCR產(chǎn)物。實施例2:含酶切位點的編碼腸毒素SEJ蛋白成熟肽基因的重組質(zhì)粒 pGEM-T-SEJ的構(gòu)建將PCR擴增所得的帶酶切位點的編碼SEJ蛋白成熟肽的基因片段克隆入 pGEM-T質(zhì)粒，構(gòu)建pGEM-T-SEJ重組質(zhì)粒，將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5a中進行擴增。提取上述重組pGEM-T-SEJ質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后送樣測序， 測序結(jié)果顯示上述獲得的帶酶切位點的編碼SEJ蛋白成熟肽的基因序列與GenBank上相應(yīng)的基因序列除在5'增加一個酶切位點以外其余位點完全一致， 其對應(yīng)的腸毒素J成熟肽的氨基酸序列與GenBank上相應(yīng)蛋白成熟肽序列相比 只在N端多了兩個氨基酸(Gly-Ser)，其余氨基酸位點完全一致(AAC78590)。 基因序列測序結(jié)果見附圖2。施例3:含有帶酶切位點的編碼SEJ成熟肽基因的pGEX-4T-l-SEJ重組表達 質(zhì)粒的構(gòu)建用B"mH I和^7zo I分別酶切由實施例2中得到的含酶切位點的編碼SEJ 蛋白成熟肽的基因片段的pGEM-T-SEJ重組質(zhì)粒和pGEX-4T-l質(zhì)粒。分別回 收酶切后的含酶切位點的編碼SEJ成熟肽的基因片段以及pGEX-4T-l質(zhì)粒酶 切產(chǎn)物的大片段，并連接，構(gòu)建了表達質(zhì)粒pGEX-4T-l-SEJ。將上述重組表達 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a擴增并提取質(zhì)粒，經(jīng)過^w2HI和屈oI酶切鑒定，結(jié) 果表明目的基因片段已插入載體質(zhì)粒，電泳結(jié)果見附圖3，圖中泳道1:核酸 Marker,泳道2:未經(jīng)過酶切的重組pGEX-4T-l-SEJ質(zhì)粒，泳道3:重組 pGEX-4T-l-SEJ質(zhì)粒BmwH I與^Tzo I雙酶切產(chǎn)物。pGEX-4T-l-SEJ重組表達質(zhì) 粒示意圖見
4。目的基因在pGEX-4T-l-SEJ質(zhì)粒上的詳細(xì)序列見 SEQ IDN0.2實施例4:重組GST-SEJ融合蛋白表達菌株的構(gòu)建分別從含pGEX-4T-l-SEJ重組表達質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a中提取該質(zhì)粒， 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，通過氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆，獲得 可以大量表達GST-SEJ融合蛋白的工程菌菌株。實施例5:重組GST-SEJ融合蛋白的表達將含pGEX-4T-l-SEJ重組表達質(zhì)粒的工程菌液劃氨芐青霉素篩選平板， 37X:靜置培養(yǎng)16-20hr后挑取單菌落接種于5mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中， 37t:振搖培養(yǎng)6hr，作為種子液。將該種子液以1-5%的接種量接種于含氨芐青 霉素的2xYT培養(yǎng)基中，37匸振搖培養(yǎng)4hr，按0.01 %-0.1%的體積比加入 O.lmol/L IPTG導(dǎo)表達5 — 8hr。實施例6:重組GST-SEJ融合蛋白的親和層析樣品預(yù)處理樣品的預(yù)處理取由實施例5中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液于4。C, 10000rpm離心，棄上清后收集沉淀。用原菌液1/10體積的PBS重懸沉淀，將混懸液置 FRENCH細(xì)胞破碎儀中，于700—900psi破碎，懸液呈粘稠狀。后用超聲破碎 儀繼續(xù)超聲破碎5-10min使核酸降解，菌體裂解液粘度降低。超聲后向菌體裂 解液中加入甘油至終濃度為2%，振蕩混勻，冰浴靜置30min。靜置后將菌體 裂解液于4t:， 12000rpm離心30min，取上清液低溫保存待用。上清液取樣進 行SDS-PAGE檢測，在分子量50kD處有明顯的條帶，此即為誘導(dǎo)表達的重組 GST-SEJ融合蛋白。