專利名稱:抗沙門氏菌口服疫苗的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)制藥領(lǐng)域，更具體地說，涉及沙門氏菌口服疫苗的制備。
背景技術(shù)：
據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織對國際食品安全的調(diào)查結(jié)果表示，近幾十年來，許多國家的食物傳染疾病食源性疾病的發(fā)生率一直在上升，其與食物中微生物引起的疾病增多有關(guān)。世界各國細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的常列榜首。沙門氏菌病是一種人畜共患病，禽肉禽蛋是主要傳播媒介，其特征是腹瀉、發(fā)熱、腹痛或痙孿、嘔吐、頭痛和惡心，嚴重時導(dǎo)致死亡。死亡病例多見于易感染人群，包括嬰兒、老人和免疫系統(tǒng)缺損者。自二十世紀七十年代以來，南、北美洲和歐洲各國報告沙門氏菌腸炎發(fā)病率有了大幅度的提高。美國疾病預(yù)防和控制中心(CDC)估計美國的沙門氏菌發(fā)病率為每年1500000例，給美國人在醫(yī)療費用和生產(chǎn)率方面造成的損失估計每年高達23. 29億美元(以1998年美 元計算)。CDC說，美國的沙門氏菌病肆虐42個州，引起上千人患病，其中毒事件與被沙門氏菌污染的雞蛋有關(guān)，全美緊急召回數(shù)億雞蛋。
沙門氏菌(Salmonella)是一種革氏陰性桿菌，共有A，B，Cl，C2，D，E1-E4，F(xiàn)，G，H，I等血清群。其血清型則很復(fù)雜，已確知有2000多種以上，其中最為普遍的是腸炎沙門氏菌。腸炎沙門氏菌是導(dǎo)致人類細菌性腸胃炎最常見的病原體(40-60%)。腸炎沙門氏菌感染的第一步是粘附于宿主腸粘膜上皮細胞表面，其過程是由沙門氏菌菌毛所介導(dǎo)的。目前，所報道的腸炎沙門氏菌菌毛有SEF14、SEF21、SEF17、SEF18、LPF、PEF和BFP。其中SEF14和SEF21在病原菌在粘膜上皮細胞粘附以及侵染過程中起關(guān)鍵作用。開發(fā)靶標(biāo)為SEF14和SEF21抗體，可以抑制腸炎沙門氏菌菌毛與腸管粘膜中的糖脂質(zhì)受體的結(jié)合，進而達到防治腸炎沙門氏菌感染的目的。
脂質(zhì)體是由類脂質(zhì)組成的人造細胞膜樣小球體，主要由磷酸類脂、膽固醇、硬脂胺等組成的單層或多層雙分子結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體既無毒性，又無免疫原性，并且在體內(nèi)有可降解性，是目前最有希望成為理想的粘膜免疫佐劑之一。因脂質(zhì)體因具有雙層膜的保護，其與蛋白質(zhì)抗原結(jié)合后，使蛋白質(zhì)抗原穩(wěn)定性更高，抗原不容易被胃酸以及蛋白酶所降解；脂質(zhì)體能夠定位于組織-粘膜相關(guān)樣淋巴組織(MALT)中的M細胞(membraneous epithelialcell)激活T細胞及B細胞，并有效地引入細胞內(nèi)增強機體的體液和細胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答；可減少抗原的劑量及接種次數(shù)；包裹有抗原的脂質(zhì)體能被儲存于巨噬細胞中緩慢釋放，從而使機體長時間保持高效價抗體，延長疫苗使用期。因此，本專利采用脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21抗原疫苗，有效保護SEF14和SEF21不被降解，使其在增強抗原性的基礎(chǔ)上還可以用于口服。
