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犬鉤蟲抗凝肽及其突變體在制備溶血栓藥物中的用途的制作方法

文檔序號:74709閱讀:498來源:國知局
專利名稱:犬鉤蟲抗凝肽及其突變體在制備溶血栓藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及犬鉤蟲抗凝肽及其突變體的一種新的藥理用途,尤其涉及犬鉤蟲抗凝肽及其突變體在制備溶血栓藥物中的用途,屬于犬鉤蟲抗凝肽及其突變體的藥理用途領(lǐng)域。
背景技術(shù)
血栓性疾病包括心肌梗死、腦栓死、肺血栓和周圍血管拴塞等,是嚴(yán)重危害人類健康和生命的疾病,其發(fā)病率、致殘率和死亡率都很高。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),世界每年死于血栓病人數(shù)約2600萬,中國每年新血管病死亡者占因病死亡總?cè)藬?shù)的40. 7%,其比例遠(yuǎn)高于癌癥,居各類死因之首(桂清.血栓疾病已成為威脅人類健康和生命的重要疾病.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2004,8 (27) :487)。溶栓被認(rèn)為是治療血栓性疾病的重要方法之一。

犬鉤蟲抗凝妝5 (Ancylostoma caninum anticoagulant peptide, AcAP5)是從食血成年鉤蟲,犬鉤口線蟲(Ancylostoma caninum)可溶性提取物中分離出來的一種肽類FXa抑制劑,由77個(gè)氨基酸組成,分子量8. 7KD,已獲得其重組產(chǎn)物rAcAP5。AcAP5是迄今為止報(bào)道的活性最強(qiáng)的多肽類FXa抑制劑,能夠抑制動(dòng)脈、靜脈血栓的形成(United StatesPatent5,427,937、6,534,629et al.)。在犬冠狀動(dòng)脈血栓模型中,僅皮下給藥一次就可維持藥效6小時(shí),與其它蛋白類F X a抑制劑相比,AcAP5的一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)就是給藥方便和作用持續(xù)時(shí)間長(Sam S. Rebello, Howard S. (2000)Thrombosis Research 98:531-540)。
公開號為CN101041690A、發(fā)明名稱為“重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體、其編碼基因、其制備和應(yīng)用”的中國發(fā)明專利公開了一種重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體(rAcAP5m),體內(nèi)和體外的試驗(yàn)表明,所述的重組多肽rAcAP5m與rAcAP5的抗血栓活性相當(dāng),有希望成為一類新型的治療血栓栓塞性疾病的藥物。
迄今為止,尚未有任何文獻(xiàn)報(bào)道犬鉤蟲抗凝肽5及其突變體具有溶血栓活性,可應(yīng)用于治療血栓性疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供犬鉤蟲抗凝肽及其突變體的一種新的藥理用途。
本發(fā)明的主要目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明通過大量的藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),犬鉤蟲抗凝肽5 (AcAP5)及其突變體(rAcAP5m)在體外或體內(nèi)均有優(yōu)秀的溶血栓活性,其活性呈劑量依賴性,可將它們制備成治療血栓性疾病的藥物。
具體的,本發(fā)明發(fā)現(xiàn)犬鉤蟲抗凝肽5(r AcAP5)及其突變體(rAcAP5m)具有抑制凝血酶活化的纖溶抑制物(TAFI)的活性,且均可濃度依賴地抑制TAFI的活性,IC5tl為
6.37Χ1(Γ8Μ-7· 23 X IO^8Mo