Quantity One圖像分析軟件顯示融合蛋白條帶大約占全菌 總蛋白含量的10-20%。經(jīng)誘導(dǎo)后菌體裂解液蛋白電泳結(jié)果見附圖5，其中泳道 1:蛋白質(zhì)Marker，泳道2:經(jīng)過誘導(dǎo)表達的菌體總蛋白。實施例7:重組GST-SEJ融合蛋白的親和層析取由實施例6中經(jīng)預(yù)處理的GST-SEJ融合蛋白溶液，經(jīng)0.45pm膜過濾后 加入至預(yù)平衡的Glutathione Sepharose 4 Fast Flow親和柱中，輕輕混勻，結(jié) 合30min后流盡液體。用PBS沖洗柱子3-5次，流盡液體。向柱中加入一定體 積的還原型谷胱甘肽洗脫液，輕輕混勻。充分反應(yīng)20min后收集洗脫溶液，用 紫外分光光度計測蛋白濃度。重復(fù)上步的洗脫步驟直至蛋白濃度低于 0.1mg/mL停止收集。將收集的洗脫溶液組分用SDS—PAGE檢驗純度與濃度， 結(jié)果顯示初步純化得到的GST-SEJ融合蛋白分子量約50kD，電泳結(jié)果見附圖 6，圖中泳道l:蛋白質(zhì)Marker,泳道2:經(jīng)過親和純化后的GST-SEJ融合蛋 白溶液樣品，泳道3: GST-SEJ融合蛋白經(jīng)過凝血酶酶切后的GST和重組SEJ 蛋白混合蛋白溶液樣品，泳道4:經(jīng)過陰離子層析純化得到的重組SEJ溶液樣 品，泳道5:陰離子層析后再經(jīng)凝膠層析得到的含高純度重組SEJ的溶液樣品。實施例8:重組GST-SEJ融合蛋白的酶切將上述由實施例10中經(jīng)過親和純化獲得的重組GST-SEJ融合蛋白的收集 組分合并，脫鹽除去溶液中的谷胱甘肽并將蛋白所在溶液置換成含0.05mol/L Tris， 1.5mol/LNaCl， 2.5mmol/LCaCl2 (pH7.4)的凝血酶緩沖溶液。每lmL蛋 白溶液加入20mg/mL凝血酶2nL， 25'C反應(yīng)24h，取樣電泳，檢測酶切反應(yīng)程 度。SDS-PAGE結(jié)果顯示酶切反應(yīng)基本完全，GST標(biāo)簽已與重組SEJ分離，酶 切電泳結(jié)果見附圖6。實施例9:重組SEJ的精制純化將按實施例8中酶切得到的混合蛋白溶液(包括重組SEJ、 GST蛋白標(biāo)簽、 凝血酶以及其他少量雜質(zhì)蛋白)脫鹽置換成0.05mol/L Tris (pH8.53)緩沖溶液 后進行陰離子交換層析，離子交換填料選用QSepharoseTMHP，待溶液中蛋白 與陰離子層析柱充分結(jié)合后，采用線性梯度洗脫的方式，逐漸提高鹽離子強度 洗脫，洗脫液為0.05mol/LTris， lmol/LNaCl (pH8.53)，收集第一個洗脫峰， 即為較高純度的重組SEJ蛋白(純度>95%)。將經(jīng)離子層析得到的重組SEJ 溶液組分濃縮，利用Sephacryl-200凝膠層析柱對重組SEJ蛋白進行精制純化， 流速0.75ml/min,收集紫外吸收最高峰對應(yīng)溶液組分，即為高純度重組SEJ(純 度>98%)。層析圖譜見
7、 8。圖7中實線為紫外吸收值，虛線為 電導(dǎo)值，其中第一個洗脫峰即為重組SEJ。圖8中實線為紫外吸收值，該峰即 為高純度的重組SEJ。利用SDS-PAGE檢測，顯示重組金葡菌腸毒素J為約27kD 位置的單一條帶，純化結(jié)果見附圖6。實施例10:高純度重組金葡菌腸毒素J的保存將實施9例中獲得的高純度重組腸毒素J溶液置換成甲酸銨溶液后，冷凍 抽干，即制備成重組腸毒素J凍干粉，-2(TC保存實施例ll:重組金葡菌腸毒素J的跨膜測定取一定量實驗室制備保存的高純度重組SEJ以及作為陰性對照的HRP(辣 根過氧化物酶)粉末，溶于HBSS，利用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒進行準(zhǔn)確 定量，制備重組SEJ以及HRP儲備液。用HBSS按一定比例將兩種儲備液稀 釋并混合均勻，使重組SEJ和HRP終濃度分別為7.5 pg/mL和10 pg/mL，使 用前0.22^濾膜過濾除菌。將Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于TmnswdlTM小室中，培養(yǎng)18—25天，待分化充分后， 吸棄原有培養(yǎng)液，加入37'C預(yù)熱的HBSS溶液，37°C ， 5%(302條件下靜置20min， 吸棄，再加入預(yù)熱至37'C的HBSS溶液，37°C， 5%C02條件下靜置20min，吸 棄。