隨著該沙門氏菌污染的發(fā)展，國內(nèi)外針對沙門氏菌疫苗市場銷售金額和銷售數(shù)量呈明顯上升趨勢，有著最為廣泛的臨床需求基礎(chǔ)。我國由于缺乏具有自主知識產(chǎn)權(quán)的沙門氏菌疫苗，所用的疫苗均是外國進口疫苗，跨國醫(yī)藥公司紛紛進入中國，對我國沙門氏菌疫苗的自主創(chuàng)新造成了巨大的沖擊。[0006]申請者研發(fā)的脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21疫苗對沙門氏菌預(yù)防具有潛在的應(yīng)用價值。在前期研究的基礎(chǔ)上，并按照我國SFDA頒布的相關(guān)法規(guī)和要求，改進工藝，提高其表達水平和純化得率。同時建立了質(zhì)量標(biāo)準，補充了相應(yīng)的臨床前藥理毒理研究資料。將脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21疫苗開發(fā)成具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型沙門氏菌疫苗并推向產(chǎn)業(yè)化，造福全人類，具有極大的社會意義和廣泛的市場意義。
目前，有關(guān)沙門菌疫苗的專利及制備研究的文章及專利如下
(I) 一種抗沙門菌單鏈抗體與跨膜蛋白融合蛋白的制備方法(專利公開號200710305386. 7)
本發(fā)明涉及一種用于制備抗沙門菌屬O抗原單鏈抗體和跨膜蛋白的融合蛋白的方法。本發(fā)明還涉及包含所述融合基因的表達型重組體、包含所述表達型重組體的工程菌、由此工程菌表達和分離純化的目的融合蛋白scFvLH-pVIII (和scFvHL-pVIII)以及此融合 蛋白用于沙門菌屬的臨床檢驗診斷以及食品衛(wèi)生診斷。
(2) 一種快速檢測沙門菌的方法(專利公開號200810046809. 2)
本發(fā)明屬于食源性致病菌的快速檢測技術(shù)，具體說是一種對沙門菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)檢測方法。包括由樣品處理試劑、LAMP反應(yīng)試劑、BstDNA聚合酶的大片段、瓊脂糖、溴氛藍上樣緩沖溶液、溴化乙錠溶液組成的試劑的配制，以及擴增產(chǎn)物的檢測和沉淀產(chǎn)生的檢測程序。其步驟是首先設(shè)計特異性引物；其次是提取樣品DNA ;第三是反應(yīng)體系。該法較之目前采用的傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法、免疫檢測方法和其它分子生物學(xué)方法具有操作簡單、快速、無需特殊儀器試劑且靈敏特異的優(yōu)點?？蓱?yīng)用于食品和其它樣品中沙門菌的快速檢測。
(3)沙門菌屬抑制組合物(專利公開號99813816. 9)
沙門菌抑制組合物，其有效成分為用含有蔗糖的培養(yǎng)基使屬于明串珠菌(Leuconostoc)屬、鏈球菌(Streptococcus)屬、鏈桿菌(Streptobacterium)屬的乳酸菌發(fā)酵，得到的發(fā)酵液自身，或者是用水混合性有機溶劑進行分級沉淀處理后，由所得上清而來的制備物。
(4) Lim S M, Jung H S, Kim M J, et al. Immunogenicity and safe-ty of Vicapsular polysaccharide typhoid vaccine in healthy per-sons in Korea[J].JMicrobiol Biotechnol,2007,17(4) :611-615.
(5)Zhou W Ζ,Κοο H ff,ffang X Y, et al. Revaccination with locally-producedvi typhoid polysaccharide vaccine among Chineseschoo1-aged children safety andimmunogenicity finding s[J]. Pediatr Infect Dis J，2007，26(11) :1001-1005.
(6)Ochiai R L,Acosta C J,Agtini M,et al. The use of typhoid vaccines inAsia the DOMI experience[J]. Clin Infect Dis，2007，15 (45) :34-38.
(7) Kal jee L M, Pham V, Son N D, et al. Trial participation and vaccinedesirability for Vi polysaccharide typhoid fever vaccine in Hue City, VietNam[J]. Trop Med Int Health,2007,12(I) :25-36.