rAcAP5和其突變體rAcAP5m可明顯縮短纖溶時(shí)間,增強(qiáng)尿激酶的纖溶活性;rAcAP5及其突變體rAcAP5m可明顯促進(jìn)尿激酶的體外溶栓作用,它們單獨(dú)應(yīng)用也有明顯體外溶栓作用;rAcAP5及其突變體rAcAP5m具有劑量依賴的體內(nèi)溶栓作用。rAcAP5及其突變體rAcAP5m對正常大鼠的優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間、血漿纖維蛋白原含量和血漿纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物FDP都無影響,說明rAcAP5及其突變體rAcAP5m只有在血栓形成時(shí)發(fā)揮溶栓作用,并不激活機(jī)體正常的纖溶系統(tǒng),因此出血副作用可能較輕,表明犬鉤蟲抗凝肽5 (rAcAP5)及其突變體(rAcAP5m)的溶栓作用是源于它對凝血酶活化的纖溶抑制物(TAFI)的抑制作用。
其中,所述的“犬鉤蟲抗凝肽5”是從食血成年鉤蟲,犬鉤口線蟲(Ancylostomacaninum)可溶性提取物中分離出來的一種肽類FXa抑制劑,由77個(gè)氨基酸組成,分子量8. 7KD(Michael Cappello, John M. Hawdon, Brian F. Jones, ff. Poindexter Kennedyb,Peter J. Hotez. Ancylostoma caninum anticoagulant peptide cloning by PCR andexpression of soluble,active protein in E. coli. Molecular and BiochemicalParasitology 1996,80 :113-117.),其氨基酸序列為SEQ ID No. I所示;此外,本領(lǐng)域技術(shù)人員也可通過常規(guī)的DNA重組技術(shù)制備得到所述的重組犬鉤蟲抗凝肽5 ;本領(lǐng)域技術(shù)人員還可通過肽合成方法、化學(xué)修飾或傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法制備得到所述的犬鉤蟲抗凝肽5,這些方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
所述的“犬鉤蟲抗凝肽5突變體”的氨基酸序列為SEQ ID No. 3所示,編碼該氨基酸的核苷酸序列為SEQ ID No. 2所示。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過DNA重組技術(shù)制備得到所述的犬鉤蟲抗凝肽5突變體(rAcAP5m),具體制備方法可參考公開號為“CN101041690A”,發(fā)明名稱為“重組犬鉤蟲抗凝肽5突變體、其編碼基因、其制備和應(yīng)用”的中國發(fā)明專利。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可通過肽合成方法、化學(xué)修飾或傳統(tǒng)的化學(xué)合成的方法制備得到所述的犬鉤蟲抗凝肽5突變體,這些方法同樣是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
本發(fā)明所述的“血栓性疾病”包括急性心肌梗塞、中風(fēng)、外周動(dòng)脈塞阻、肺栓塞、深度靜脈血栓形成以及其它的有可能造成溶栓后再阻塞或再生血栓形成危險(xiǎn)的血管血栓性疾病。
將犬鉤蟲抗凝肽5 (AcAP5)及其突變體(rAcAP5m)用于治療血栓性疾病時(shí),其給藥劑量和給藥方式可參考現(xiàn)有的已應(yīng)用于臨床的溶血栓活性蛋白的給藥劑量和給藥方式,例如,鏈激酶、尿激酶、anistrepalse、重組纖維蛋白溶酶原激活劑等溶血栓劑。通常的,可將犬鉤蟲抗凝肽5 (AcAP5)或其突變體(rAcAP5m)制備成注射制劑,通過靜脈注射,單次或多次快速注射或靜脈注射;或?qū)⑷^蟲抗凝肽5 (AcAP5)或其突變體(rAcAP5m)制備成口服制劑如腸溶膠囊、結(jié)腸定位膠囊、微球、納米粒等。
此外,還可將編碼犬鉤蟲抗凝肽5 (AcAP5)或其突變體的核苷酸(例如SEQ IDNo. I)構(gòu)建成適合在人體內(nèi)表達(dá)的表達(dá)載體以制備成基因治療藥物,這些方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟練掌握。


圖lrAcAP5及其突變體5 (rAcAP5m)的體內(nèi)溶栓作用試驗(yàn)結(jié)果;(文士 sd,η = 8)。
具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明的制備方法及有益效果,應(yīng)該理解的是,這些實(shí)施例僅用于例證的目的,決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。[0018]實(shí)施例lrAcAP5及其突變體5對TAFI的抑制作用(in vitro)
I.實(shí)驗(yàn)方法
雄性家兔,體重2. 5-3kg,耳中動(dòng)脈取血,3. 8 %的枸櫞酸鈉抗凝,3000rpm離心lOmin,制備血漿。30 μ I血漿與不同濃度(見表I和表2)的rAcAp5或其突變體5在室溫下孵育10分鐘,依次加入凝血酶(10unit/ml)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(IOnM)、CaCl2(17mM),用Hepes緩沖液(ρΗ7· 4)將體積調(diào)整到60μ 1,室溫下反應(yīng)10分鐘。加入150 μ M的PPACK(Merck,Germany) 10 μ I終止活化。在活化后的反應(yīng)體系中加入20mM的Hippuryl-Arg (Sigma-Aldrich USA) 20 μ I,反應(yīng) 10 分鐘。力口入 20μ1 IM HCl 終止反應(yīng),再加入IM NaOH 20 μ I中和鹽酸。加入50 μ I O. 5Μ的磷酸鈉(ρΗ7. 4)和60 μ I含3%氰尿酰氯的1,4_ 二氧六環(huán)溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)。14000rpm離心5分鐘,取100 μ I上清液加至96孔板于酶標(biāo)儀405nm處讀吸光度值。由于血液中含有CPN,同樣能與底物反應(yīng),以不含凝血酶、血栓調(diào)節(jié)蛋白和CaCl2的反應(yīng)管為TAFI未激活的對照,該管中血漿TAFI未激活。
TAFI活性=總羧肽酶活性-CPN活性,rAcAP5及其突變體5對TAFI的抑制率通過1%= ([0D]con[0D]test)/([0D]con) X 100%計(jì)算·
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
rAcAP5及其突變體5能夠劑量依賴地抑制TAFI的激活(見表I和表2),提示rAcAP5及其突變體5為TAFI抑制劑。
表lrAcAP5對TAFI的抑制作用
權(quán)利要求
1.犬鉤蟲抗凝肽5在制備溶血栓性藥物中的用途。
2.按照權(quán)利要求
I所述的用途,其特征在于所述的犬鉤蟲抗凝肽5的氨基酸序列為SEQ ID No. I 所示。
3.SEQ ID No. 3所示的犬鉤蟲抗凝肽5突變體在制備溶血栓藥物中的用途。
4.編碼犬鉤蟲抗凝肽5的基因在制備溶血栓藥物中的用途。
5.編碼SEQID No. 3所示的犬鉤蟲抗凝肽5突變體的基因在制備溶血栓藥物中的用途。
6.按照權(quán)利要求
4或5所述的用途,其特征在于所述的藥物是基因治療藥物。
7.按照權(quán)利要求
5所述的用途,其特征在于所述的基因?yàn)镾EQID No. 2所示的核苷酸。
專利摘要
本發(fā)明公開了犬鉤蟲抗凝肽及其突變體在制備溶血栓藥物中的用途。本發(fā)明通過大量的藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),犬鉤蟲抗凝肽5(AcAP5)及其突變體(rAcAP5m)(SEQ ID No.3)在體外或體內(nèi)均有優(yōu)秀的溶血栓活性,其活性呈劑量依賴性。另外,rAcAP5及其突變體rAcAP5m只有在血栓形成時(shí)發(fā)揮溶血栓作用,而不激活機(jī)體正常的纖溶系統(tǒng),其可能具有的出血副作用較輕,另外rAcAP5及其突變體rAcAP5m也可增強(qiáng)尿激酶的溶栓作用,可將其制備成注射或口服制劑用于治療血栓性疾病。
文檔編號A61K38/17GKCN102178929 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201110106956
公開日2013年1月2日 申請日期2011年4月27日
發(fā)明者王銀葉, 丁雙, 劉曉巖, 朱元軍 申請人:北京大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (3),
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