將含重組SEJ(7.5嗎/mL)禾卩HRP(IO pg/mL)的混合蛋白溶液分別加入 TranswelFM小室的頂側(cè)(Apical， A側(cè))或者底側(cè)(Basolateral， B側(cè))，其中 A側(cè)加入500jiL， B側(cè)加入1.5mL，相應(yīng)側(cè)加入HBSS溶液，其中A側(cè)加入 500pL， B側(cè)加入1.5 mL，于37 "C搖床低速振搖G5-55r.p.m)孵育6、 12、 18、 24hr后，根據(jù)混合蛋白溶液加入位置收集另一側(cè)溶液，后利用BA-ELISA 以及顯色法分別測定透過Caco-2單層細(xì)胞的者重組SEJ蛋白和HRP的含量。(1) BA-ELISA法測定SEJ濃度將96孔酶標(biāo)板用小鼠抗SEJ單抗包被過夜后，棄去包被液，用含10 % FCS的PBS 37 "C封閉2 hr。棄去封閉液，用PBS洗板后加入樣品溶液以及重 組SEJ系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，37 。C孵育2hr。棄去上述液體，用PBS洗板后加 入抗SEJ兔多克隆抗體，37'C孵育2hr。棄去多克隆抗體溶液，PBS洗板后加 入生物素化山羊抗兔IgG， 37 'C孵育0.5hr。棄去生物素化山羊抗兔IgG溶液， PBS洗板后加入HRP標(biāo)鏈親和素，37。C孵育0.5hr。棄去HRP標(biāo)鏈親和素溶 液，PBS洗板后加入現(xiàn)配ELISA顯色液，37 'C孵育1 5 min后加入現(xiàn)配中止 液中止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀讀取OD45j直，根據(jù)重組SEJ系列濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣 品中重組SEJ含量，其中每個樣品各三個復(fù)孔。(2) 顯色法測定HRP濃度將樣品溶液以及HRP系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液加入96孔培養(yǎng)板中，加入TMB 作為顯色底物，37 'C孵育1 5min后加入中止液中止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取OD450 值，根據(jù)HRP系列濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中HRP濃度，其中每個樣品各三個 復(fù)孔。實驗結(jié)果顯示，與陰性對照HRP相比，重組SEJ的Caco-2細(xì)胞雙側(cè)轉(zhuǎn)運 (A—B， B—A)效率均顯著高于HRP，并且在24hr內(nèi)轉(zhuǎn)運的量隨時間變化呈 現(xiàn)遞增趨勢。重組SEJ的Caco-2單層細(xì)胞轉(zhuǎn)運實驗結(jié)果見
9、 10。 圖9中實線為重組SEJ，虛線為陰性對照HRP，橫標(biāo)為時間，縱標(biāo)為轉(zhuǎn)運/透過 Caco-2單層細(xì)胞的重組SEJ的質(zhì)量。圖10中實線為重組SEJ，虛線為陰性對 照HRP，橫標(biāo)為時間，縱標(biāo)為轉(zhuǎn)運/透過Caco-2單層細(xì)胞的重組SEJ的質(zhì)量。實施例12:透過Caco-2單層細(xì)胞的重組金葡菌腸毒素J的完整性檢測利用Western Blot法檢測透過Caco-2單層細(xì)胞后的重組SEJ蛋白的完整 性。取實施例11中的各時間點樣品溶液，常規(guī)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，將膜用含 10%無脂奶粉的PBS溶液封閉過夜。棄去封閉液，PBS洗膜后將膜置于兔抗 SEJ多克隆抗體溶液中，于37"C緩慢振搖孵育2hr。棄去一抗溶液，PBS洗膜 后將膜置于HRP酶標(biāo)羊抗兔IgG溶液中，于37"C緩慢振搖孵育2hr。 PBS洗 膜后取Lumi-Light Western Blotting Substrate溶液1 、 2各0.5mL混勻，滴于 膜上，暗處放置2min,保鮮膜封膜，固定于暗盒內(nèi)，壓片，分別壓20sec、 1 min和5 min后，自動洗片機洗片。結(jié)果顯示透過Caco-2單層細(xì)胞的重組SEJ無論是從A側(cè)到B側(cè)還是從B側(cè)到A側(cè)均能保持其完整性，即重組SEJ蛋白可以以完整分子形式透過Caco-2 單層細(xì)胞，證實重組SEJ蛋白可以以完整分子形式被人體小腸上皮細(xì)胞吸收進 入血液循環(huán)。WesternBlot實驗結(jié)果見附圖11、 12。實施例13 : MTT法測定透過單層Caco-2細(xì)胞的重組腸毒素SEJ的體外抑瘤 活性采用MTT法，以有絲分裂原ConA為陽性對照，觀察跨膜后的重組金葡 菌腸毒素J對小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用以及受其刺激增殖的小鼠脾淋巴細(xì)胞 對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，并與金黃色葡萄球菌腸毒素C2 (SEC2)標(biāo)準(zhǔn)品進行 比較。設(shè)調(diào)零孔(僅含培養(yǎng)基)、腫瘤細(xì)胞對照孔(培養(yǎng)基+腫瘤細(xì)胞)、淋巴 細(xì)胞本底釋放孔[含空白孔(培養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞)、陰性對照孔(培 養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞+重組GST蛋白)、陽性對照孔(培養(yǎng)基+ICR小 鼠脾淋巴細(xì)胞+ConA)、SEC2標(biāo)準(zhǔn)品孑L(培養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞+ SEC2 標(biāo)準(zhǔn)品)和實驗孔(培養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞+透過單層Caco-2細(xì)胞的重 組腸毒素SEJ)]以及抑瘤作用孔[含空白孔(培養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞+ 腫瘤細(xì)胞)、陰性對照孔(培養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞+重組GST 蛋白)、陽性對照孔(培養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞+Con A) 、 SEC2 標(biāo)準(zhǔn)品孔(培養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞+ SEC2標(biāo)準(zhǔn)品)和實驗孔 (培養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞+透過單層Caco-2細(xì)胞的重組腸 毒素SEJ)]，每種設(shè)三個復(fù)孔。其中，ConA終濃度為10|ag/mL， GST終濃度 為10嗎/mL， SEC2標(biāo)準(zhǔn)品終濃度為100ng/mL，透過單層Caco-2細(xì)胞SEJ終 濃度為90 150ng/mL (根據(jù)實際透過量)，本底釋放孔中5xl(^個/mL ICR小 鼠脾淋巴細(xì)胞以100nL/孔加入，腫瘤作用孔中5xl(^個/mLICR小鼠脾淋巴細(xì) 胞和2.5xl05個/mL耐阿霉素慢性髓原性白血病細(xì)胞(K562—AD)的混合懸液 以100pL/孔加入到實驗孔中，透過單層Caco-2細(xì)胞SEJ樣品溶液50pL/孔加 入各孔，并小心吹打混勻。鋪板后44hr在待測孔中加入15pL/孔的MTT溶液，小心吹打混勻后，培 養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4hr后，小心吸除上清，按120laL/孔的加入DMSO，吹打助溶 后37。C培養(yǎng)箱中放置10min，酶標(biāo)儀雙波長法(570nm為測定波長，630nm為參考波長)測定各孔OD57。nm-OD630nm值，以僅含培養(yǎng)基的調(diào)零孔調(diào)零。按下式 計算抑瘤率抑瘤率(％) =100-[(抑瘤作用孔-淋巴細(xì)胞本底釋放孔)/腫瘤細(xì)胞對照孔]xl00，作圖分析受透過Caco-2單層細(xì)胞的完整重組腸毒素SEJ分子 激活的ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用，并用students檢驗做 統(tǒng)計分析。利用MTT法測定透過單層Caco-2單層細(xì)胞的完整重組腸毒素SEJ體外抑 瘤活性結(jié)果顯示，以ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞為作用細(xì)胞，以K562-AD為耙細(xì)胞， 與抑瘤陰性對照孔相比，陽性對照Con A和透過Caco-2單層細(xì)胞的完整分子 形式的重組腸毒素SEJ (90 150ng/mL)作用48hr后小鼠脾淋巴細(xì)胞抑瘤率均 有顯著增高。按相同實驗方案檢測重組腸毒素SEC2標(biāo)準(zhǔn)品激活的ICR小鼠脾 淋巴細(xì)胞對K562-AD細(xì)胞的殺傷作用，經(jīng)比較，由透過Caco-2單層細(xì)胞的完 整重組腸毒素SEJ分子激活的ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞對K562-AD細(xì)胞的殺傷作 用與重組腸毒素SEC2標(biāo)準(zhǔn)品激活的ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞殺傷作用相當(dāng)。實驗結(jié)果見附圖13、 14。圖13、 14中與空白對照組相比***:戶<0.001; **:戶<0.01。實施例14市售金葡菌注射制劑成分分析將市售三種金葡素注射液利用超濾管超濾濃縮40倍后進行電泳。電泳完 畢后使用Colloidal Coomassie Blue染色液染色，根據(jù)凝膠上各樣品中不同蛋白 條帶顏色深淺以及位置將凝膠分割成若干部分，分別進行膠內(nèi)酶切和肽段提 取。將提取獲得的肽段用LC上樣液(2%乙腈，0.5%甲酸)20UL溶解，振 蕩數(shù)秒后10000r.p.m離心10min， 30。C水浴超聲10min， 10000rpm離心10min， 取上清液進行LC/MS/MS分析。根據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果，三種金葡菌注射制劑(高聚生、思復(fù)勝、恩格菲)中 共鑒定獲得約250種來源于不同菌屬蛋白質(zhì)，其中約有100種金葡菌屬蛋白， 包括了金葡菌腸毒素C2以及多種金葡菌屬毒素蛋白以及致病因子，如a-溶血 素、Y-溶血素、殺白細(xì)胞素、自溶素、纖維連接素結(jié)合蛋白以及其他不同種 類的脂酶、肽酶、核酶等。上述各類蛋白以及金葡菌毒素蛋白結(jié)構(gòu)功能明確， 不具備剌激、增強機體免疫系統(tǒng)的超抗原活性，而是多種臨床疾病的直接致病 因子。如Dinges等指出,(i-溶血素能引起皮膚壞死，引起血管收縮，造成局部 缺血壞死，并最終可能導(dǎo)致肺水腫、呼吸窘迫綜合征以及各器官的化膿性感染； Y -溶血素可引起炎癥因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致多種炎癥反應(yīng)(Martin M. Dinges W Exotoxins of iS鄉(xiāng)/^/ococcw51 C7/w MfcraWo/ i ev. 2000; Vol. 13, No.1:16-34)。 Iwatsuki等指出，殺白細(xì)胞素能引起皮膚以及皮下組織壞死，亦能引起兒童以及青年壞死性月市炎(Keiji Iwatsuki fl/. Staphylococcal cutaneous infections: Invasion, evasion, and aggression. /Z)^7wafc>/ 2006 Jun; Vol. 42, No. 3:203-214)。 Menzies指出，纖維連接素蛋白則是引起感染性心內(nèi)膜炎的重要因 子(Menzies BE. The role of fibronectin binding proteins in the pathogenesis of S鄉(xiāng)/iy/ococcws awm/s infections. Cw/r Qp/" /"y^cf ￡fe. 2003 Jun; Vol. 16， No. 3:225-229)。上述各種金葡菌致病因子的存在極有可能是導(dǎo)致現(xiàn)有三種市售金 葡素注射制劑在臨床應(yīng)用中產(chǎn)生多種副作用(發(fā)熱、低血壓、過敏、局部疼痛 等)的直接原因，因此在今后同類藥物的開發(fā)、研制以及生產(chǎn)過程中必須嚴(yán)格 控制并盡量去除。三種針劑(高聚生、恩格菲、思復(fù)勝)中獲得鑒定的金葡菌 屬重要毒素蛋白見表l。其中首列為GenBank蛋白序列號，第二列為獲得鑒定 的毒素蛋白質(zhì)名稱，第三列為蛋白質(zhì)種屬名稱。表1金葡素注射制劑中獲得鑒定的金葡菌屬重要毒素蛋白蛋白序列號蛋白名稱種 屬gi|2914575Chain Q Alpha陽Hemolysin[Staphylococcus aureus]gi|9931632serine protease-like exoprotein A[Staphylococcus aureus]gi|9931634serine protease-like exoprotein E[Staphylococcus aureus]gi|19879322lipase[Staphylococcus aureus]gi|21203559set26[Staphylococcus aureus subsp. aureus MW2]gi|21284073gam歸-hemolysin component B[Staphylococcus aureus subsp. aureus MW2]gi|49483762putative peptidase[Staphylococcus aureus subsp. aureus MRSA252]gi|49484059serine protease[Staphylococcus aureus subsp. aureus MRSA252]gi|76009542enterotoxin C2 precursor[Staphylococcus aureus]gi|82750663Autolysin[Staphylococcus aureus RF122]gi|82752016gamma-hemolysin component C[Staphylococcus aureus RF122]gi|83681617fibronectin binding protein B[Staphylococcus aureus]gi|87160772V8 protease[Staphylococcus aureus subsp. aureus USA300]gi|87162036leukotoxin LukE[Staphylococcus aureus subsp. aureus USA300]gi|871621231 -phosphatidylinositol phosphodiesterase[Staphylococcus aureus subsp. aureus USA300]gi|90585272Sulfatass[Staphylococcus aureus subsp. aureus JH9]gil卯585564Peptidase SI and S6, chymotrypsin/Hap[Staphylococcus aureus subsp. aureus JH9]gi|90585851Glycerophosphoryl diester phosphodiesterase[Staphylococcus aureus subsp. aureus JH9]上述一系列實驗證實，通過基因工程方法獲得的高純度重組金葡菌腸毒素SEJ可以通過小腸上皮細(xì)胞吸收進入血液循環(huán)，同時，吸收后的重組腸毒素J 仍然保持其超抗原活性，可以刺激小鼠T淋巴細(xì)胞顯著增殖，增殖的T淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞具有顯著的殺傷作用。同時，與現(xiàn)有金葡素注射制劑相比，制備 獲得的重組腸毒素J不含有各種金葡菌屬毒素蛋白以及致病因子。綜上所述， 本發(fā)明提供的重組腸毒素J可以用于口服抗腫瘤制劑的制備。本發(fā)明涉及的序列 <110>浙江大學(xué)<120>重組金黃色葡萄球菌腸毒素J 口服制劑及應(yīng)用 <160>4<210> 1 <211>738 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221>CDS <222> (1),.,(738)<223>含部分凝血酶酶切位點序列的重組金黃色葡萄球菌腸毒素J <440> 1gg3 tCC g3t 3gC 333 33t g33 3C3 3tt 333 g33 33g 33t ttg C3CGly Ser Asp Ser Lys Asn Glu Thr lie Lys Glu Lys Asn Leu His 1 5 10 15aaa aaa tea gag tta agt agt att act tta aat aac etc aga cat Lys Lys Ser Glu Leu Ser Ser lie Thr Leu Asn Asn Leu Arg His 16 20 25 30ata tac ttc ttt aac gaa aag ggt ate tct gaa aag at3 atg aca lie Tyr Phe Phe Asn Glu Lys Gly lie Ser Glu Lys lie Met Thr 31 35 40 45gaa gat caa ttt tta gat tac aca eta tta ttt aaa agt ttt ttc Glu Asp Gin Phe Leu Asp Tyr Thr Leu Leu Phe Lys Ser Phe Phe 46 50 55 60ata agt cat tea cag tat aac gac tta ttg gta caa ttc gat tea lie Ser His .Ser Gin Tyr Asn Asp Leu Leu Val Gin Phe Asp Ser 61 65 70 75aaa gaa aca gtt aat aag ttt aaa ggc aaa caa gta gat eta tac Lys Glu Thr Val Asn Lys Phe Lys Gly Lys Gin Val Asp Leu Tyr 76 80 85 90gg3 tct t3t t3t ggt ttt ess tgt tct ggt ggt 333 cc3 33t 333 Gly Ser Tyr Tyr Gly Phe Gin Cys Ser Gly Gly Lys Pro Asn Lys 91 95 100 105aca gca tgt atg tat ggt gga gta aca ctg cat gaa aac aat caa Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His Glu Asn Asn Gin 106 110 115 120ctt tst gat act 333 3a3 at3 cct att 33t tt3 tgg 3tt gat age Leu Tyr Asp Thr Lys Lys He Pro He Asn Leu Trp He Asp Ser 121 125 130 135ate aga act gtt gtt ccg eta gat ata gtt aaa aca aat aag aaa lie Arg Thr Val Val Pro Leu Asp lie Val Lys Thr Asn Lys Lys 136 140 145 1504590135180225270315360405450aaa gta acc att caa gaa eta gat ctt cag gca aga tat tat tta Lys Val Thr lie Gin Glu Leu Asp Leu Gin Ala Arg Tyr Tyr Leu 151 155 160 165cat aaa caa tat aat tta tac aac cct agt acc ttt gat ggt aaa His Lys Gin Tyr Asn Leu Tyr Asn Pro Ser Thr Phe Asp Gly Lys 166 170 175 180att cag aaa gga eta ate gtg ttt cat acc tea aaa gaa ccg ttg lie Gin Lys Gly Leu lie Val Phe His Thr Ser Lys Glu Pro Leu 181 185 190 195gtt 3gt tst g3t tt3 ttt 33t gtt 3t3 ggt C33 tst cc3 gsc 333 Val Ser Tyr Asp Leu Phe Asn Val lie Gly Gin Tyr Pro Asp Lys 196 200 205 210tt3 tt3 333 3t3 t3C C33 g3t 33t 333 3tC 3t3 g33 tct g33 33CLeu Leu Lys lie Tyr Gin Asp Asn Lys lie lie Glu Ser Glu Asn 211 215 220 2253tg 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權(quán)利要求
1.一種重組金黃色葡萄球菌腸毒素J口服制劑，所述重組金黃色葡萄球菌腸毒素J屬于超抗原蛋白，其特征是SEQ ID NO.1是該重組金黃色葡萄球菌腸毒素J的氨基酸序列，表達該重組金黃色葡萄球菌腸毒素J的是重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEJ，該質(zhì)粒由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列經(jīng)過重組構(gòu)建而成，該口服制劑還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素J 口服制劑，其特 征是所述重組金黃色葡萄球菌腸毒素J通過以下步驟獲得(1) 設(shè)計分別帶有S"mH I和屈o I酶切位點的用于克隆金黃色葡萄球菌 腸毒素J成熟肽序列的上下游引物SEQ ID N0.3: gca ggatcc gat agg aaa aat g，劃線部分為BamH I酶切位點， SEQ ID N0.4: cgc etc gag eta cag aac caa a,劃線部分為屈o I酶切位點，(2) 以金黃色葡萄球菌基因組為模板，采用PCR擴增獲得編碼金葡菌腸 毒素J蛋白成熟肽的基因片段，分別將其連入pGEM-T質(zhì)粒載體上的多克隆位 點，構(gòu)建pGEM-T-SEJ重組質(zhì)粒，通過測序證實具有SEQIDN0.2的序列的基 因片段與GenBank數(shù)據(jù)庫中的編碼相同蛋白質(zhì)的基因序列完全一致；(3) 以pGEM-T-SEJ質(zhì)粒為模板，PCR擴增獲得兩端帶有酶切位點的編 碼金葡菌腸毒素J蛋白成熟肽的基因序列，將上述基因片段用內(nèi)切酶B"mHI 和WoI進行酶切后與用相同內(nèi)切酶處理后的pGEX-4T-l質(zhì)粒相連接，構(gòu)建表 達質(zhì)粒pGEX-4T-l-SEJ;(4) 將pGEX-4T-l-SEJ表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 ，誘導(dǎo)表達帶GST 標(biāo)簽的重組GST-SEJ融合蛋白。收獲菌體并破碎后離心收集上清，依次采用親 和層析、離子層析、凝膠層析獲得高純度的重組金葡菌腸毒素J。
3. 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素J 口服制劑，其特 征是所述藥物的給藥方式選用口服給藥、胃腸道給藥或非胃腸道外給藥。
4. 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素J 口服制劑，其特 征是該口服制劑含有的藥物賦形劑或載體包括防止或抑制腸糜蛋白酶蛋白水 解活性的成分、防止或抑制腸胰蛋白酶蛋白水解活性的成分、防止或抑制胃蛋 白酶蛋白水解活性的成分、吸收促進劑和生物制品中可接受的組分和輔料。
5. 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素J 口服制劑在制備 治療惡性腫瘤以及其他嚴(yán)重并發(fā)癥藥物中的應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明提供重組金黃色葡萄球菌腸毒素J口服制劑，所述重組金黃色葡萄球菌腸毒素J具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列，該口服制劑還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。本發(fā)明通過Caco-2單層細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運試驗證實了該蛋白可以以完整分子的形式透過小腸上皮細(xì)胞進入全身血液循環(huán)并能保持其促脾淋巴細(xì)胞增殖以及抑制腫瘤細(xì)胞生長的超抗原活性，在制備治療惡性腫瘤以及其他嚴(yán)重并發(fā)癥藥物中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/70GKCN101322841SQ200810062277
公開日2008年12月17日 申請日期2008年6月12日
發(fā)明者丁 丁, 陳樞青 申請人:浙江大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan