專利名稱:一種h5n1禽流感病毒樣顆粒疫苗的規(guī)?；苽浞椒?br>技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種新型高致病性H5m禽流感病毒樣顆粒 (VLPs)的構(gòu)建、規(guī)?；苽浞椒ā?br>技術(shù)背景
流感是危害人類健康的重要傳染病。其病原體屬于正粘病毒科流感病毒屬，根據(jù)病毒核蛋白抗原性不同，分為A、B和C三型。A型流感病毒(Influenza A Virus, IAV)為有囊膜的RNA病毒，基因組由分節(jié)段的8個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段組成。根據(jù)病毒粒子表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性不同，A型流感病毒分為16種不同的HA亞型(H1-H16) 禾口 9種不同的亞型NA(N1-N9)。
A型流感病毒宿主范圍廣泛，具有高度的變異性，被認(rèn)為是未來流感大流行的最大威脅。人類歷史上發(fā)生過3次流感大暴發(fā)，分別是1918年由Hmi亞型流感病毒引起的西班牙大流感、1957年由H2N2亞型流感病毒引起的香港流感和1968年由H3N2亞型流感病毒引起的亞洲流感。2009年4月由人流感病毒、禽流感病毒和豬流感病毒重配產(chǎn)生甲型Hmi 流感病毒，具有新的抗原性和極強(qiáng)的水平傳播能力，引起巨大的公共衛(wèi)生恐慌。所幸的是， 這種新型Hmi流感病毒感染的死亡率較低。
對(duì)人類來說，H5N1型流感病毒是一種新型流感病毒，1997年在香港首次從人體分離到H5m毒株。此后，H5m禽流感病毒先后在亞洲、歐洲和非洲的60多個(gè)國(guó)家引起家禽和野禽的禽流感暴發(fā)，隨后直接從禽傳染到人，導(dǎo)致500多人感染，死亡率約60%。由于人群中先前存在的流感病毒抗體不能中和抵抗該型病毒，增加了該病毒在人群中爆發(fā)大流行的可能。尤其令人擔(dān)憂的是，如果這種高致病性H5m禽流感病毒因抗原變異及與人流感病毒(如新型Hmi流感病毒)之間發(fā)生基因重配產(chǎn)生能在人群中迅速傳播和引起流感大流行新病毒株時(shí)，將會(huì)對(duì)人類造成可怕的后果。
同其它病毒性疫病一樣，人禽流感的預(yù)防主要依賴于疫苗免疫接種?，F(xiàn)行生產(chǎn)的 H5N1人用禽流感疫苗是采用傳統(tǒng)季節(jié)性人流感疫苗方法制備的全病毒滅活疫苗或裂解型疫苗。人H5m禽流感疫苗毒株系采用“反向遺傳操作技術(shù)”，用來源人感染患者H5m病毒分離株的HA和NA編碼基因替換季節(jié)性Hmi流感病毒基因組中相應(yīng)基因產(chǎn)生的重配株， 該重配株能編碼H5m禽流感病毒的HA和NA抗原，其它編碼基因則來源Hmi疫苗株基因組，以降低H5m禽流感病毒的致病性。盡管如此，采用這種重配H5m毒株按傳統(tǒng)流感疫苗工藝生產(chǎn)疫苗仍面臨許多困難。包括H5m病毒培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)操作有嚴(yán)格的生物安全要求， 疫苗生產(chǎn)必須在三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室(BSL3)內(nèi)操作，對(duì)生產(chǎn)人員安全構(gòu)成威脅，并導(dǎo)致成本升高；病毒滅活不徹底導(dǎo)致的毒力殘留給疫苗制品的安全造成巨大風(fēng)險(xiǎn)；因毒力強(qiáng)引起雞胚致死，難以在雞胚中高滴度增殖；此外，在H5m禽流感爆發(fā)時(shí)勢(shì)必會(huì)增加對(duì)疫苗總量的要求，而爆發(fā)期間會(huì)引起雞的大量死亡，很難獲得滿足生產(chǎn)能力需求的雞胚。尤其重要的是，傳統(tǒng)流感疫苗生產(chǎn)工藝制備的H5m禽流感疫苗免疫原性較差，疫苗接種難以誘導(dǎo)持久免疫和交叉保護(hù)。因此，研發(fā)安全、高效的H5m禽流感新型疫苗顯得尤為迫切。[0006]近年來發(fā)展起來的病毒樣顆粒(virus like particles，VLPs)，含有病毒的一個(gè)或多個(gè)抗原蛋白、具有與病毒粒子相似結(jié)構(gòu)的顆粒，不含有病毒的遺傳物質(zhì)，不能自主復(fù)制，沒有感染性，能以天然構(gòu)象和模式遞呈抗原，有效刺激細(xì)胞和體液免疫，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)，特別適用于流感病毒新型疫苗的研制。這種新疫苗策略應(yīng)用于高致病性 H5N1禽流感病毒VLPs疫苗研發(fā)，能克服現(xiàn)行H5W人用禽流感疫苗生產(chǎn)各種困難，具有良好的前景和巨大發(fā)展?jié)摿?。近年來，?guó)內(nèi)外在流感病毒VUs研制方面進(jìn)行了許多有益的探索。Latham等Q001)首次利用桿狀病毒載體同時(shí)表達(dá)H3N2流感病毒HA、NA、Ml和M2蛋白，在Sf9細(xì)胞中制備出流感病毒VLPs，并證實(shí)該VLPs與野生型流感病毒粒子具有類似的結(jié)構(gòu)。Pushko等000 利用重組桿狀病毒在Sf9細(xì)胞中共表達(dá)禽流感病毒H9N2的HA、NA 和Ml蛋白，并自裝配成具有血凝和神經(jīng)氨酸酶活性的VLPs，該VLPs純化后免疫動(dòng)物能誘導(dǎo)針對(duì)H9N2的特異性抗體應(yīng)答和抗H9N2病毒強(qiáng)毒致死攻擊的免疫保護(hù)；Galarza等Q005) 利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)H3N2流感病毒HA和Ml的VLPs疫苗，經(jīng)鼻內(nèi)滴注或肌肉注射免疫小鼠，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生HA抗體和抵抗同源流感毒株的致死攻擊。Bright等Q007) 利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了 H5W流感病毒VLPs，能夠誘導(dǎo)小鼠和雪貂抵抗H5W流感病毒的攻擊。近來，我們(Tao等，2009)利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了 H5m毒株HA、NA和Ml 蛋白組裝的VLPs，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抵抗人源和禽源H5W亞型病毒攻擊的免疫保護(hù)。盡管在研制人禽流感VLPs疫苗方面進(jìn)行了許多有益的探索并取得了諸多成果，但在提高保護(hù)性抗原表達(dá)量和VLPs規(guī)?；苽浞矫孢€存在諸多值得改進(jìn)的地方，致使人用H5W禽流感病毒VLPs疫苗仍未應(yīng)用臨床。
另一方面，美國(guó)氰胺公司的J.M.加拉爾薩和T.E.萊瑟姆博士在流感病毒顆粒 (VLP)裝配方面也開展了大量探索。在野生型和嵌合流感病毒VUs構(gòu)建、修飾、顆粒裝配和作為藥物應(yīng)用等方面提出了一些新的方法和理念，并已獲準(zhǔn)我國(guó)發(fā)明專利
專利名稱野生型和嵌合流感病毒樣克隆(VLP)的裝配，公開號(hào)CN1437655A
。該專利提出了 46項(xiàng)權(quán)利要求
，內(nèi)容涉及流感病毒樣顆粒的生產(chǎn)方法、嵌合病毒樣顆粒，病毒樣顆粒稀釋劑或載體，以及藥物組合等諸多方面，并列舉了 15個(gè)實(shí)施例。但按照該專利的實(shí)施步驟，不能從流感病毒開始操作，生產(chǎn)出病毒樣顆粒疫苗制品。該專利涉及的病毒樣顆粒生產(chǎn)步驟更不適用于 H5N1禽流感病毒顆粒的規(guī)模化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型高致病性H5m禽流感病毒樣顆粒(VLPs)疫苗的規(guī)?；苽浞椒?。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的規(guī)?；苽浞椒ㄒ来伟ㄈ缦虏襟E
1)重組質(zhì)粒rbacmid/HANAMl的構(gòu)建和提??；
2)將重組質(zhì)粒rbacmid/HANAMl轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞桿狀病毒，在細(xì)胞內(nèi)裝配病毒樣顆粒；
3)規(guī)?；疭f9細(xì)胞培養(yǎng)、重組病毒感染和病毒樣顆粒的純化。
作為一種優(yōu)選，進(jìn)一步的技術(shù)方案是
所述的重組質(zhì)粒rbacmid/HANAMl的構(gòu)建包括重組質(zhì)粒pFBDM/HANAMl和pUCDM/ HANAMl的構(gòu)建及其在宿主菌DHlOMultibacte中重組。[0015]步驟3中所述的病毒樣顆粒的純化采用離心分離技術(shù)。
本發(fā)明方法利用桿狀病毒新型高效表達(dá)系統(tǒng)(Multibac)，將編碼H5W禽流感病毒株血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)和基質(zhì)蛋白(Ml)的基因克隆到轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFBDM 和pUCDM中，置于桿狀病毒晚期啟動(dòng)子plO和pH控制下，外源基因下游連接SV40polyA或 HSVtk polyA加尾信號(hào)序列，構(gòu)成外源基因表達(dá)盒；將重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFBDM/HANAMl和 pUCDM/HANAMl轉(zhuǎn)化至攜帶桿狀病毒基因組的大腸桿菌DHlOMultibacte中進(jìn)行T7轉(zhuǎn)座重組和LoxP位點(diǎn)特異性重組，篩選獲得重組Bacmid ；將rbacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，采用Sf9細(xì)胞規(guī)?；瘧腋∨囵B(yǎng)和重組桿狀病毒增殖，結(jié)合離心分離技術(shù)，純化得到高致病性 H5N1禽流感病毒樣顆粒(VLPs)疫苗。
本發(fā)明還提供VLPs制品的分析檢定方法和功能評(píng)價(jià)方法，包括VLPs免疫接種動(dòng)物誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答和抗病毒感染攻擊的檢測(cè)方法。
本發(fā)明在充分借鑒抗病毒免疫和流感病毒樣顆粒疫苗最新研究成果基礎(chǔ)上，通過開展蛋白表達(dá)、病毒樣顆粒生產(chǎn)與純化步驟優(yōu)化，建立了一種新型高致病性H5m禽流感病毒樣顆粒(VLPs)疫苗的規(guī)?；苽浞椒ǎ摲椒ㄟm用于大規(guī)模制備人用抗高致病性H5m 禽流感新型基因工程VLPs疫苗，安全高效，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。


圖1表達(dá)H5m流感病毒HA、NA和Ml的重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。
圖2表達(dá)H5m流感病毒HA、NA和Ml蛋白重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞時(shí)抗原蛋白表達(dá).A為正常Sf9細(xì)胞；B為重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞；C為重組桿狀病毒感染的Sf9 細(xì)胞中表達(dá)HA (抗HA多克隆抗體免疫熒光檢測(cè))；D為重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞中表達(dá) NA (抗NA多克隆抗體免疫熒光檢測(cè))。
圖3Westernblot分析重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞中HA、NA和Ml蛋白表達(dá)情況 (Ant i-HA、Ant i-NA和Ant i-Ml三種多克隆抗體分別檢測(cè)出對(duì)應(yīng)的蛋白；每種抗體對(duì)應(yīng)圖中第1列為未感染重組病毒的Sf9細(xì)胞陰性對(duì)照，第2列為感染重組病毒的Sf9細(xì)胞)。
圖4純化制備的VLPs分析檢測(cè).A為Western blot分析VLPs中HA、NA和Ml蛋白組分(第1-4列為不同的樣品)；B和C分別為VLPs電子顯微鏡低倍和高倍觀察分析照片。
圖5VLPs免疫接種小鼠誘導(dǎo)的特異性抗HA和抗NA抗體㈧和H5W特異性病毒中和抗體(B)效價(jià)分析。
圖6VLPs免疫接種小鼠誘導(dǎo)抗H5W禽流感病毒致死攻擊的免疫保護(hù).A為免疫接種小鼠和非免疫小鼠體重變化；B為免疫接種小鼠和非免疫小鼠抗強(qiáng)毒株致死攻擊的存活率比較。
圖7VLPs免疫接種小鼠產(chǎn)生抗異源H5W禽流感病毒非致死攻擊的免疫保護(hù)檢測(cè).A為免疫接種小鼠和非免疫小鼠攻毒感染后肺病毒滴度比較；B和C為免疫接種小鼠和非免疫小鼠攻毒感染后肺組織病理變化比較(C顯示非免疫接種小鼠肺組織明顯的病理?yè)p傷；B顯示VLPs免疫接種小鼠顯著降低的組織病理?yè)p傷)；D為正常小鼠肺組織學(xué)觀察。
具體實(shí)施方式
[0026]下面結(jié)合具體實(shí)施例。進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明的具體實(shí)驗(yàn)條件和方法， 通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南等書中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
^MM 1H5N 1禽、流感病毒病毒樣顆粒(VLPs)瘡苗 射如聿與檢測(cè)丨
1.引物的設(shè)計(jì)合成
根據(jù)WHO推薦的H5W人禽流感病毒疫苗株
A/reassortant/NIBRG-14 (H5N1)(A/Viet Nam/1194/200 Puerto Rico/8/1934) 基因組序列中血凝素HA編碼序列(Genbank No. GQ4M861)、神經(jīng)氨酸酶NA序列(Genbank No. GQ454862)和基質(zhì)蛋白M序列(Genbank No. GQ4M867)，分別設(shè)計(jì)合成三對(duì)特異性引物， 分別擴(kuò)增HA、NA和Ml基因；設(shè)計(jì)一條A型流感病毒通用引物用于cDNA合成；各引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成；各引物的序列和編號(hào)如下
1) HA基因PCR擴(kuò)增引物
上游引物Pl (SEQ ID NO. 1)
5 ‘ -TACCCGGGGCCAGCATGGAGAAAATAGT-3‘
下游引物P2 (SEQ ID NO. 2)
5 ‘ -GGCTAGCTTAAATGCAAATTCTGC-3‘
(擴(kuò)增產(chǎn)物5'端含有XmaI位點(diǎn)，3'端含有NheI位點(diǎn))
2) NA基因PCR擴(kuò)增引物
上游引物P3 (SEQ ID NO. 3)
5 ‘ -TGCCCGGGGCCACCATGAATCCAAATCA-3‘
下游引物P4 (SEQ ID N0. 4)
5' -CGCTAGCCTACTTGTCAATGGTG-3‘
(擴(kuò)增產(chǎn)物5'端含有XmaI位點(diǎn)，3'端含有NheI位點(diǎn))
3) M基因PCR擴(kuò)增引物
上游引物P5 (SEQ ID N0. 5)
5 ‘ -TGTCGACGCCACCATGAGTCTTCTAACC-3‘
下游引物P6 (SEQ ID N0. 6)
5 ‘ -GCTAAGCTTTCACTTGAATCGCTGCAT-3‘
(擴(kuò)增產(chǎn)物5'端含有MlI位點(diǎn)，3'端含有HindIII位點(diǎn))
4)A型流感病毒通用逆轉(zhuǎn)錄引物(SEQ ID N0. 7)
5 ‘ -AGCAAAAGCAGG-3‘
2. H5N1禽流感病毒人用疫苗種毒株(NIBRG-14)總RNA提取及cDNA合成
取100 μ 1NIBRG-14 (Η5Ν1)病毒雞胚尿囊液，用總RNA提取試劑盒(一步法總RNA 抽提試劑盒，BSC51S1，上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品)，按試劑盒操作說明書介紹的方法提取病毒總RNA。提取的RNA溶于16 μ 1 DEPC處理過的水中，加入1 μ 1通用逆轉(zhuǎn)錄引物 (SEQ ID NO. 7)，70°C反應(yīng)5min，迅速冰浴5min，加入逆轉(zhuǎn)錄混合液5Χ逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 (RT Buffer) 5 μ 1，ClNTI3S(IOyM)O. 5 μ 1，RNA 酶抑制劑(RNsin)O. 5 μ 1, M-MLVl μ L· 在 PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行以下反應(yīng)42°C 60min,95°C 5min，置冰浴，產(chǎn)物即為病毒基因組cDNA，凍存?zhèn)溆谩?br>3. PCR 擴(kuò)增
以步驟2合成的H5m禽流感病毒cDNA為模板，PCR分別擴(kuò)增HA，NA和Ml基因， 擴(kuò)增反應(yīng)體系和具體反應(yīng)條件如下
1) HA基因擴(kuò)增
cDNA 模板2 μ 1
Pl (10 μ Μ)1 μ 1
Ρ2(10μΜ)1 μ 1
ΝΤΡ(ΙΟμΜ)1 μ 1
10XPCR 緩沖液5 μ 1
pfu DNA 聚合酶(5U/μ 1)1 μ 1
ddH2039 μ 1
用移液器將上述組分混勻，在PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行以下反應(yīng)95°C變性5min，再 950C 30Sec,52°C 30Sec,72°C 20(^ec 進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)。72°C IOmin0
2) NA基因擴(kuò)增
cDNA 模板2 μ 1
Ρ3(10μΜ)1 μ 1
Ρ4(10μΜ)1 μ 1
ΝΤΡ(ΙΟμΜ)1 μ 1
10 X PCR 緩沖液5μ1
pfu DNA 聚合酶(5U/ μ 1)1 μ 1
ddH2039 μ 1
用移液器將上述組分混勻，在PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行以下反應(yīng)95°C變性5min，再 950C 30Sec,52°C 30Sec,72°C 17(^ec 進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)。72°C反應(yīng) IOmin0
3) Ml基因擴(kuò)增
cDNA 模板2 μ 1
Ρ5(10μΜ)1 μ 1
Ρ6(10μΜ)1 μ 1
ΝΤΡ(ΙΟμΜ)1 μ 1
10 X PCR 緩沖液5μ1
pfu DNA 聚合酶(5U/ μ 1)1 μ 1
ddH2039 μ 1
用移液器將上述組分混勻，在PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行以下反應(yīng)95°C變性5min，再 950C 30Sec,52°C 30Sec,72°C 12(^ec 進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)。72°C IOmin
4.含HA、NA和Ml基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFBDM/HANAMl和pUCDM/HANAMl構(gòu)建
1)用限制性核酸內(nèi)切酶Xma I和Nhe I雙酶消化pFBDM 載體(Redbiotec公司產(chǎn)品)，然后用Xma I和Nhe I雙酶消化步驟3. 1) PCR擴(kuò)增的HA產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳，DNA 回收試劑盒(W5211，上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品，下同)分別回收DNA片段(按試劑盒說明書操作)，以1 3的比例連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑起重組子陽(yáng)性克隆接種5毫升LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，質(zhì)粒純化試劑盒(Omiga公司產(chǎn)品，下同)提取質(zhì)粒 DNA (按試劑盒說明書操作)，經(jīng)酶切分析和核苷酸測(cè)序驗(yàn)證，獲得重組質(zhì)粒pFBDM/HA。
2)用限制性核酸內(nèi)切酶Ml I和HindIII雙酶分別消化pFBDM/HA載體和步驟 3.3)PCR擴(kuò)增的Ml產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳，DNA回收試劑盒回收DNA片段，以1 3的比例連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑起重組子陽(yáng)性克隆接種5毫升LB培養(yǎng)基中37 V培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒(操作步驟同4. 1)，獲得重組質(zhì)粒pFBDM/HAMl。
3)用限制性核酸內(nèi)切酶Xma I和Nhe I雙酶分別消化pFBDM載體和步驟3. 2PCR 擴(kuò)增的NA物，瓊脂糖凝膠電泳，DNA回收試劑盒回收DNA片段，以1 3的比例連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑起重組子陽(yáng)性克隆接種5毫升LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒(操作步驟同4. 1)，獲得重組質(zhì)粒pFBDM/NA。
4)用RneI和AvrII消化pFBDM/HAMl，凝膠電泳分離，DNA回收試劑盒純化HAMl融合片段；用SpeI和NruI消化pFBDM/NA凝膠純化得線性化的pFBDM/NA，把線性化的pFBDM/ NA和MHAWl 3的比例連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，從相應(yīng)的抗性平板上挑斑。 并用菌落PCR鑒定出陽(yáng)性克隆。從5毫升大腸桿DH5ci菌培養(yǎng)物中37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒DNA，提取質(zhì)粒(操作步驟同4. 1)，獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFBDM/HANAMl。
5)用PmeI和AvrII酶切pFBDM/HANAMl，凝膠電泳分離，DNA回收試劑盒純化 HANAMl融合片段；用PmeI和AvrII酶切pUCDM，凝膠電泳分離，DNA回收試劑盒純化線性化質(zhì)粒PU⑶M，pUCDM與HANAMl融合片段按1 3的比例混合連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BW23474，從相應(yīng)的抗性平板上挑斑。并用菌落PCR鑒定出陽(yáng)性克隆。從5毫升大腸桿BW23474菌培養(yǎng)物中37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒(操作步驟同4. 1)，獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pUCDM/HANAMl。
5.重組Bacmid的獲得
1)制備感受態(tài)大腸桿菌DH10Multibac&e
采用CaCl2法制備大腸桿菌DHlOMultibacte (Redbiotec公司產(chǎn)品)感受態(tài)細(xì)胞。 具體地，取1. 5ml培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液至2ml離心管中，冰浴IOmin ；4°C，4200rpm離心 5min ；棄去上清，加入Iml預(yù)冷0. IM CaCl2溶液重懸細(xì)胞，冰浴IOmin ；4°C，4200rpm離心 5min，棄去上清，加入100 μ 1預(yù)冷0. IM CaCl2溶液重懸細(xì)胞；4°C保存過夜，次日用于轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物；或者加入DMSO，-70°C長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?br>2)重組質(zhì)粒在宿主菌DHlOMultibacte中重組
將純化的重組質(zhì)粒pFBDM/HANAMl轉(zhuǎn)化DH10Multibac&e，按照 MultibacExpression System說明書操作。具體地，取1 μ 1重組質(zhì)粒pHANAMl加入 100 μ IDHlOMultibactte感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min ；42°C，熱激45sec ；冰浴^iiin ； 加入二抗的LB培養(yǎng)基(卡那霉素50 μ g/ml和四環(huán)素10 μ g/ml) ,37V, 200rpm培養(yǎng)4h ；將轉(zhuǎn)化DHlOMultibactte培養(yǎng)菌液10倍梯度稀釋，每梯度取200 μ 1涂布含有X_gal (100 μ g/ ml)和IPTG (40 μ g/ml)的三抗平板(含卡那霉素50 μ g/ml，四環(huán)素10 μ g/ml，慶大霉素 7口8/1111)，371靜置培養(yǎng)36-4 1。挑取白色菌落，繼續(xù)在含有X_gal和IPTG三抗平板(含卡那霉素50 μ g/ml,四環(huán)素10 μ g/ml，慶大霉素7 μ g/ml)上畫線兩次，挑取白色菌落，獲得含重組Bacmid克隆。[0093]雙表達(dá)盒重組Bacmid制備將純化的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFBDM/HANAMl和pUCDM/ HANAMl 共轉(zhuǎn)化 DHlOMultibacte，按照 Multibac Expression System 說明書操作。具體地， 取 2-4 μ g 重組質(zhì)粒 pHANAMl 和 2-4 μ g pUCDM/HANAMl 加入 100 μ IDHlOMultibaccre 感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min ；42°C，熱激45sec ；冰浴aiiin ；加入二抗LB培養(yǎng)基(含卡那霉素 50μ g/ml，四環(huán)素 10μ g/ml)，37°C，200rpm 培養(yǎng) 4h ；將轉(zhuǎn)化 DHlO Multibacte 培養(yǎng)菌液10倍梯度稀釋，每梯度取200μ 1涂布含有X-gal(100yg/ml)和IPTG (40 μ g/ml)的四抗平板上(卡那霉素50 μ g/ml，四環(huán)素10 μ g/ml，慶大霉素7 μ g/ml，氯霉素25 μ g/ml)，37°C 靜置培養(yǎng)36-4他。挑取白色菌落，繼續(xù)在含有X-gal和IPTG的四抗平板上畫線兩次，挑取白色菌落，獲得含重組Bacmid的克隆。
3)重組 Bacmid(rbacmid)提取
經(jīng)抗性和藍(lán)白斑篩選獲得純r(jià)bacmid菌落，挑取純培養(yǎng)工程菌落，接種5ml液體LB，37°C培養(yǎng)；14000g離心lmin，收集菌體；棄去上清，沉淀用0. 3ml溶液I，重懸；力口入0. 3ml溶液II，輕輕混勻，室溫靜置5min ；慢慢加入0. 3ml 3M乙酸鉀，混勻，冰上靜置 5min ； 14000g,離心IOmin ；將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管，再加入0. 8ml異丙醇，混勻，冰上放置 IOmin ；4°C，14000g離心15min ；用70%的乙醇洗兩次，室溫放置讓乙醇揮發(fā)；TE(pH7. 4)溶解，_20°C保存?zhèn)溆?。獲得穿梭質(zhì)粒rbacmid/HANAMl。
4)rbacmid 鑒定
由于rbacmid基因組大，不能直接進(jìn)行酶切鑒定，采用引物特異性PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測(cè)序加以驗(yàn)證。按步驟5. 3)提取重組bacmid作為模板，用引物P1(SEQID NO. 1)與P2 (SEQ ID N0.2)、P3(SEQ ID NO. 3)與 P4(SEQ ID N0.4)、P5(SEQ IDNO. 5)與 P6 (SEQ ID NO. 6)分別進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出HA、NA和Ml基因，瓊脂糖凝膠電泳分離，DNA試劑盒純化各種PCR產(chǎn)物， 測(cè)序驗(yàn)證正確的克隆用于拯救重組桿狀病毒。
6.重組桿狀病毒的拯救
1) Sf9昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)
采用貼壁方式培養(yǎng)Sf9細(xì)胞拯救重組桿狀病毒。從液氮罐取出1支Sf9種子細(xì)胞， 37°C水浴快速解凍，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至15ml無菌離心管，加入27°C預(yù)溫的Grace' s培養(yǎng)液 (含10%胎牛血清)中，輕輕混勻，IOOOrpm離心5min，棄上清，細(xì)胞用10ml Grace' s培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)懸浮，接種到T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置27°C靜置培養(yǎng)4-6天至細(xì)胞單層形成。
2)重組桿狀病毒的產(chǎn)生
采用Lipofectamine2000 (invitrogen 公司產(chǎn)品)將穿梭質(zhì)粒 rbacmid/HANAMl 轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞，拯救重組桿狀病毒。轉(zhuǎn)染過程參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體步驟如下取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞，用0. 25%的胰酶消化，按每孔2-4 X IO5個(gè)細(xì)胞的濃度鋪于6孔板(6 孔板，Corning公司產(chǎn)品)，待細(xì)胞80%-90%密度單層；用96 μ 1 Grace' s (無血清)稀釋 4 μ g 重組 bacmid DNA,輕輕混勾；取 8 μ ILipofectamine 力口入 92 μ 1 Grace ‘ s (無血清)， 輕輕混勻；靜置15min，將重組質(zhì)?；旌衔锞徛尤氲街|(zhì)體混合物中，輕輕混勻，27°C，孵育30min ；期間用無血清Grace' s培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，向細(xì)胞孔內(nèi)加入800 μ 1 Grace‘ s (無血清)；將脂質(zhì)體-質(zhì)?；旌衔锏渭拥郊?xì)胞孔中，輕輕混勻，27°C，培養(yǎng)箱孵育他后，吸去轉(zhuǎn)染混合物，換用含2 %胎牛血清的Grace ‘ s培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4_6天，將細(xì)胞凍融1次，4°C 500g離心lOmin，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，獲得表達(dá)禽流感HA、NA和Ml蛋白的重組桿狀病
ο
3)重組桿狀病毒的克隆純化
采用有限稀釋法純化桿狀病毒。具體方法如下在96孔板中，按5X IO5細(xì)胞/ml 的量鋪板50 μ 1，他；待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍；將病毒液加入Grace ‘ s 培養(yǎng)基(無血清)至100 μ 1稀釋到10_7，吸取1μ 1病毒液加入到細(xì)胞孔中，Ih ；棄去培養(yǎng)基，加Grace' s培養(yǎng)基胎牛血清)100 μ 1，27°C孵育72h ；挑取一孔中僅有一個(gè)細(xì)胞被感染的單個(gè)細(xì)胞；按5 X IO5細(xì)胞/ml的量鋪板50 μ 1于96孔板中，將前面挑取的單個(gè)感染細(xì)胞放入該96孔板細(xì)胞孔中培養(yǎng)，27°C孵育72h，收取上清；按5X IO5細(xì)胞/ml的量鋪板200 μ 1，上一步驟收取的上清轉(zhuǎn)移到M孔細(xì)胞板中，擴(kuò)大培養(yǎng)，直至得到滴度較高的重組桿狀病毒。此時(shí)得到的病毒再按上述步驟操作一次，即可得到純化的重組桿狀病毒。
7.重組桿狀病毒的鑒定
1) PCR鑒定重組桿狀病毒
按基因組DNA提取試劑盒說明書(Solarbio，Beingjing Solarbio 2008)提取重組桿狀病毒基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)制備的DNA完整性和濃度。以所制備的 DNA 為模板，用引物 Pl (SEQ ID NO. 1)與 P2 (SEQ ID NO. 2)、P3 (SEQ IDN0. 3)與 P4(SEQ ID NO. 4)、P5(SEQ ID NO. 5)與 P6 (SEQ ID NO. 6)分別進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增出 HA、NA 和 Ml 基因，測(cè)序驗(yàn)證。
2)間接免疫熒光染色檢測(cè)重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞中目的蛋白表達(dá)
取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞單層，用0.25%胰酶消化，用Grace' s培養(yǎng)液 (8-10%胎牛血清)制成IX IO5細(xì)胞懸液，接種于6孔板(lml/孔)，27°C靜置培養(yǎng)48h。 取200 μ 1重組桿狀病毒液，用6ml無血清Grace ‘ s稀釋，加入生長(zhǎng)Sf9細(xì)胞的6孔板中(0.5ml/孔)，不加病毒稀釋液的孔為陰性對(duì)照；27°C靜置lh。吸棄病毒液，換成含2% 胎牛血清Grace' s培養(yǎng)液，27 °C繼續(xù)培養(yǎng)48h。棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞1次；加入 200μ 1-20°C預(yù)冷丙酮/甲醇混合液(1 1，vol/vol)，室溫固定IOmin ；吸棄丙酮/甲醇混合液，PBST洗滌細(xì)胞2次，5min/次；加入稀釋的抗-HA或抗-NA多克隆抗體(1 800稀釋)QOO μ 1/孔)，37°C作用Ih ；吸棄抗體混合液，PBST洗滌3次，5min/次；加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(l 200) (31460,Pierce公司產(chǎn)品)，37°C避光作用Ih ；吸棄標(biāo)記抗體混合液，PBST洗滌3次，5min/次；在熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
結(jié)果顯示，感染重組桿狀病毒的Sf9細(xì)胞中能表達(dá)H5m禽流感病毒HA和NA蛋白。
3) Western Blotting重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞中HA、NA和Ml蛋白質(zhì)表達(dá)
用抗-HA、抗-NA、抗-Ml多克隆抗體或三者的混合組分為一抗，Westernblotting 分析相應(yīng)蛋白表達(dá)。具體步驟包括
(1)樣品處理重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞(T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶)7 后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞，上清液真空凍干，加入200 μ 1 PBS重懸。細(xì)胞用細(xì)胞刮收集，200 μ 1 PBS重懸細(xì)胞。取200 μ 1細(xì)胞重懸液和上清液(凍干粉重懸液體積)，分別加入等體積樣品緩沖液 (Loading buffer)混勻，水浴鍋煮沸5分鐘，冷卻備用。
(2)蛋白質(zhì)組分SDS-PAGE電泳分離采用5%濃縮膠、10%分離膠進(jìn)行電泳。具體按《分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》進(jìn)行。為便于比較，電泳加樣時(shí)使用相同體積的各樣品。[0115](3)轉(zhuǎn)膜與抗體反應(yīng)待電泳結(jié)束，取出凝膠并用清水洗滌。同時(shí)用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡硝酸纖維膜(NC)和濾紙5min，按陰極-海綿-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-海綿-陽(yáng)極順序鋪設(shè)凝膠和NC膜，放入電泳槽，88V電壓低溫條件下電泳池。取出NC膜用1 X PBST (% Tween-20的PBS)洗滌5min，加入含5%脫脂奶粉的PBST封閉緩沖液(blocking buffer)， 37°C孵育池。PBST洗滌NC膜3次，每次lOmin。加入兔抗HA、抗NA和Ml多克隆抗體混合物(1 500PBST稀釋)，37°C孵育2h。PBST充分洗滌NC膜3-5次，每次lOmin。加入HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(31460，Pierce公司產(chǎn)品，PBST 1 3000稀釋)，37°C孵育lh, PBST 充分洗滌NC膜3-5次，每次lOmin。加入DAB顯色液(具體配方見《分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》)， 室溫避光顯色5-lOmin，清水洗NC膜觀察記錄結(jié)果。
結(jié)果顯示，本發(fā)明制備的重組桿狀病毒能同時(shí)表達(dá)HA、NA和Ml蛋白(圖3)
8.重組桿狀病毒增殖和滴度測(cè)定
1)重組桿狀病毒的增殖
取0. Iml經(jīng)克隆化的重組桿狀病毒液稀釋至5ml (含8-10 %胎牛血清的 Grace' s)，接種70-80%的Sf9細(xì)胞單層上(T25瓶)，輕輕混勻，27°C靜置培養(yǎng)48_72h，凍融細(xì)胞1次，細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，4°C，500g離心lOmin，收獲上清液，記錄重組病毒代次，-70°C或液氮中凍存?zhèn)溆谩?br>2)病毒滴度測(cè)定
取生長(zhǎng)良好的Sf9細(xì)胞，0.25%胰酶消化，加入Grace' s培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，使?jié)舛认♂屩?X IO5細(xì)胞/ml，按Iml/孔接種6孔板，27°C，靜置培養(yǎng)48_72h。
待Sf9細(xì)胞長(zhǎng)至70-80%單層，用無血清無抗生素的Grace' s培養(yǎng)基輕輕沖洗細(xì)胞，取重組病毒原液用無血清無抗生素的Grace ‘ s培養(yǎng)基10倍梯度稀釋，加入到Sf9細(xì)胞單層上(lml/孔)，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平行孔；27°C，靜置吸附Ih ；吸棄病毒液，換成含甲基纖維素的Grace' s培養(yǎng)基(8_10%胎牛血清)，27°C，靜置培養(yǎng)4_6天，觀察空斑形成。
每個(gè)細(xì)胞孔用200 μ 1福爾馬林固定30min，加入的結(jié)晶紫(5(^1/孔)，室溫染色lh，清水輕輕沖洗后，再加入中性紅復(fù)染30min ；沖洗、晾干后計(jì)數(shù)空斑；計(jì)算病毒效價(jià) pfu/mlο
3)重組桿狀病毒基因組遺傳穩(wěn)定性測(cè)定
重組桿狀病毒按MOI = 3接種70-80%單層Sf9細(xì)胞，27°C，靜置培養(yǎng)4-6天，收獲病毒液；按相同方法連續(xù)傳代20代次以上，收獲各代次病毒液，分裝，凍存-70°C或液氮中， 備用。
分別取第5代、第10代、第15代和第20代的病毒液，提取病毒基因組，按基因組 DNA提取試劑盒說明書(Solarbio，Beingjing Solarbio 2008)進(jìn)行，采用特異性引物PCR 擴(kuò)增HA、NA基因片段，測(cè)序分析兩個(gè)基因的核苷酸序列。
結(jié)果顯示，重組桿狀病毒在Sf9細(xì)胞上連續(xù)傳代20代次，抗原蛋白編碼基因HA和 NA未發(fā)生突變。
實(shí)施例2H5m禽流感病毒病毒樣顆粒(VLPs)疫苗的規(guī)?；苽浼皺z定
1. Sf9昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)條件優(yōu)化與規(guī)模化細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
1)重組桿狀病毒最佳接種濃度優(yōu)化
取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞，0. 25%胰酶消化，接種到6孔板中，細(xì)胞形成約80%單層，分別以MOI = 0. 01、0. 1、1、3、5和10幾種不同稀釋度接種第三代重組桿狀病毒，吸附 Ih后，更換新鮮Grace' s培養(yǎng)液胎牛血清)，于27°C靜置培養(yǎng)，分別于接種病毒后2、 3、4、5、6和7天各收獲病毒液。
按步驟8. 2的方法測(cè)定各MOI感染劑量在不同增殖時(shí)間后的病毒滴定，確定重組桿狀病毒的最佳感染劑量和增殖培養(yǎng)時(shí)間。
結(jié)果表明，在Sf9細(xì)胞中，重組桿狀病毒最佳接種濃度為MOI = 3或MOI = 5;接種病毒72-120h后獲得最高病毒滴度。
2)細(xì)胞初始接種密度確定
取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，用Grace' s (8_10%胎牛血清) 配制成5 X 105/ml細(xì)胞懸液，按IOml/瓶接種在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每批接種10-20瓶，27°C 靜置培養(yǎng)4-6天，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層，吸棄Grace ‘ s培養(yǎng)液，用0. 25 %胰酶消化后，加入新鮮 Grace' s培養(yǎng)液(含8-10%胎牛血清)懸浮細(xì)胞；
取0. Iml細(xì)胞懸液，用PBS (pH7. 4)稀釋至lml，加入等體積4%臺(tái)盼藍(lán)染色液，室溫染色5-lOmin，輕輕混勻，滴注細(xì)胞計(jì)數(shù)板中顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。
按2-4X IO5細(xì)胞/ml的密度，將Sf9細(xì)胞接種到轉(zhuǎn)瓶中，根據(jù)細(xì)胞總數(shù)加入200-1000ml培養(yǎng)基和終濃度10U/ml的肝素鈉(商品肝素鈉粉劑的活性單位 150-190U/lmg)，27°C，28rpm懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。每日無菌條件下吸取Iml懸浮培養(yǎng)液，加入等體積4%臺(tái)盼藍(lán)染色液染色5-lOmin，顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞密度和存活率。結(jié)果顯示， Sf9細(xì)胞懸浮培養(yǎng)42-%h密度達(dá)2X IO6細(xì)胞/ml、細(xì)胞存活率在90%以上，此時(shí)進(jìn)行重組病毒接種。
2.病毒樣顆粒的純化
1)待懸浮細(xì)胞擴(kuò)增至濃度約為2X106細(xì)胞/ml、細(xì)胞存活率在90%以上時(shí)，按MOI =3的劑量接種重組桿狀病毒rBV-HANAMl，于27°C，28rpm繼續(xù)懸浮培養(yǎng)72h。
2)收取接種了重組桿狀病毒的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)移至50_250ml離心管中進(jìn)行差速離心，即:4°C, IOOg 離心 5min, 500g 離心 5min, IOOOg 離心 5min, 1500g 離心 5min, 2000g 離心lOmin，最后4000g離心30min，收取上清。
3)取50_250ml Beckman離心管(離心管大小視樣品量選取)2-6只，離心管底部鋪30%蔗糖溶液10ml，將步驟2. 2)制備的培養(yǎng)上清液緩緩加入到離心管蔗糖層上，4°C， 40，OOOg，離心3-4h ；棄去上清液，用l_2ml預(yù)冷的無菌PBS重懸沉淀物。
4)取10_50ml Beckman離心管2_6只，向離心管底部加入濃度梯度20% -60% 蔗糖溶液，每個(gè)蔗糖梯度溶液加3-細(xì)1，用Iml注射器吸取各蔗糖梯度溶液，深入離心管底部，由低濃度加到高濃度，將步驟2. 3)制備的樣品混合物小心加入到蔗糖溶液頂層，4°C， 100, 000g，離心12-14h ；用注射器分別收集各蔗糖層樣品，采用Western blot、血凝試驗(yàn)分別檢測(cè)樣品中HA、NA、Ml蛋白表達(dá)和VLPs血凝活性；采用磷鎢酸溶液染色，電鏡觀察VLPs 結(jié)構(gòu)。
3.病毒樣顆粒的檢定
Dffestern blot檢測(cè)SF9細(xì)胞系中病毒蛋白(HA，NA和Ml)的表達(dá)方法同實(shí)施例 1步驟7. 4。
2)血凝活性測(cè)定[0146]取96孔V型血凝板，向第二列至第十二列孔加入生理鹽水(5(^1/孔)，在第一孔內(nèi)加入50 μ 1純化的VLPs樣品液，在第二列孔內(nèi)加入50 μ 1純化的VLPs樣品液，混合數(shù)次，吸出50μ 1加入至第三列孔，混勻，依次系列倍比稀釋至第十一列，混勻后棄去50μ 1混合液，第十二列孔作為陰性對(duì)照。每孔加入50μ 1 的雞紅細(xì)胞懸液，輕輕混勻，室溫靜置 10-30min，至陰性對(duì)照孔紅細(xì)胞完全沉淀時(shí)開始觀察結(jié)果。
以測(cè)定管出現(xiàn)紅細(xì)胞完全凝集的抗原最高稀釋倍數(shù)作為該樣品的凝集效價(jià)。結(jié)果顯示，經(jīng)蔗糖梯度離心分離純化的H5W禽流感VUs血凝效價(jià)為1 32-1 64。
3)病毒樣顆粒的電子顯微鏡檢測(cè)
取純化的VLPs樣品液1-2滴，滴加在銅網(wǎng)支持膜上，作用Imin后用濾紙沿銅網(wǎng)邊緣吸干，向樣品銅網(wǎng)上滴加1-2滴2%磷鎢酸染色液(蒸餾水配制，pH 6. 8)，室溫染色 lmin，濾紙沿銅網(wǎng)邊緣吸干，將制備好的負(fù)染色樣品置透射電子顯微鏡下觀測(cè)，記錄結(jié)果。
電鏡觀察結(jié)果顯示，本發(fā)明描述技術(shù)獲得的H5m禽流感病毒VUs呈典型的流感病毒顆粒結(jié)構(gòu)(圖4B、4C)。
^MM 3H5N1禽、流感病毒病毒樣顆粒(VLPs)瘡苗的功能檢測(cè)丨
為了評(píng)價(jià)H5W禽流感病毒VLPs疫苗的安全性和免疫效力，本發(fā)明采用BALB/c小鼠為動(dòng)物模型。
1. H5N1禽流感病毒VLPs疫苗安全性評(píng)價(jià)
取5-6周齡健康雌性BALB/c小鼠20只，隨機(jī)分成2組，每組10只，A組小鼠肌肉注射H5m禽流感病毒VLPs疫苗(劑量每只小鼠10 μ g/100 μ 1)，B組小鼠肌肉注射100 μ 1 無菌PBS作為陰性對(duì)照。
小鼠注射后觀察21天，測(cè)量體重變化，分別于5、7、9、14和21天，尾部采血，計(jì)數(shù)
白細(xì)胞數(shù)量。
結(jié)果顯示，VLPs接種組和PBS對(duì)照組小鼠體重變化和各采血時(shí)間點(diǎn)白細(xì)胞數(shù)量無
顯著差異。
2. H5W禽流感病毒VLPs疫苗效力評(píng)價(jià)
1) VLPs疫苗小鼠免疫接種
取5-6周齡健康雌性BALB/c小鼠45只，隨機(jī)分成3組(A、B、C組)，每組15只， 疫苗接種前小鼠斷尾采血，分離血清用于抗體檢測(cè)。a、B組為實(shí)驗(yàn)組，分別用本發(fā)明所描述 H5N1VLPS疫苗采用后腿肌內(nèi)注射方法免疫接種，劑量為10 μ g/100 μ 1的VLPs (總蛋白含量)；C組小鼠肌肉注射ΙΟΟμΙ PBS作為陰性對(duì)照。每組小鼠免疫三次，間隔14天。
第三次免疫后第7天，每組選取5只，斷尾取血以分離血清備用。 2) VLPs疫苗小鼠體液免疫應(yīng)答檢測(cè)
(1)間接ELISA法測(cè)定小鼠血清中HA抗體效價(jià)。具體步驟包括
包被用被緩沖液(0. 05Μ PH 9. 6的碳酸鹽緩沖液)將重組HA蛋白(本實(shí)驗(yàn)室制備保存)稀釋至5yg/ml，包被96孔ELISA酶標(biāo)板(Corning公司產(chǎn)品，下同)每孔100 μ 1， 4°C包被過夜；
封閉將包被HA抗原的ELISA酶標(biāo)板用PBS-T (PBS含0. 1 % Tween-20, pH 7. 5，下同)洗滌5次，每次5min ；加入100 μ 1封閉液(含3% BSA的PBST)，37°C封閉60min ；PBST 洗滌5次后。[0165]加待檢血清小鼠血清用含BSA的PBST作1 100梯度稀釋，將稀釋血清加入ELISA酶標(biāo)板各孔中(100 μ 1/每孔)，37°C孵育60min ；PBST洗滌5次。
加酶標(biāo)二抗二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體(31432Pierce公司產(chǎn)品)，用含BSA的PBSIMtl 5000稀釋，加入ELISA板各孔中(100 μ 1/每孔)，37°C作用60min ；PBST洗滌5次。
加入顯示底物溶液向酶標(biāo)板各孔中加入顯色底溶液(含0. 045% H2O2，0. 4mg/ml o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD)的磷酸-檸檬酸鹽緩沖液)，每孔 100 μ 1， 37°C避光顯色15min ；每孔加入2M H2S0450 μ 1終止反應(yīng)。
OD492值測(cè)定在酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)492nm處測(cè)定每孔內(nèi)光密度吸收值(0D㈣)
結(jié)果表明，本發(fā)明制備的VLPs疫苗免疫接種小鼠能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平特異性 HA抗體(圖5A)。
(2)血凝抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)定免疫接種小鼠血清中和抗體效價(jià)
將待檢血清與受體破壞酶(RDE)按1 4比例混合，37°C作用14h，再56°C作用Ih 以滅活RDE ；將處理好的待檢血清用生理鹽水做系列倍比稀釋，加入到血凝板各孔中，每孔 25 μ 1 ；然后向每孔加入25 μ 1含有8個(gè)血凝單位的滅活A(yù)/VietNam/1194R(H5Nl)病毒液， 混勻，室溫靜置30min，向每孔加入50 μ 1 1 %雞紅細(xì)胞懸液，混勻，室溫靜置30-60min，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。血凝效價(jià)定義為能夠100%抑制紅細(xì)胞凝集的血清稀釋度。
結(jié)果表明，本發(fā)明制備的VLPs疫苗免疫接種小鼠能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生H5W禽流感病毒中和抗體(圖5B)。
3) VLPs疫苗接種小鼠抗H5W禽流感病毒攻擊感染的免疫保護(hù)
(1)疫苗接種誘導(dǎo)機(jī)體抗H5W同源強(qiáng)毒株致死攻擊感染的保護(hù)效力
VLPs疫苗第三次加強(qiáng)免疫后第14天，稱量小鼠體重，然后用乙醚麻醉小鼠，滴鼻接種A/Viet Nam/1194R(H5N1)病毒液50 μ 1 (IOLD5tl)；攻毒后每天觀察記錄小鼠發(fā)病和存活情況，每天稱量小鼠體重，觀察至攻毒感染后第14天，計(jì)算體重變化。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射PBS陰性對(duì)照組小鼠體重從攻毒后第2天開始降低，持續(xù)直至所有小鼠死亡；VLPs免疫組小鼠的體重從攻毒感染后第4天開始降低，第6天體重開始恢復(fù)，第10天體重恢復(fù)到初始水平；觀察至攻毒感染后第14天所有小鼠存活(圖6Α、6Β)。表明VLPs免疫接種能夠誘導(dǎo)小鼠抵抗同源H5W禽流感病毒攻擊的免疫保護(hù)。
(2)疫苗接種誘導(dǎo)機(jī)體抗H5W異源毒株攻擊感染的保護(hù)效力
VLPs疫苗第三次加強(qiáng)免疫后第14天，稱量小鼠體重，用乙醚麻醉小鼠，滴鼻接種 A/Hubei/489(H5N1)病毒液50 μ 1 (IO3EID5tl)。攻毒感染后第6天，取5只小鼠，斷頸處死，無菌取出全肺，加入Iml PBS研磨勻漿，3000rpm離心lOmin，收集上清液，接種9-10日齡SPF 雞胚，觀察記錄雞胚死亡數(shù)，采用Reed-Muench法計(jì)算病毒效價(jià)。另取5只小鼠，斷頸處死， 取全肺置于10%福爾馬林固定lOmin，石蠟包埋、切片，HE染色分析肺組織病理變化。
結(jié)果顯示，VLPs疫苗免疫組小鼠肺組織病毒效價(jià)為2. 07士0. 811gEID50/肺，接種 PBS陰性對(duì)照組小鼠肺組織病毒效價(jià)為6. 9士0. 681gEID50/肺(圖7A)；與對(duì)照組小鼠相比，VLPs疫苗免疫組小鼠肺組織顯示更輕微的病理?yè)p傷(圖7D)，表明VLPs疫苗接種能誘導(dǎo)機(jī)體抵抗H5W禽流感病毒攻擊感染的免疫保護(hù)，抑制病毒在小鼠肺組織內(nèi)復(fù)制和加速病毒清除。
權(quán)利要求
1.一種H5m禽流感病毒樣顆粒疫苗的規(guī)?；苽浞椒?，其特征在于依次包括如下步驟1)重組質(zhì)粒rbacmid/HANAMl的構(gòu)建和提取；所述的重組質(zhì)粒rbacmid/HANAMl的構(gòu)建包括重組質(zhì)粒pFBDM/HANAMl和pUCDM/HANAMl的構(gòu)建及其在宿主菌DHlOMultibactte中重組，其中pFBDM/HANAMl是將H5m禽流感病毒HA、NA和Ml基因克隆到pFBDM 載體中制備， pUCDM/HANAMl是將H5m禽流感病毒HA、NA和Ml基因克隆到pUCDM載體中制備；2)將重組質(zhì)粒rbacmid/HANAMl轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞拯救重組桿狀病毒，在Sf9細(xì)胞內(nèi)裝配病毒樣顆粒；3)規(guī)模化Sf9細(xì)胞培養(yǎng)、重組病毒感染和病毒樣顆粒的純化。
2.如權(quán)利要求
1所述的H5W禽流感病毒樣顆粒疫苗的規(guī)模化制備方法，其特征在于 步驟3中所述的病毒樣顆粒的純化采用離心分離技術(shù)。
3.如權(quán)利要求
1所述的H5W禽流感病毒樣顆粒疫苗的規(guī)?；苽浞椒?，其特征在于 在Sf9細(xì)胞培養(yǎng)中，接種濃度為MOI = 3或MOI = 5。
4.如權(quán)利要求
1所述的H5W禽流感病毒樣顆粒疫苗的規(guī)模化制備方法，其特征在于 在Sf9細(xì)胞培養(yǎng)中，增殖培養(yǎng)時(shí)間為72-120h。
5.如權(quán)利要求
1所述的H5W禽流感病毒樣顆粒疫苗的規(guī)?；苽浞椒ǎ涮卣髟谟?在Sf9細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞初始接種密度為2 X IO6細(xì)胞/ml。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種新型H5N1禽流感病毒樣顆粒疫苗的規(guī)?；苽浞椒?。依次包括如下步驟1)重組質(zhì)粒rbacmid/HANAM1的構(gòu)建和提??；2)將重組質(zhì)粒rbacmid/HANAM1轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞拯救重組桿狀病毒，在Sf9細(xì)胞內(nèi)裝配病毒樣顆粒；3)規(guī)?；疭f9細(xì)胞培養(yǎng)、重組病毒感染和病毒樣顆粒的純化。該方法適用于大規(guī)模制備人用抗高致病性H5N1禽流感VLPs疫苗，安全高效，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N7/01GKCN101947317 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201010293705
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年9月27日
發(fā)明者朱丹丹, 潘茲書, 璩驍, 陶攀 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),