(S)Germanier于1975年用化學(xué)誘變劑亞硝基胍誘變及紫外線照射誘導(dǎo)非定點突變得到的。
文獻1、2僅提供了一種抗沙門菌的抗體與跨膜蛋白的制備技術(shù)，該專利盡可用于沙門菌的診斷、治療，無法起到對沙門菌的預(yù)防作用。文獻3提供了一種沙門菌屬抑制組合物，但該專利僅對沙門菌感染起到治療作用，無法起到有效的預(yù)防作用，且該組合物對機體存在著導(dǎo)致機體過敏、排異、胃腸道反應(yīng)等風(fēng)險。
文獻4-7提供了沙門菌經(jīng)典疫苗-針對Vi莢膜多糖疫苗的制備方法，Vi莢膜多聚糖既是毒力因子也是保護性抗原，Vi特異性血清抗體是激活針對傷寒沙門菌的補體所必需的。非常多的報道顯示，用莢膜多聚糖免疫可刺激產(chǎn)生針對傷寒沙門菌的保護性抗體反應(yīng)，并且相當(dāng)有效，在一些發(fā)展中國家特別是一些亞洲國家使用較多。然而接種這種疫苗會產(chǎn)生一些副作用。例如其保護效力與免疫原中Vi含量有關(guān)，劑量過高會引起抗體形成的抑制反應(yīng)。且用降解抗原結(jié)構(gòu)的方法制備的Vi抗原給黑猩猩和志愿者免疫均無保護作用。純化的yi多糖可產(chǎn)生較滿意的抗體應(yīng)答，但在黑猩猩中結(jié)果混亂，可能是由于莢膜多糖在靈長類動物中免疫原性貧乏和多次注射產(chǎn)生抑制作用。文獻8提供了化學(xué)誘變突變株的傷寒沙門菌Ty21a疫苗，它是Germanier于1975年用化學(xué)誘變劑亞硝基胍誘變及紫外線照射誘導(dǎo)非定點突變得到的。Ty21a，在口服傷寒活菌苗的制備中發(fā)揮了開拓性作用。Ty21a具有g(shù)alE突變，不能合成Vi莢膜抗原。galE編碼UDP半乳糖-4-異構(gòu)酶，缺失后不能完成UDP半乳糖與UDP葡萄糖的互換，而半乳糖殘基是野生型傷寒桿菌光滑型LPSO抗原的重要成分，Ty21a在無半乳糖條件下為粗糙型，無免疫原性。Ty21a株是一種很有用的典型活菌苗，但它免疫后僅提供中等程度的保護作用，且接種者對菌苗配方及攝入劑量過于敏感。且全菌種抗原存在多個抗原決定簇容易發(fā)生交叉反應(yīng)。另外，Ty21a也是報道用作外源基因表達的很好載體，在誘導(dǎo)傷寒沙門菌的同時，產(chǎn)生針對外源病原刺激的部分保護，如幽門螺桿菌、產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌、人乳頭瘤病毒16型等?；谝陨显?，迫切需要研制一種更加高效、遺傳背景更明確的沙門菌減毒疫苗。
上述專利和論文均有關(guān)于沙門菌治療和預(yù)防的方案，但存在盡可用于治療，或雖然可以有效預(yù)防，但誘發(fā)免疫應(yīng)答效果不明顯或者存在交叉反應(yīng)等缺陷。另外目前關(guān)于沙門菌菌毛抗原的疫苗尚無文獻記載。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種方法簡單、收率高、純度高的抗沙門氏菌口服疫苗的制備工藝。
為了達到上述目的，本發(fā)明一種抗沙門氏菌口服疫苗的制備工藝，包括如下步驟
Step I、構(gòu)建表達沙門菌SEF14和SEF21菌毛抗原的大腸桿菌，具體分步如下
Step 11、分別將含有SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列的DNA片段與pET20b (+)載體連接，然后分別對連接的片段進行擴增，此時原核表達載體pET20b(+)-SEF14以及pET20b(+)-SEF21兩種質(zhì)粒分別構(gòu)建成功；
Step 12、分別將兩種所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)表達菌株中；
Step 13、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)1-2小時后，收集菌體，超聲波打碎、離心獲得包涵體后，利用鎳柱子層析純化；
Step 14、分別利用純化的原核表達SEF14、SEF21蛋白制備兔抗SEF14、SEF21多克隆抗體；[0030]Step 2、制備脂質(zhì)體包裹的SEF14和SEF21抗原，具體分步如下
Step 21、將二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、膽固醇按I : I : 2的比例充分混合；
Step 22、將混合的脂類干燥，制成脂質(zhì)體混合物；
Step 23、將所述混合物與所述SEF14、SEF21多克隆抗體按照質(zhì)量比為2-3:1: I的比例充分混合；
Step 24、在1600rpm強度下進行脂質(zhì)膜渦旋式分散，獲得的脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21 口服疫苗。
其中，上述St印I之前，獲得所述含有SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列DNA片段的步驟為Step 01、根據(jù) GenBank accession number L03833. 142-573 提供的 SEF14 菌毛抗原基因序列，設(shè)計引物如下
上游引物5’-GGAATTC CATATG GCTGGCTT TGTTGGTAA-3’
下游引物5，-CCGCTCGAG GTTTTGATACTGCTGAACG-3，
根據(jù)GenBank accession number S76043.提供的SEF21菌毛抗原基因序列，設(shè)計引物如下
上游引物5，-GGAATTCCATATG ATGAAACATAA ATTAATGA-3’
下游引物5’-CCG CTCGAG TTATTCGTATTTCATGATAAAGGTG-3’
Step 02、以含有SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列為模板，分別經(jīng)PCR擴增出SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列的DNA片段。
此外，Step 22優(yōu)選步驟為將混合的脂類在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上進行干燥20_30分鐘，然后再置于高真空干燥器上干燥，制成脂質(zhì)體混合物。而在St印24之后，以1000-1500rpm離心，棄去離心后的上層液，將沒有被脂質(zhì)體包裹的菌毛抗原去除。
為了獲取疫苗的制備情況，本發(fā)明還提供了上述制備工藝最終檢測SEF14和SEF21 口服疫苗的方法為首先利用異丙醇溶解脂質(zhì)體，用PBS稀釋，采用渦旋混合器充分攪拌混勻，而后利用蛋白質(zhì)檢測試劑盒測定脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21的量。
而在具體制備過程中，尤其步驟Step 11之后，需要檢測兩種質(zhì)粒構(gòu)建是否成功，方法為在所述連接的片段擴增后，分別利用Nde I酶和Xho I酶對所述SEF14、SEF21連接的片段進行雙酶切。此時，如果結(jié)果顯示457bp的SEF14和3716bp的pET20b (+)片段，則說明原核表達載體pET20b(+)-SEF14構(gòu)建成功；如果結(jié)果顯示568bp的SEF21和3716bp的pET20b (+)片段，則說明原核表達載體pET20b (+) -SEF21構(gòu)建成功。
本發(fā)明的有益效果是①通過原核表達技術(shù)制備沙門菌SEF14和SEF21菌毛抗原蛋白，大大提高了沙門菌抗原的純度，并使生產(chǎn)制備工藝穩(wěn)定、簡單、可控。②采用脂質(zhì)體包裹技術(shù)將SEF14和SEF21菌毛抗原包裹起來，有效地提高了抗原蛋白的穩(wěn)定性，可有效抵抗酸性環(huán)境及機體酶系統(tǒng)的破壞作用，使生產(chǎn)的SEF14和SEF21菌毛蛋白抗原可以通過口服方式給藥，方便給藥。③完全減毒，高免疫原性。對環(huán)境不造成污染。本發(fā)明在預(yù)防和治療沙門菌感染研究開發(fā)上具有非常重要的意義。④制備工藝簡單，收率高，純度高。

[0047]圖I是重組腸炎沙門氏菌菌毛SEF14抗原基因片段PCR瓊脂糖電泳圖；其中，泳道I 為 DNA marker ;泳道 2 為 SEF14 基因(457bp)PCR 結(jié)果。
圖2是目的基因SEF14表達載體pET20b(+)_SEF14酶切鑒定圖；其中，泳道I為DNA marker ;泳道2為pET20b (+) -SEF14表達載體酶切結(jié)果。
圖3是原核表達SEF14純化SDS-PAGE電泳圖；其中，泳道I為蛋白marker ;泳道2為純化后SEF14重組蛋白。
圖4是Western blot法檢測SEF14菌毛抗原在大腸桿菌中的表達；其中，泳道I為從腸炎沙門氏菌分離的SEF14 ;泳道2為純化的原核表達SEF14
圖5是重組腸炎沙門氏菌菌毛SEF21抗原基因片段PCR瓊脂糖電泳圖；其中，泳道I 為 DNA marker ;泳道 2 為 SEF21 基因(568bp)PCR 結(jié)果。
圖6是目的基因SEF21表達載體pET20b (+)-SEF21酶切鑒定圖；其中，泳道I為DNA marker ;泳道2為pET20b (+) -SEF14表達載體酶切結(jié)果。
圖7是原核表達SEF21純化SDS-PAGE電泳圖；其中，泳道I為蛋白marker ;泳道2為純化后SEF21重組蛋白。
圖8是Western blot法檢測SEF21菌毛抗原在大腸桿菌中的表達；泳道I為從腸炎沙門氏菌分離的SEF21 ;泳道2為純化的原核表達SEF21。
圖9是SEF14 and SEF21菌毛抗原免疫后，血清中IgG和slgA免疫前后比較，以及腸粘膜中IgG和slgA免疫前后比較。
具體實施方式
本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明首先構(gòu)建表達沙門菌SEF14和SEF21菌毛抗原的大腸桿菌，使其表達SEF14和SEF21菌毛抗原，再通過蛋白純化技術(shù)將SEF14和SEF21菌毛抗原提取、純化。將二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、膽固醇按適當(dāng)?shù)谋壤芙庠谟袡C溶劑充分混合，制備成混合脂類。將混合的脂類在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上進行干燥，然后再放于高真空干燥器上進一步干燥，制成混合脂質(zhì)膜，在混合脂質(zhì)膜內(nèi)加入一定量的SEF14和SEF21抗原，充分混合，接著在一定的強度下進行脂質(zhì)膜渦旋式分散，獲得大小均一的脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21 口服疫苗。通過離心，將沒有被脂質(zhì)體包裹的菌毛抗原去除，制備出脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21的抗原。
具體方法步驟如下
(I)構(gòu)建表達SEF14菌毛抗原重組表達菌株及SEF14菌毛抗原的表達，構(gòu)建SEF14抗原基因原核表達載體并進行表達。
根據(jù)GenBank accession number L03833. 142-573 提供的 SEF14 菌毛抗原基因序列，設(shè)計引物
上游引物5’-GGAATTC CATATG GCTGGCTT TGTTGGTAA-3J 30bp
下游引物5’-CCG CTCGAG GTTTTGATACTGCTGAACG-3’ 28bp
其中上游引物中5’端含有Nde I酶切位點、保護堿基以及SEF145’端部分氨基酸編碼基因序列；下游引物中5’端含有Xho I酶切位點、保護堿基以及SEF143’端部分氨基酸編碼基因的互補序列。
含有SEF14菌毛抗原基因序列為模板，經(jīng)PCR分別擴增出SEF14 (457bp)的DNA片段(圖I所示，M處指示了 SEF14的PCR擴增產(chǎn)物)。將所得DNA片段與pET20b(+) (3716bp)載體連接，然后對該目的片段進行擴增，然后利用Nde I和Xho I對擴增產(chǎn)物進行雙酶切，結(jié)果顯示457bp的SEF14和3716bp的pET20b (+)片段，說明原核表達載體pET20b (+) -SEF14構(gòu)建成功(圖2所示，N指示出pET20b ;C指示出SEF14)。將構(gòu)建好的pET20b (+)-SEF14質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)表達菌株中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)lh_2h后，收集菌體，超聲波打碎、離心獲得包涵體，進一步利用鎳柱子層析純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示原核表達蛋白SEF14的純度為95%以上(圖3所示，D指示出SEF14)。利用純化的原核表達SEF14蛋白制備兔抗SEF14多克隆抗體。Western blot結(jié)果顯示，原核表達SEF14和腸炎沙門氏菌SEF14均與兔抗SEF14多克隆抗體結(jié)合，證明原核表達SEF14與沙門氏菌SEF14的抗原性為一致(圖4所示，E指示出從腸炎沙門氏菌分離的SEF14疋指示出純化的原核表達SEF14)。
(2)表達SEF21菌毛抗原重組表達菌株的構(gòu)建及SEF21菌毛抗原表達
根據(jù)GenBank accession number S76043.提供的SEF21菌毛抗原基因序列，設(shè)計 引物，
上游引物5’-GGAATTC CATATG ATGAAACATAA ATTAATGA-3，32bp
下游引物5，-CCGCTCGAG TTATTCGTATTTCATGATAAAGGTG-3’ 34bp
其中上游引物中5’端含有Nde I酶切位點、保護堿基以及SEF215’端部分氨基酸編碼基因序列；下游引物中5’端含有Xho I酶切位點、保護堿基以及SEF213’端部分氨基酸編碼基因的互補序列。
以含SEF21菌毛抗原基因為模板，經(jīng)PCR擴增出SEF21 (568bp)的DNA片段(圖5所示，G指示出SEF21)。將所得DNA片段與pET20b (+)載體連接，然后對目的片段進行擴增，再利用Nde I和Xho I對該目的片段進行雙酶切，結(jié)果顯示568bp的SEF21和3716bp的pET20b(+)片段，說明原核表達載體pET20b(+)-SEF21構(gòu)建成功(圖6所示，H指示出pET20b，I指示出SEF21)。pET20b (+)-SEF21質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21 (DE 3)表達菌株中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)lh，2h后，收集菌體，超聲波打碎、離心獲得包涵體，進一步利用鎳柱子層析純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示原核表達蛋白SEF21的純度為95%以上(圖7所示，J指示出SEF21)。利用純化的原核表達SEF21蛋白制備兔抗SEF21多克隆抗體。Western blot結(jié)果顯示，原核表達SEF21和腸炎沙門氏菌SEF21均與兔抗SEF21多克隆抗體結(jié)合，證明原核表達SEF21與沙門氏菌SEF21的抗原性為一致(圖8所示，K指示出從腸炎沙門氏菌分離的SEF21 ；L指示出純化的原核表達SEF21)。
(3)脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21 口服疫苗制備
將二棕櫚磷脂酰酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、膽固醇按一定比例(如1:1: 2)充分混合在一個錐形燒瓶。將混合的脂類在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上進行干燥20-30分鐘，然后再置于高真空干燥器上進一步干燥，制成脂質(zhì)體混合物，將脂質(zhì)體混合物與SEF14和SEF21菌毛抗原按照質(zhì)量比為2-3 I I的比例在混懸振蕩器中進行充分混合，接著在1600rpm強度下進行脂質(zhì)膜渦旋式分散，獲得大小均一的脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21 口服疫苗，然后1000-1500rpm離心,棄去離心后的上層液,將沒有被脂質(zhì)體包裹的菌毛抗原去除。然后再利用異丙醇溶解脂質(zhì)體，用PBS稀釋，采用渦旋混合器充分攪拌混勻，最后利用蛋白質(zhì)檢測試劑盒測定脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21的量。
(4)脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21 口服疫苗保護實驗-刺激機體抗體生成增多[0073]將脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21 口服疫苗配置成200 μ g/100 μ I的濃度，每只雞采取接種100 μ I進行接種，選取8周齡以上的雞進行免疫，2周后加強免疫一次。免疫2周后，收集外周血和腸粘膜液，進行ELISA實驗，測定血清和腸黏膜中IgG和slgA含量。實驗結(jié)果用均數(shù)土準差表示，**表示與未免疫組比較P < O. 01，結(jié)果見圖9。
由圖9中A側(cè)可見，實驗雞口服脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21疫苗2周后，血清中IgG和slgA水平明顯高于未免疫組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.01)，說明口服SEF14和SEF21疫苗后，可以提高實驗動物血清中抗SEF14和SEF21的IgG和slgA抗體水平，有效提高機體抵抗沙門菌感染能力。
由圖9中B側(cè)可見，實驗雞口服脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21疫苗2周后，腸粘膜中IgG和slgA水平明顯高于未免疫組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.01)，說明口服SEF14和SEF21疫苗后，可以提高實驗動物腸粘膜中抗SEF14和SEF21的IgG和slgA抗體水平，有效提高機體抵抗沙門菌感染能力。(5)脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21 口服疫苗保護實驗-接種疫苗后，實驗動物獲得了對腸炎沙門氏菌的抵抗。
將8周齡雞分別放在各自的隔離室內(nèi)避免雞之間的物理接觸。免疫雞群及非免疫對照雞群分別口服I X 107個菌落形成單位(CFU)的腸炎沙門氏菌。感染后隔一天收集新鮮的糞便樣本，最后在無菌條件下進行解剖，取出內(nèi)臟器官和小腸、盲腸和直腸。將所有的樣本在無菌PBS進行稱重,連續(xù)稀釋100倍,接種在mannitol lysine crystal violetbrilliant green瓊脂平板板上，培養(yǎng)24小時。細菌計數(shù)時查帶黑色的腸炎沙門氏菌菌落。腸炎沙門氏菌亞型是利用09特定菌群抗血清試劑盒通過凝集實驗進行鑒定。
疫苗保護實驗表明，免疫接種后的雞群在接收腸炎沙門氏菌攻擊后與不接種的比較雞相比，腸道內(nèi)細菌增殖受到明顯抑制(約94.2% )、腸炎沙門氏菌在內(nèi)臟器官、生殖器官和腸道中的定居數(shù)量大大減少了，從而垂直傳播和蛋殼污染也顯然減少了。PCR檢測結(jié)果也顯示，與未免疫雞群相比，雖然腸炎沙門氏菌的主要感染器官-盲腸中的腸炎沙門氏菌沒有完全清除，免疫雞群的腸道內(nèi)定殖的細菌數(shù)明顯下降。由于使用的抗原是菌體表面抗原，與弱毒菌苗，病原基因缺損菌苗相比，此安全性更高?？傊|(zhì)體包裹SEF14和SEF21口服疫苗既安全又有效，對減少腸炎沙門氏菌污染具有重大的意義。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式
，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種抗沙門氏菌口服疫苗的制備工藝，其特征在于，包括如下步驟 51、構(gòu)建表達沙門菌SEF14和SEF21菌毛抗原的大腸桿菌，具體分步如下 511、分別將含有SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列的DNA片段與pET20b(+)載體連接，然后分別對連接的片段進行擴增，此時原核表達載體pET20b(+)-SEF14以及pET20b(+)-SEF21兩種質(zhì)粒分別構(gòu)建成功； 512、分別將兩種所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)表達菌株中； 513、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)1-2小時后，收集菌體，超聲波打碎、離心獲得包涵體后，利用鎳柱子層析純化； 514、分別利用純化的原核表達SEF14、SEF21蛋白制備兔抗SEF14、SEF21多克隆抗體； 52、制備脂質(zhì)體包裹的SEF14和SEF21抗原，具體分步如下 521、將二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、膽固醇按I: I : 2的比例充分混合； 522、將混合的脂類干燥，制成脂質(zhì)體混合物； 523、將所述混合物與所述SEF14、SEF21按照質(zhì)量比2-3 I I的比例充分混合； 524、在1600rpm強度下進行脂質(zhì)膜渦旋式分散，獲得的脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21口服疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I所述抗沙門氏菌口服疫苗的制備工藝，其特征在于，步驟SI之前，獲得所述含有SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列DNA片段的步驟為 501、根據(jù)GenBank accession number L03833. 142-573 提供的 SEF14 菌毛抗原基因序列，設(shè)計引物如下 上游引物5’ -GGAATTC CATATG GCTGGCTT TGTTGGTAA-3’ 下游引物5’ -CCG CTCGAG GTTTTGATACTGCTGAACG-3’ 根據(jù)GenBank accession number S76043.提供的SEF21菌毛抗原基因序列，設(shè)計引物如下 上游引物5’ -GGAATTC CATATG ATGAAACATAA ATTAATGA-3’ 下游引物5’ -CCG CTCGAG TTATTCGTATTTCATGATAAAGGTG-3’ 502、以含有SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列為模板，分別經(jīng)PCR擴增出SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列的DNA片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求
I或2所述抗沙門氏菌口服疫苗的制備工藝，其特征在于，步驟S22具體步驟為將混合的脂類在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上進行干燥20-30分鐘，然后再置于高真空干燥器上干燥，制成脂質(zhì)體混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述抗沙門氏菌口服疫苗的制備工藝，其特征在于，在步驟S24之后，1000-1500rpm離心，棄去離心后的上層液，將沒有被脂質(zhì)體包裹的菌毛抗原去除。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述抗沙門氏菌口服疫苗的制備工藝，其特征在于，最終檢測所述SEF14和SEF21 口服疫苗的方法為首先利用異丙醇溶解脂質(zhì)體，用PBS稀釋，采用渦旋混合器充分攪拌混勻，而后利用蛋白質(zhì)檢測試劑盒測定脂質(zhì)體包裹SEF14和SEF21的量。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述抗沙門氏菌口服疫苗的制備工藝，其特征在于，步驟SII檢測所述兩種質(zhì)粒構(gòu)建是否成功的方法為在所述連接的片段擴增后，分別利用Nde I酶和Xho I酶對所述SEF14、SEF21連接的片段進行雙酶切；結(jié)果顯示457bp的SEF14和3716bp的pET20b (+)片段，說明原核表達載體pET20b (+) -SEF14 構(gòu)建成功； 結(jié)果顯示568bp的SEF21和3716bp的pET20b (+)片段，說明原核表達載體pET20b (+) -SEF21 構(gòu)建成功。、
專利摘要
一種抗沙門氏菌口服疫苗的制備工藝，首先構(gòu)建表達沙門菌SEF14和SEF21菌毛抗原的大腸桿菌，再通過蛋白純化技術(shù)將菌毛抗原提純。將二棕櫚酰磷脂酰膽堿，二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸和膽固醇溶解在有機溶劑充分混合。將混合的脂類干燥，在混合脂質(zhì)膜內(nèi)加入一定量的SEF14和SEF21抗原，充分混合，接著進行脂質(zhì)膜渦旋式分散，獲得口服疫苗。本發(fā)明大大提高了沙門菌抗原的純度，使生產(chǎn)制備工藝穩(wěn)定、簡單、可控，收率高，純度高，本發(fā)明可有效抵抗酸性環(huán)境及機體酶系統(tǒng)的破壞作用，使生產(chǎn)的SEF14和SEF21菌毛蛋白抗原可以通過口服方式給藥；而且，本發(fā)明完全減毒，高免疫原性，對環(huán)境不造成污染。
文檔編號C12Q1/68GKCN102727876SQ201110085359
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月6日
發(fā)明者劉慶平, 李文哲, 王惠國 申請人:大連大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan